基于網絡藥理學方法探討杞蓉片治療早發性卵巢功能不全的作用機制*

南楠，杜小利

1 寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750000； 2 寧夏區域高發病中西醫結合防治研究重點實驗室，寧夏 銀川 750000； 3 寧夏少數民族醫藥現代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750000

早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）指女性在40歲以前出現卵巢功能減退，主要表現為月經異常、FSH水平升高、雌激素波動性下降［1］，發病率1%～4%［2］。杞蓉片在臨床上廣泛用于治療月經病和不孕癥，但其治療POI的機制尚不清楚。本研究應用網絡藥理學分析方法，通過構建藥物與疾病的靶蛋白互作關系，探索杞蓉片對卵巢功能的影響，尋求杞蓉片治療卵巢功能不全的藥效理論基出，為臨床應用杞蓉片防治POI提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 杞蓉片活性成分及靶點的獲取 首先對杞蓉片中的9味中藥活性成分及作用靶點進行檢索。登錄中藥藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（http：//tcmspw.com）［3］，檢索關鍵詞：“鎖陽”“肉蓯蓉”“淫羊藿”“菟絲子”“枸杞子”“金櫻子”“女貞子”“北五味子”和“蛇床子”，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18，以此來篩選出符合條件的中藥活性成分，得到杞蓉片活性成分的ID和靶基因名稱等數據。對于未能從TCMSP檢索出的藥物，先通過中國知網、維普等平臺檢索其所有活性成分，再通過TCMSP查閱相關活性成分所對應的基因信息。對于未能檢索出“Mol ID”的活性成分，通過Pubchem數據庫確定所有篩選出來分子的三維結構，然后將Canonical Smile號輸入小分子藥物靶點預測在線平臺，獲得上述藥物的全部潛在靶點基因。運用Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org）及Perl（http：//www.perl.org/ger.html/）語言腳本進行蛋白基因的轉換，剔除非人源基因，刪除無效重復靶點，得到標準化的基因名。

1.2 POl疾病靶點的獲取 使用關鍵詞“premature ovarian insufficiency”在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）數據庫中進行檢索，得到POI相關的靶點，將5個數據庫所有靶點整合在Excle中，剔除重復基因，并經Uniprot數據庫進行校正，得到疾病靶點基因信息。

1.3 構建靶蛋白相互作用網絡 登錄Venn 2.1.0網站，在LIST1與LIST2中分別輸入藥物與疾病的靶點，平臺自動生成藥物與疾病的靶點，繪制出韋恩圖（Venn圖）。將獲得的杞蓉片與POI的共同靶點進行轉換后登錄STRING平臺（https：//string-db.org/），選擇“homo sapiens”，構建蛋白質相互作用網絡（protein-protein interactions，PPI）圖。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析 通過Bioconductor（http：//www.bio-conductor.org/）數據庫進行GO分析和KEGG通路富集分析，使用Cytoscape軟件，構建出“藥物-活性成分-靶點”網絡并分析其核心靶點，利用DAVID6.8 GO基因功能從生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三方面描述杞蓉片治療POI的作用靶蛋白在基因功能中的作用。選取GO功能條目前10條，KEGG通路條目與POI有關的20條通路（P＜0.01）作為杞蓉片治療POI的主要基因功能富集過程和信號通路，預測杞蓉片治療POI的作用機制。

2 結果

2.1 杞蓉片的主要活性成分及作用靶點 使用TCMSP數據庫分別檢索“鎖陽”“肉蓯蓉”“淫羊藿”“菟絲子”“枸杞子”“金櫻子”“女貞子”“北五味子”和“蛇床子”的活性成分，以藥動學參數OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，剔除無效成分后，篩選收集到有效成分肉蓯蓉6個、淫羊藿21個、菟絲子10個、枸杞子35個、金櫻子6個、女貞子8個、五味子7個、蛇床子18個，鎖陽經過文獻整理后通過Swiss Target Prediction，篩選條件為Probability＞0.1，獲得11個成分，其中共有成分10個。剔除重復后總共得到藥物102個有效成分。見表1。

表1 藥物活性成分

2.2 疾病靶點的篩選 合并GeneCards、OMIM、DrugBank數據庫分別獲得的4411、212、54個靶點，去重后共獲得4589個與POI相關的靶點，將得到的基因經UniProt數據庫校正。

2.3 韋恩圖的繪制 將獲得的藥物成分靶點與疾病靶點相互映射，然后作Venn圖，從而獲得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2軟件構建“藥物-成分-作用靶點”網絡。見圖1—2。

圖1 潛在共同靶點Venn圖

圖2 共同靶點蛋白互作PPI網絡圖

2.4 藥物-成分-靶點預測結果 利用藥物-成分-靶點數據，構建“network.xlsx”文件以及“type.xlsx”文件，將文件導入Cytoscape 3.8.2進行作圖。共有成分為黃色表示。見圖3。

2.5 蛋白相互作用網絡 使用Cytoscape 3.8.2軟件繪制蛋白相互作用網絡，對網絡進行拓撲分析，以Degree值反映靶點大小及顏色，以combined score值反映邊的粗細，從而構建蛋白-蛋白相互作用網絡。其中TP53、AKT1、STAT3、TNF、JUN、EGFR、MAPK3、IL-6、MAPK1、VEGFA為核心靶點。見圖4。

圖4 PPID網絡

2.6 GO基因生物過程 將243個交集靶點導入DAVID數據庫進行GO富集分析與KEGG通路注釋分析，以P-Value＜0.01為條件篩選后，我們共得到437個BP，53個CC和93個MF，得到藥物作用POI的作用機制可能與細胞凋亡過程、轉錄的正調控、基因表達的正向調控、信號轉導、藥物反應、炎癥反應、細胞增殖的積極調控等生物過程有關，同時與細胞質、質膜、核、核質、胞質溶膠、胞外間隙等細胞組分參與，涉及蛋白質結合、同蛋白結合、酶結合、鋅離子結合、DNA結合、蛋白質二聚化活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性等分子功能。見圖5。

圖5 GO分析圖

2.7 KEGG通路富集分析 利用DAVID數據庫進行通路富集分析，共富集到172條與復方杞蓉片治療POI相關的通路，根據P＜0.01篩選出復方杞蓉片與治療POI的通路145條，篩選出與POI相關的通路，分別是：PI3K-Akt、HIF-1、高級糖基化終末產物-受體（AGE-RAGE）、白細胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子（TNF）、C-型凝集素（C-type Lectins）、細胞凋亡、T細胞受體、Th17細胞分化、Toll樣受體（TLR）、Janus激酶（JAK）-信號轉導和轉錄激活因子（STAT）、表皮生長因子受體（EGFR）、酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等通路。見圖6。

圖6 KEGG富集分析圖

3 討論

隨著人們對生活質量和女性權益的重視，女性生殖健康越來越受到社會關注。POI屬于婦科常見病及疑難病，其病因復雜，有50%以上的患者病因不明［4］。卵巢功能的過早減退嚴重危害著女性的身心健康，常會引起神經及代謝功能失調［5-7］。根據臨床表現，中醫學將POI歸于月經不調、閉經、胎漏、血枯、經斷前后諸癥等范疇。腎為先天之本，藏精，主生殖。多數醫家認為，POI與腎精虧虛關系密切，在治療時多以補腎益精為主。杞蓉片由寧夏枸杞子、肉蓯蓉、鎖陽、淫羊藿、菟絲子、金櫻子、蛇床子、女貞子、五味子組成。

隨著卵泡的發育，顆粒細胞增殖，會降低卵巢內微環境中的氧分壓（PO2）［8］。PO2水平的降低使卵巢組織處于缺氧狀態，無法滿足卵巢組織或卵細胞的生理需求［9］。持續的缺氧會進一步觸發細胞的各種死亡［10-12］。在卵泡發育的過程中，卵巢顆粒細胞作為其營養和能量的來源，發揮著極其重要的作用，缺氧、氧化應激等會誘導卵泡自噬、凋亡和壞死等多種細胞死亡途徑，進而導致卵巢功能衰退［13］。調查顯示，原發性POI患者的氧化應激水平升高［14］、老年女性顆粒細胞中缺氧特異性基因表達上調［15］，說明缺氧是卵巢功能下降的主要機制之一。因此，改善卵母細胞的氧化應激狀態，增強卵母細胞的抗氧化能力是恢復POI患者卵巢功能的重要措施之一［16］。

本研究共篩選整理出杞蓉片102個藥物活性成分，與POI疾病的共同靶點243個。其中核心蛋白有TP53、MAPK、Akt、STAT3、TNF、EGFR、IL-6、VEGFA等，其中TP53是影響卵巢功能的重要因子之一［17］。研究顯示，化療藥物介導的卵巢顆粒細胞中的TP53基因表達明顯升高［18］。MAPK能夠誘導其下游效應因子P53的激活，從而促進TP53介導的細胞凋亡［19］。蛋白激酶（AKT1）磷酸化能夠提高POI模型小鼠的生育能力，因為它可以促進卵巢中次級卵泡的生長速度，增強卵巢分泌性激素的功能［20-22］。STAT3可以調節細胞的增殖、凋亡等，在多種疾病中已被證實［23］。TNF在卵巢中的表達隨著機體的衰老而增多［24］。TNF既可以誘導炎癥，促進細胞的凋亡與分化，又可促進細胞存活和增殖，其不同的效應應該與組織類型、含量、作用時間等有關［25］。研究發現，EGFR基因能夠調控細胞自噬和代謝［26］。ERBB2 mRNA在原始卵泡啟動的生長過程中呈現出陽性表達，在原始卵泡啟動生長中起重要的促進作用［27-28］。卵巢局部產生的IL-6可能是顆粒黃體細胞分化和激素分泌的卵巢內調節環節之一，以旁/自分泌的形式在局部調節卵巢功能［29］。血管內皮生長因子A（VEGFA）能夠改善卵巢內的血液供應狀態，進而修復受損的組織［30］。

由“藥物-活性成分-靶點網絡圖”可見，染料木素、槲皮素、芹菜素、β-谷固醇等化合物在杞蓉片治療POI中有重要意義。染料木素具有抗氧化、抗癌、抗炎作用及抗菌活性。研究表明，染料木素可延遲大鼠卵巢壽命的衰竭，維持卵細胞的功能和穩態［31］。槲皮素可通過調節體內谷胱甘肽的含量，氧化應激相關酶的活性及氧化應激信號傳導通路來發揮抗氧化活性［32］。芹菜素可通過抑制PI3K/Akt、激活MAPK等信號通路發揮預防腫瘤、抗菌、抗氧化等作用［33］。β-谷甾醇可通過PI3K/Akt信號通路促進人卵巢顆粒細胞增殖，抑制凋亡［34］。

KEGG通路富集分析結果顯示，杞蓉片治療POI主要涉及PI3K/Akt、HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF信號通路等。PI3K/Akt信號通路與細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及自噬等密切相關［35］。研究證實，缺氧狀態下PI3K/Akt信號通路會被激活，可能是細胞在缺氧條件下適應和存活的一種機制［36］。HIF-1是低氧環境中的核心因子［37］，缺氧條件下HIF-1的合成依賴于P13K/Akt通路。AGERAGE信號通路可激活下游一系列分子反應，從而誘導炎癥反應、氧化應激等的產生［38］。TNF與IL-17信號均為炎癥相關通路，能夠誘發和引起自身免疫性和炎癥類型的疾病，從而導致POI的形成［39］。

本研究基于網絡藥理學，初步探索了杞蓉片治療POI的潛在作用機制，其中研究結果涉及很多藥物的活性成分、藥物作用疾病的重要靶基因、疾病的靶基因、藥物作用的關鍵信號通路等，為今后的進一步相關研究提供依據和思路。