市售酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒對(duì)多種農(nóng)藥的敏感性研究

用市售酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒進(jìn)行農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、出結(jié)果快、對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平要求低等優(yōu)點(diǎn)，在日常農(nóng)藥殘留監(jiān)管中應(yīng)用廣泛。酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)，是基于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)動(dòng)物體內(nèi)膽堿酯酶抑制作用的原理。市售酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒基礎(chǔ)試劑包括酶、顯色劑、底物和緩沖鹽，核心試劑是酶。因商品化酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒中酶的來源不同，不同產(chǎn)品酶的活性不同，酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性也不同。同時(shí)酶的制備、分離和純化方法使酶純度有差異，不同來源的酶對(duì)反應(yīng)體系的pH、溫度等外部條件要求不同，在試劑盒組裝時(shí)是否加入保護(hù)劑對(duì)酶進(jìn)行保護(hù)，酶對(duì)底物和顯色劑具有一定選擇性等因素，導(dǎo)致商品化的酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒對(duì)農(nóng)藥的敏感性存在較大差別，甚至產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性檢測(cè)結(jié)果。在酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)中比較酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性差異是評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量好壞的重要因素之一，也是解決檢測(cè)中出現(xiàn)問題的關(guān)鍵。因此，特安排本試驗(yàn)開展市售酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒測(cè)定酶對(duì)多種農(nóng)藥殘留的敏感性研究。

一、試驗(yàn)材料與方法

（一）試驗(yàn)儀器

農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)儀（CL-BIII型，16通道），雙重恒溫水浴振蕩器（SHA-C型），漩渦混合器（WH-861型），電熱恒溫水浴鍋（HH.W21-Cr420型），Thermo200μL和Rongtai5 mL移液槍。

（二）試劑和藥劑

試劑盒（恒度品牌），試驗(yàn)用水為純凈水。試驗(yàn)前將緩沖鹽用500 mL純凈水溶解，酶和顯色劑使用3 mL緩沖溶液配制，底物用3 mL純凈水配制。

農(nóng)藥選擇喹硫磷、敵敵畏、毒死蜱、對(duì)硫磷、伏殺硫磷、敵百蟲、殺撲磷、氧化樂果、三唑磷、馬拉硫磷、蠅毒磷、久效磷、丙溴磷、甲胺磷、二嗪磷、地蟲磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷、甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥（Organophosphorus Pesticides，以下簡(jiǎn)稱OP）和涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威砜、涕滅威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥（Carbamate Pesticides，以下簡(jiǎn)稱CP）。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品來源于農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，濃度為1000 mg·L-1，先稀釋成80μg·mL-1的儲(chǔ)備液，試驗(yàn)時(shí)按照需要進(jìn)行吸取。

（三）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每種農(nóng)藥分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度。制備方法：取適量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于一次性燒杯中，按照2 g稱樣量，使農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、3 mg·kg-1，每個(gè)濃度水平3次重復(fù)。

（四）測(cè)試方法

對(duì)照液和農(nóng)藥測(cè)試對(duì)照液和農(nóng)藥的測(cè)試方法參照國(guó)標(biāo)進(jìn)行；因?yàn)閲?guó)標(biāo)和行標(biāo)測(cè)試時(shí)樣品提取液的取用體積分別為2.5 mL和3 mL，因此本試驗(yàn)設(shè)定2種樣品提取體積：2.5 mL和3 mL。

取10 mL一次性試管若干，分別提取2.5 mL和3 mL的緩沖溶液和樣品提取液于其中，依次往其中加入100μL酶、100μL顯色劑，用漩渦混合器混勻，在37℃水中浴10 min，之后加入100μL底物搖勻，將對(duì)照液放入16通道的CL-BIII型農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)儀的第一通道比色池進(jìn)行檢測(cè)，通過儀器讀出3 min內(nèi)吸光度的變化。將處理后的農(nóng)藥樣品依次放入前述農(nóng)殘速測(cè)儀的其他通道比色池中進(jìn)行檢測(cè)，通過儀器直接讀出后面通道的抑制率并做記錄。儀器根據(jù)第一通道測(cè)定的對(duì)照3 min內(nèi)吸光度的變化值自動(dòng)計(jì)算得到抑制率。

（五）試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

選取幾種農(nóng)藥在不同濃度水平下3次測(cè)定所得抑制率的加權(quán)平均值在0～100%的濃度值，用Excel將抑制率和農(nóng)藥濃度常用對(duì)數(shù)的散點(diǎn)圖進(jìn)行線性擬合，得到濃度-效應(yīng)曲線方程、求出相關(guān)系數(shù)及每一種農(nóng)藥對(duì)各種試劑盒的半抑制濃度IC50。根據(jù)濃度-效應(yīng)曲線方程y=kx+b求得y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x軸的值，IC50=10x。線性范圍是抑制率為0的最大的濃度值到測(cè)定的最大的抑制率對(duì)應(yīng)的濃度值之間的范圍。同樣求出IC10。

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定蔬菜中氧化樂果、甲胺磷、敵百蟲的最大限量分別為0.02 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1。用試劑盒測(cè)定這3種農(nóng)藥的IC50的最大值分別為824 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、1.82×104 mg·kg-1，其對(duì)應(yīng)的IC10的值分別為0.610 mg·kg-1、0.200 mg·kg-1、7.35 mg·kg-1，均大于國(guó)家的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本試驗(yàn)將IC10設(shè)定為試劑盒的檢測(cè)限，以此比較不同的試劑盒對(duì)不同農(nóng)藥的敏感性。IC10越低，說明試劑盒對(duì)該農(nóng)藥越敏感。當(dāng)IC10≤10-3 mg·kg-1時(shí)，試劑盒對(duì)農(nóng)藥極敏感；當(dāng)10-3 mg·kg-1＜IC10≤10-1 mg·kg-1時(shí)，試劑盒對(duì)農(nóng)藥較敏感；當(dāng)10-1 mg·kg-1＜IC10＜1 mg·kg-1時(shí)，試劑盒對(duì)農(nóng)藥不太敏感；當(dāng)IC10 ≥1 mg·kg-1時(shí)，試劑盒對(duì)農(nóng)藥不敏感。

通過試劑盒測(cè)定結(jié)果比較2.5 mL和3 mL的樣品提取體積對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響和該試劑盒對(duì)不同的有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性。

二、結(jié)果與分析

經(jīng)過測(cè)定，無論樣品提取液取用3 mL還是2.5 mL，恒度試劑盒測(cè)定地蟲磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷時(shí)，抑制率同農(nóng)藥濃度之間不存在線性關(guān)系；測(cè)定甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷時(shí)，在所設(shè)定的幾個(gè)濃度水平下，抑制率均為0，說明試劑盒中酶對(duì)這幾種農(nóng)藥敏感性極低。其他農(nóng)藥分別按照其IC10進(jìn)行排序，詳見表1和下頁(yè)表2。

由表1可知，當(dāng)提取液取用3 mL時(shí)，恒度試劑盒對(duì)參試農(nóng)藥的敏感性按照喹硫磷、敵敵畏、涕滅威亞砜、毒死蜱、對(duì)硫磷、克百威、伏殺硫磷、敵百蟲、滅多威、殺撲磷、氧化樂果、三唑磷、涕滅威砜、馬拉硫磷、蠅毒磷、涕滅威、久效磷、丙溴磷、甲胺磷、二嗪磷、地蟲磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷、甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷等的順序依次降低。試劑盒對(duì)喹硫磷和敵敵畏農(nóng)藥極為敏感，其IC10均在10-3 mg·kg-1以下，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的7.14%；試劑盒對(duì)涕滅威亞砜、毒死蜱、對(duì)硫磷、克百威、伏殺硫磷、敵百蟲、滅多威、殺撲磷、氧化樂果、三唑磷等農(nóng)藥較為敏感，其IC10均在10-3～10-1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的35.7%；試劑盒對(duì)涕滅威砜、馬拉硫磷、蠅毒磷、涕滅威、久效磷、丙溴磷、甲胺磷、二嗪磷等農(nóng)藥不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的28.6%；試劑盒對(duì)甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷極不敏感，其IC10=1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的17.9%。

由下頁(yè)表2可知，當(dāng)提取液取用2.5 mL時(shí)，試劑盒對(duì)參試農(nóng)藥的敏感性按照敵敵畏、涕滅威亞砜、毒死蜱、敵百蟲、對(duì)硫磷、克百威、伏殺硫磷、二嗪磷、滅多威、殺撲磷、馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、涕滅威砜、涕滅威、蠅毒磷、丙溴磷、久效磷、甲胺磷、喹硫磷、地蟲磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷、甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷等的順序依次降低，其中試劑盒對(duì)敵敵畏的敏感性極強(qiáng)，其IC10均在10-3 mg·kg-1以下，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的3.57%；試劑盒對(duì)涕滅威亞砜、毒死蜱、敵百蟲、對(duì)硫磷、克百威、伏殺硫磷、二嗪磷、滅多威、殺撲磷等農(nóng)藥較為敏感，其IC10均在

10-3～10-1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的32.1%；試劑盒對(duì)馬拉硫磷、氧化樂果、三唑磷、涕滅威砜、涕滅威、蠅毒磷、丙溴磷、久效磷、甲胺磷等農(nóng)藥不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的32.1%；試劑盒對(duì)甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷等農(nóng)藥極不敏感，其IC10=1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的17.9%。

由表1（見上頁(yè)）和表2中的數(shù)據(jù)可知，對(duì)于喹硫磷時(shí)，樣品提取液取用3 mL和2.5 mL之間出現(xiàn)較大差異，取用3 mL時(shí)，抑制率同喹硫磷濃度對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)一定線性關(guān)系，線性系數(shù)為0.461 1 ，取用2.5 mL時(shí)，所測(cè)定數(shù)據(jù)較為凌亂，抑制率同喹硫磷濃度對(duì)數(shù)之間關(guān)系不規(guī)律，其原因有待于進(jìn)一步研究。

三、結(jié)論與討論

從IC10看，在所測(cè)試的參試農(nóng)藥中，恒度試劑盒對(duì)甲基異柳磷、樂果、水胺硫磷、倍硫磷、甲拌磷等幾種農(nóng)藥極不敏感，無論是取用3 mL樣品提取液還是取用2.5 mL樣品提取液，在設(shè)定的幾種農(nóng)藥濃度水平下，抑制率均為0。在用該試劑盒測(cè)定實(shí)際樣品時(shí)，當(dāng)樣品中含有這幾種農(nóng)藥中的任意一種或者幾種（在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的限量在3 mg·kg-1以下），用該試劑盒測(cè)定將出現(xiàn)假陰性；當(dāng)樣品中含有敵敵畏，其含量大于1.076×10-7 mg·kg-1、小于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的限量時(shí)，用該試劑盒測(cè)定將出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此試劑盒對(duì)各農(nóng)藥敏感性的巨大差異是導(dǎo)致試劑盒檢測(cè)樣品出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的原因之一。

如果樣品中含有二嗪磷時(shí)，樣品提取液無論取用3 mL還是2.5 mL，按照50%的判定閾值進(jìn)行判定，樣品中二嗪磷的含量應(yīng)該在16 000 mg·kg-1以上，這顯然不符合食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，也有悖于樣品檢測(cè)的初衷，因此建議國(guó)標(biāo)和行標(biāo)修改其判定閾值。

作者簡(jiǎn)介：?jiǎn)潭Y（1979—），女，河南開封人，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與品質(zhì)研究。

（責(zé)任編輯 " 程麗紅）