基于網絡藥理學與分子對接研究麻黃-桂枝藥對治療變應性鼻炎的作用機制*

劉卉，申琪

1 河南中醫藥大學，河南 鄭州 450000； 2 河南中醫大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是鼻黏膜的Ⅰ型變態反應性疾病，臨床特點為陣發性和反復發作的噴嚏、流清涕、鼻塞、鼻癢，又稱為過敏性鼻炎［1-3］。屬于中醫“鼻鼽”范疇。流行病學調查顯示2004—2005年我國11個城市AR的患病率為11.1%［4］，2011年18個城市的患病率為17.6%［5］。該病反復發作、遷延難愈，為哮喘、鼻竇炎、中耳炎等疾病的常見誘發因素，影響患者的身心健康及生活質量，加重其經濟負擔［6-7］。關于AR的發病機制，目前較為公認的是由IgE介導的Th2型炎癥反應［8］，西醫主要治療方法有回避過敏原、藥物治療、免疫治療和健康教育，藥物治療常用糖皮質激素、抗組胺藥、抗白三烯藥物等，免疫治療是當下有望根治AR的方法，但因其治療周期長、價格昂貴等原因尚未推廣［1-2］。中醫治療本病以辨證論治為指導思想，通過調節相關臟腑功能及調節體質達到緩解臨床癥狀、減少復發的目的，具有藥物不良反應小、有效緩解全身癥狀、遠期療效好的優勢，但是由于中藥方劑種類繁多、配伍復雜、作用機制尚不明確，藥理學研究難度較大，中醫藥治療本病的研究受到一定限制。

麻黃為麻黃屬草本狀灌木麻黃的干燥草質莖，性辛溫、微苦，歸肺、膀胱經，具有發汗解表、宣肺平喘、利水消腫的功效。桂枝屬植物肉桂的干燥嫩枝，性辛甘溫，入肺、心、膀胱經，具有發汗解肌、溫通經脈、助陽化氣、平沖降逆的功效。兩者合用具有抗炎、退熱、止痛、抗哮喘、免疫調節等作用［9-11］，常相須為用，為臨床經典藥對。長期臨床觀察及研究顯示，以麻黃-桂枝藥對合用的中藥方劑（如小青龍湯、麻黃湯等）治療變應性鼻炎具有良好的效果［12-14］。但是該病的發病及病理機制復雜，麻黃-桂枝藥對治療該病的藥理作用機制亦尚未完全明確。

網絡藥理學綜合生物信息學、藥理學等多學科理論，其系統分析的特點與中醫的整體觀念、辨證論治契合，是目前從多角度研究中藥方劑治療疾病的靶點、通路及機制的新方法［15-16］。因此，本研究采用網絡藥理學和分子對接的技術方法，構建藥物疾病的“成分-靶點-通路”網絡，探討麻黃-桂枝藥對治療AR的作用機制，為該藥對治療AR的藥理學研究及遣方用藥奠定基出。

1 資料與方法

1.1 麻黃-桂枝藥對的活性成分收集及靶點篩選 采用中藥系統藥理數據庫與分析平臺（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［17］分別對麻黃、桂枝的活性成分進行檢索，基于口服生物利用度（druglikeness，OB）≥30%及藥物相似性（oral bioavailability，OB）≥0.18［18］為條件篩選，同時根據已發表的文獻報道進行補充收集，得到麻黃-桂枝藥對的活性成分。采用TCMSP數據庫收集活性成分對應的蛋白靶點，使用Unitprot數據庫（https：//www.uniprot.org/），設定物種為人，將蛋白靶點轉化為對應的基因官方名稱，最終獲得麻黃-桂枝藥對的活性成分及作用靶點。

1.2 AR靶點篩選 在OMIM數據庫（在線人類孟德爾遺傳數據庫，https：//www.omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、DrugBank數據庫（https：//go.drugbank.com/）、TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）中鍵入“變應性鼻炎”的英文名“allergic rhinitis”進行檢索，整合并刪除重復項，最終獲得變應性鼻炎的靶點信息。

1.3 麻黃-桂枝藥對-AR共同靶點篩選 基于Excel 2019軟件取藥物作用靶點（“1.1”項得到）和疾病作用靶點（“1.2”項得到）的交集，得到麻黃-桂枝藥對治療AR的作用靶點，并利用微生信網站（Bioinformatics，http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制韋恩圖。

1.4 “麻黃-桂枝藥對-成分-靶點-AR”網絡構建 將麻黃-桂枝藥對活性成分、作用靶點（“1.1”項得到）以及交集靶點（“1.3”項得到）導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“麻黃-桂枝藥對-成分-靶點-AR”網絡，利用軟件工具分析計算網絡參數，包括連接度（degree）、緊密度（closeness centrality）、介度（betweenness centrality）等信息，根據參數信息識別網絡中起到主要作用的成分及靶點。

1.5 蛋白質相互作用（PPl）網絡構建及拓撲分析 將交集靶點（“1.3”項得到）導入STRING數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），設定物種為人，最低交互值選擇0.900，其余參數為默認參數，獲得靶點的PPI網絡及信息。將PPI信息導入Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網絡，并拓撲分析，根據連接度值（degree）調節網絡節點的大小和顏色，根據節點相互作用強度值（combined score）大小調節邊的粗細和顏色，根據連接度值降序排列設置度值大于平均度值14，實現PPI網絡可視化。

1.6 KEGG富集分析與GO富集分析 將交集靶點（“1.3”項得到）導入Metascape數據庫（https//www.metascape.org），設定物種為人，分別進行KEGG富集分析與GO富集分析，P＜0.01代表富集結果顯著。并利用微生信網站繪制KEGG富集氣泡圖和GO富集柱狀圖，實現可視化分析。

1.7 分子對接驗證 應用Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載靶點蛋白的晶體結構，保存為PDB格式；使用pymol去配體，用autodock 1.5.6去水加氫分配原子，計算電荷，保存為PDBQT格式；從TCMSP數據庫下載化合物的三維結構，保存為mol2格式；用chem3d軟件做mm2力場分析，最小能量化，保存為mol2格式；進行靶點蛋白與化合物的對接，使用discovery2016軟件進行數據可視化。

2 結果

2.1 麻黃-桂枝藥對活性成分及靶點篩選結果 通過TCMSP數據庫檢索麻黃和桂枝，以OB≥30%且DL≥0.18為條件篩選，并根據已發表文獻補充，得到活性成分麻黃23個、桂枝7個，刪除重復，最終篩選出麻黃-桂枝藥對活性成分為27個。其中活性成分包括雄黃醇、紫杉酚、柚皮苷、白細胞精蛋白、滑石粉等。見表1。

表1 麻黃-桂枝藥對活性成分信息

將27個活性成分分別上傳到TCMSP數據庫進行靶點預測，保留唯一值，并使用UnitProt數據庫規范靶點名稱，預測到麻黃-桂枝藥對的靶點為199個。

2.2 AR靶點篩選結果 通過OMIM數據庫篩選得到AR相關靶點為130個，通過GeneCards數據庫篩選得到AR相關靶點為1183個，通過DrugBank數據庫篩選得到AR相關靶點為94個，通過TTD數據庫篩選得到AR相關靶點為26個，匯總刪除重復項，最終得到AR的相關靶點為1282個。

2.3 麻黃-桂枝藥對-AR共同靶點的篩選結果 將藥物靶點（“2.1”項得到）和疾病靶點（“2.2”項得到）上傳Excel 2019軟件取交集，得到交集靶點109個，即為麻黃-桂枝藥對治療AR的作用靶點，并繪制韋恩圖。見圖1。

圖1 藥物靶點與疾病靶點的Venny分析圖

2.4 “麻黃-桂枝藥對-成分——靶點-AR”網絡構建結果 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“麻黃-桂枝藥對-成分-靶點-AR”網絡圖，見圖2。

圖2 麻黃-桂枝藥對-成分-靶點-AR網絡圖

該網絡圖包括227個節點、692條邊。圖中左右兩側淺綠色圓形圖標代表中藥麻黃、桂枝，紅色六邊形圖標代表中藥活性成分；圖上方粉色、淡黃色、紫色六邊形圖標代表中藥共有成分；圖下方黃色正方形圖標代表疾病變應性鼻炎；圖正中墨綠色菱形圖標代表靶點基因，直觀體現麻黃-桂枝藥對治療變應性鼻炎的多靶點、多成分特征。連接度（Degree）表示此節點連接的邊的數量，Degree值越大，該節點與其他節點的密集程度越高，表明該節點在此網絡中重要性越高；利用軟件工具分析計算Degree值，根據Degree值調節節點面積，即在圖2中，節點邊的數量越多，面積越小，Degree值越大。根據Degree值大小篩選出排名前10的關鍵活性成分，見表2；排名靠前的靶點有PTGS1、PTGS2、NCOA2、PGR等；疾病節點的Degree值為109。

表2 麻黃-桂枝藥對連接度排名前10的活性成分信息

2.5 PPl網絡構建與分析結果 將109個交集靶點（“2.3”項得到）導入STRING數據庫，最低交互值選擇0.900，獲取PPI網絡及信息，包括109個蛋白、395條作用關系。將PPI信息導入Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網絡圖并拓撲分析。見圖3。

圖3 藥物-疾病作用靶點PPI網絡圖

該PPI網絡圖包括連接度值大于平均度值14的靶點16個，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、轉錄因子p65（transcription factor p65，RMLA）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）、細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、白細胞介素8（interleukin-8，CXCL8）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等。其中每個節點的面積由小到大、顏色由冷到暖，代表連接度值由小到大；連線由細到粗、顏色由暖到冷，代表節點相互作用強度值由低到高，可見TNF、JUN、RELA、IL6、AKT1等連接度值與節點相互作用強度值最高，提示這些靶點在PPI網絡中發揮關鍵作用。

2.6 KEGG富集分析與GO富集分析結果 對109個交集靶點（“2.3”項得到）進行KEGG富集分析，結果以P＜0.01為條件篩選，得到324條通路結果。按照Count值（基因數）對通路結果降序排列，選取前20的通路繪制KEGG富集分析氣泡圖。見圖4。

圖4 KEGG富集分析氣泡圖

散點面積由小到大代表Count值由小到大，散點顏色由綠到紅代表顯著性由低到高。KEGG富集分析結果提示，麻黃-桂枝藥對治療AR的通路主要涉及癌癥的信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染等。

對109個交集靶點（“2.3”項得到）進行GO富集分析，包括生物過程（biological processes，BP）、細胞組分（cellular components，CC）、分子功能（molecular functions，MF），結果以P＜0.01為條件篩選，共得到富集結果生物過程1903條、細胞組分78條、分子功能162條。按照基因數分別對通路結果降序排列，分別選取前10的通路繪制GO富集分析柱狀圖。見圖5。

圖5 GO富集分析柱狀圖

生物過程主要涉及對脂多糖的反應、對細菌來源的分子的反應、對有毒物質的反應、回應氧化應激、對無機物的反應、細胞對脂質的反應、對細菌的反應、凋亡信號通路等過程；細胞組分主要涉及膜筏、膜微區、膜區、受體復合物、等離子膜蛋白復合物、突觸后、細胞質核周區、液泡、線粒體膜等部位；分子功能主要涉及細胞因子活性、細胞因子受體結合、受體配體活性、受體調節活性、輔因子結合、蛋白質同源二聚活性、轉錄因子結合、氧化還原酶活性、脂質結合等。

2.7 分子對接驗證結果 槲皮素和山柰酚是本藥對中靶點最多的活性成分，選擇其與關鍵靶點IL-6、AKT1進行分子對接驗證，前者為配體，后者為受體。配體和受體結合所需結合能越小，兩者越易結合且結合后結構越穩定。通常認為，結合能＜0，配體和受體可自行結合；結合能＜-5.0 kcal/mol，配體和受體結合力較好［19］。槲皮素、山柰酚和IL-6、AKT1配對的結合能結果顯示其均具有較好結合力。槲皮素與IL-6的D鏈222位的PRO、227位的SER形成傳統氫鍵；與D鏈225位的TRP、221位的ASP、229位的PHE、228位的SER、226位的ASN、V鏈57位的ARG、59位的TYR、104位CYS、101位的SER、102位的ILE、A鏈75位的GIN形成范德瓦爾斯力；與D鏈223位的HIS形成pi-pi Tshaped作用。槲皮素與AKT1的A鏈56位的SER、79位的GIN、78位的LEU、186位的ILE、59位的GLN形成傳統氫鍵；與A鏈57位的VAL、53位的ASN、58位的ALA形成范德華力；與A鏈60位的CYS形成π-烷基化作用；與A鏈77位的CYS形成π-sulfur作用。山柰酚與IL-6的D鏈223位的HIS、225位的TRP、v鏈101位的SER形成傳統氫鍵；與v鏈57位的ARG、D鏈228位的SER形成碳氫鍵；與V鏈102位的ILE、103位的ARG、105位的ALA、59位的TYR、52位的TYR、55位的SER、227位的SER、221位的ASP、226位的ASN形成范德瓦爾斯力；與D鏈222位的PRO形成unfavorable aceptor-aceptor；與v鏈104位的CYS形成pi-sulfur。山柰酚與AKT1的A鏈185位的VAL、104位的GLN、108位的ASP形成傳統氫鍵；與A鏈111位的LYS、78位的LEU、76位的ARG、83位的VAL、77位的CYS、61位的GLN形成范德瓦爾斯力；與A鏈59位的GLN、60位的CYS形成酰胺-π堆積；與A鏈186位的ILE形成π-烷基化作用。見表3、圖6。

圖6 分子對接結果

表3 分子對接結合能結果

3 討論

變應性鼻炎為鼻黏膜的Ⅰ型變態反應性疾病，發病機制目前較為公認的是IgE介導的Th2型炎癥反應，Th1和Th2細胞失衡，黏膜局部Th2細胞浸潤，Th2免疫活性及表達于Th2細胞的炎性因子（如IL-4、IL-5等）分泌增加，在IL-4作用下血清免疫球蛋白E（IgE）合成增加，進一步導致該病發生［20-21］。該病病理機制復雜，涉及多種生物過程、細胞通路，比如免疫反應、炎癥、組織重塑、神經調節等［1-2，8］。該病為本虛標實之證，外因為邪氣侵襲，內因為肺、脾、腎三臟虛損，病機尤以肺氣失調為核心［22］，證型以肺氣虛寒證最為多見［23］。中醫治療本病以辨證論治為指導思想，調節肺、脾、腎功能以緩解癥狀、減少復發，治療當首重肺氣，常用治法有溫肺散寒、益氣固表、益氣健脾、溫補腎陽等。麻黃-桂枝是溫肺解表代表藥對，合用治療該病療效顯著。已有多項研究從單藥或成方角度探討其藥理作用，有必要從藥對角度研究其藥理作用及配伍優勢。本研究應用網絡藥理學與分子對接的研究方法，篩選麻黃-桂枝活性成分及靶點，預測其治療AR的靶點，構建網絡，系統探討麻黃-桂枝藥對治療AR的機制。

分析麻黃-桂枝藥對的27個活性成分，結果顯示靶點數量前10依次是槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、柚皮苷、豆甾醇、滑石粉、兒茶素、芫花素、果膠苷。

槲皮素（quercetin）屬黃酮類化合物，以糖苷形式存在于植物和食品中，具有調節免疫、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降糖降壓等多重作用［24-26］。研究顯示，槲皮素可有效抑制Th2細胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、腫瘤壞死因子α和一氧化氮等的產生，降低IgE含量［27-28］，可一定程度抑制AR的免疫炎癥反應；此外，槲皮素可通過抑制TLR4/NF-κB通路抑制呼吸道炎癥［29］。β-谷甾醇（beta-sitosterol）是植物甾醇類成分，主要存在于植物油、堅果中，具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤、抑制中樞神經系統等多重作用［30-31］。研究顯示，β-谷甾醇可促進Th1細胞增殖，增加Th1細胞因子（干擾素-γ、IL-2等）分泌［32］，糾正AR發病過程中的Th1/Th2細胞失衡。山柰酚屬黃酮醇類化合物，可從豆科植物干燥成熟果實中提取，具有抗炎、抗腫瘤、保護損傷細胞等多重作用［33-34］。研究顯示，山柰酚可通過抑制肥大細胞中酪氨酸激酶（Lyn）的活性降低IgE的敏感度，并抑制嗜酸性粒細胞浸潤、血管舒張，降低機體對變應原的反應［35-36］。木犀草素屬黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏、降尿酸、神經保護等多重作用［37-38］。研究顯示，木犀草素通過減少pSTAT6和GATA3的表達來降低IL-4的分泌，減少嗜酸性粒細胞浸潤及鼻上皮黏液分泌，減輕鼻部過敏癥狀［39-40］。豆甾醇是植物甾醇類成分，存在于大豆、煙葉中，具有抗炎、抗氧化、改善記憶、降低膽固醇等多重作用［41-42］。研究顯示，豆甾醇可下調IL-1β、IL-6等細胞因子，但不會影響巨噬細胞的生存能力。還可下調IL-6，從而抑制Th2、Th17細胞活性，降低該病炎癥反應［43］。兒茶素屬酚類活性物質，從茶葉等天然植物中提取，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管等多重作用［44］。研究顯示，其有效地減少了T細胞和巨噬細胞在氣道基底層中的積累，降低過敏性氣道炎癥［45-46］。芫花素屬黃酮類化合物，存在于芫花之中，具有抗炎、保護心腦血管、保護神經、祛痰止咳等多重作用［47］。研究顯示，芫花素檔下調LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的轉錄［48］。

在PPI網絡圖分析過程中，按照連接度值、相互作用強度值將麻黃-桂枝藥對治療變應性鼻炎的109個作用靶點降序排列，排名靠前的有TNF、JUN、RMLA、IL-6、AKT1、MAPK1、MAPK3、TP53、CXCL8、EGFR等，藥物成分可能主要通過這些靶點起到關鍵治療作用。TNF有TNF-α和TNF-β兩種類型，已證明TNF-α是誘導和維持變應性鼻炎炎癥的重要介質，TNF-α通過TNF信號通路顯著上調前列腺素D2誘導的嗜酸性粒細胞趨化性和CRTH2的Eol-1細胞表面表達，并損傷嗅神經細胞［49-50］。IL-6具有調節免疫、獲得性免疫應答、促進細胞增殖分化等作用；已證實IL-6與AR發病關系密切［51］，在AR發病過程中，IL-6通過可溶性IL-6受體促進B細胞終末分化和漿細胞產生大量IgE［52］。AKT1屬于AKT家族，AKT可通過PI3K/Akt通路調節對暴露過敏原的反應和肥大細胞活性［53］。MAPK1、MAPK3屬于MAPK家族，MAPK激活IL-13誘導的鼻上皮細胞炎性因子表達，調控T細胞增殖分化［54-55］。研究發現，EGFR可上調嗜酸性粒細胞趨化聚集水平，同時促進氣道上皮細胞產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子構建過敏性氣道疾病［56］。

KEGG富集分析顯示，麻黃-桂枝藥對治療AR主要涉及的通路有PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路、癌癥信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路、人巨細胞病毒感染、MAPK信號通路等。已證實PI3K/Akt信號通路對AR免疫調節起到重要作用；IgE與肥大細胞表面受體結合是迅速出現變應性鼻炎癥狀的關鍵因素，PI3K/Akt信號通路可介導肥大細胞的成熟和激活、增強Ⅱ型固有淋巴細胞轉錄因子和Ⅱ型細胞因子的表達［57］。已證實TNF信號通路介導炎癥的發生，調節嗜酸性粒細胞趨化性、促進其聚集至鼻部，并促進黏附因子的表達及炎癥細胞活化浸潤［58］。已證實AGE/RAGE信號通路涉及激活蛋白激酶C、MAPK等多種通路，參與IL-1、IL-6、TNF-α等多種細胞因子的表達［59］。已證實IL-17信號通路誘導趨化因子和促炎因子來介導炎癥，并參與先天免疫增強變態反應性炎癥［60］；在AR發病過程中，IL-17信號通路誘導Th2細胞活化、IgE產生及嗜酸性粒細胞聚集浸潤［61-62］。已證實MAPK信號通路參與變應鼻炎的激活、炎癥細胞的增殖分化及Th2炎癥因子（如IL-4、IL-5）的產生［63］。GO富集分析顯示，麻黃-桂枝藥對治療AR主要涉及的生物過程有對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對有毒物質的反應、回應氧化應激、對無機物的反應、細胞對脂質的反應、對細菌的反應、凋亡信號通路等；主要通過影響細胞因子活性、細胞因子受體結合、輔因子結合、蛋白質同源二聚活性、轉錄因子結合、氧化還原酶活性、脂質結合等來治療AR。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學的技術方法，分析麻黃-桂枝藥對治療變應性鼻炎的活性成分、靶點及通路，并用分子對接技術初步驗證了成分和靶點具有良好的結合性，闡明了麻黃-桂枝藥對治療變應性鼻炎多成分、多靶點、多通路的作用機制，為深入研究其藥理學作用提供方向、奠定基出。但是由于數據庫對藥物、疾病的靶點及通路收集有限，本研究尚有一定局限性，麻黃-桂枝藥對治療變應性鼻炎的作用機制有待基出或臨床試驗的進一步研究和驗證。