NGS自動化平臺在HLA基因分型的建立及應用

[摘要]"目的"建立基于二代測序（next-generation"sequencing，NGS）技術對人類白細胞抗原（human"leucocyte"antigen，HLA）基因進行分型的自動化操作平臺，并評估其在HLA常規檢測中的應用。方法"根據試劑盒操作說明編寫相應的計算機程序，利用Hamilton"Microlab"STARlet全自動液體處理工作站聯合96通道小型液體工作站、熒光化學發光分析儀等儀器，實現NGS技術對HLA基因分型過程中文庫制備步驟的自動化操作。結果"手工法和自動化平臺獲取的文庫片段兩者讀長基本一致，濃度及質量均符合要求，測序結果一致；而自動化平臺操作時間明顯少于手工操作。結論"建立的NGS自動化操作平臺檢測HLA基因分型方法可行，值得推廣使用。

[關鍵詞]"人類白細胞抗原；二代測序；自動化平臺

[中圖分類號]"R446""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.07.003

Establishment"and"application"of"automated"platform"for"NGS"experiment"in"HLA"genotyping

HE"Yizhen1，2，"WANG"Fang2，"DONG"Lina2，"CHEN"Chen2，"ZHANG"Wei2

1.School"of"Medical"Technology"and"Information"Engineering，"Zhejiang"Chinese"Medical"University，"Hangzhou"310053，"Zhejiang，"China;"2"Institute"of"Blood"Transfusion"Medicine，"Blood"Center"of"Zhejiang"Province，"Hangzhou"310052，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"establish"an"automated"platform"for"human"leucocyte"antigen"（HLA）"genotyping"using"next-generation"sequencing"（NGS）"technology，"and"evaluate"its"application"in"routine"HLA"genotyping."Methods"The"computer"programs"were"written"according"to"the"kit"operation"instructions，"and"Hamilton"Microlab"STARlet，"96"channel"liquid"workstation，"Fluoroskan"Ascent"and"other"instruments"were"used"to"accomplish"the"automatic"operation"of"library"preparation"in"the"process"of"HLA"genotyping"by"NGS"technology."Results"The"reads"length"and"sequencing"results"of"library"obtained"by"automated"platforms"were"consistent"with"the"library"obtained"by"manual，"and"the"concentration"and"quality"of"library"were"acceptable."The"operation"time"of"automatic"platform"was"obviously"less"than"manual"operation."Conclusion"The"automated"platform"for"HLA"genotyping"using"NGS"technology"is"feasible"and"worth"popularizing.

[Key"words]"Human"leucocyte"antigen;"Next-generation"sequencing;"Automated"platform

人類白細胞抗原（human"leucocyte"antigen，HLA）具有重要的生物學作用和臨床意義，HLA基因分型廣泛應用于HLA群體遺傳多態性研究、HLA生物學功能研究、實體器官和造血干細胞移植供受者組織相容性配型、與某些疾病的關聯、人類遺傳進化、藥物個性化選擇及造血干細胞捐獻者庫等方面，其中臨床最常見的應用范圍為器官和造血干細胞移植供受者組織相容性配型[1-2]。近年來二代測序（next-generation"sequencing，NGS）技術得到飛速發展，NGS技術因其經濟、快速、準確和高通量等優勢在HLA基因分型方面受到關注[3-4]。但NGS技術操作步驟復雜繁多，當進行大批量樣本檢測時費時費力，且增加出錯的概率。因此，本研究建立基于Hamilton"Microlab"STARlet儀器的自動化操作平臺，將HLA-NGS檢測技術中大部分手工操作由自動化操作平臺代替，簡化HLA-NGS檢測技術的實驗流程，節約檢測時間。

1""材料與方法

1.1""研究對象

188例造血干細胞捐獻者標本來源于中華骨髓庫浙江分庫，遵循知情同意后，本研究經浙江省血液中心倫理學委員會討論審議通過（倫理審批號：省血液中心2023年研第010號）。

1.2""儀器與試劑

MagNA"Pure"96全自動DNA抽提儀（瑞士Roche公司）；Ion"Torrent"S5二代測序儀（美國Thermo"Fisher"Scientific公司）；Ion"Chef模板制備操作系統（美國Thermo"Fisher"Scientific公司）；Microlab"STARlet全自動液體處理系統（瑞士Hamilton"Bonaduz"AG公司）；小型液體工作站（德國Analytik"Jena公司）；Fluoroskan"Ascent熒光化學發光分析儀（美國Thermo"Fisher"Scientific公司）。MagNA"Pure"96"DNA提取試劑盒（瑞士Roche公司，批號：44613700）；AllTypeTM"NGS測序試劑（美國Thermo"Fisher"Scientific公司，批號：013）；Agencourt"AMPure?"XP（美國BD公司，批號：13457400）；Genomic"DNA"ScreenTape（美國Agilent"Technologies公司，批號：0201855-202）。

1.3""DNA抽提

利用Roche公司基因組DNA提取試劑盒提取，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。每份DNA的濃度調整至15～30ng/μl，純度A260/A280為1.6～2.0。

1.4""Hamilton"Microlab"STARlet聯合多種儀器建立NGS自動化操作平臺

1.4.1""配置Hamilton"Microlab"STARlet全自動液體處理工作站""根據AllTypeTM"NGS試劑盒說明書的操作需求，配置Microlab"STARlet儀器，關鍵配置見表1。

1.4.2""編寫計算機程序""按照AllTypeTM"NGS試劑盒操作說明在Hamilton"Microlab"STARlet全自動液體處理工作站上編寫擴增產物純化程序、產物濃度均一化程序、片段長度選擇程序、最終純化程序和文庫混合程序以代替手工操作。

1.4.3""其余儀器配置""利用CyBioSELMA"96小型液體工作站進行DNA和產物轉移；利用Fluoroskan"Ascent熒光化學發光分析儀代替AllTypeTM"NGS試劑盒操作中Qubit方法對擴增純化后的產物進行濃度定量。

1.5""HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-"DQB1、HLA-DPB1基因的測序分型

采用Thermo"Fisher"Scientific的NX"TypeTM"NGS試劑，嚴格按照試劑盒說明書操作。利用自動化操作平臺完成文庫制備，模板制備由Ion"Chef模板制備操作系統完成，點樣后的芯片由Ion"Torrent"S5二代測序儀分析，HLA基因型由Type"Stream"Visual軟件指定。

2""結果

手工法和自動化平臺片段選擇長度基本一致，均在300～1000bp之間，見圖1。自動化平臺獲取的文庫濃度略低于手工操作，讀長基本一致，均符合要求，對測序結果無影響，見圖2。手工法和自動化平臺獲取的文庫測序的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1基因分型結果均一致。自動化平臺操作時間明顯短于手工操作，見表2。

3""討論

準確的HLA分型結果對提高造血干細胞移植成功率具有重要意義。目前HLA分型基本采用Sanger測序，該技術在分型判斷時存在較高比例的模棱兩可結果，存在潛在分型錯誤風險，需要尋找更加準確的分型方法。隨著HLA新等位基因的不斷發現，模棱兩可結果組合的種類和比例不斷上升，因此經典Sanger測序技術的局限性和不足等問題更加突顯。NGS技術的出現推動HLA測序從編碼區水平過渡到整個基因組水平，與Sanger測序方法相比，NGS技術具有極高通量和單分子DNA測序等特點。基于NGS技術可同時檢測HLA基因座2個不同等位基因的序列，分別得到特定單一等位基因的序列，"從而避免Sanger測序技術中HLA分型模棱兩可的結果；且NGS技術可測定HLA位點的整個基因組序列，更加有助于HLA的精準分型[3-5]。

隨著NGS-HLA分型方法的成熟和測序成本的降低，該方法已在國內外HLA分型實驗室中廣泛應用[6-7]。本實驗室也已將NGS技術作為HLA檢測的常規方法，解決一些模棱兩可的問題，并發現多個新等位基因[8-15]。然而NGS-HLA分型方法中文庫制備的手工操作步驟包括擴增產物純化、聚合酶鏈反應（polymerase"chain"reaction，PCR）產物定量及稀釋、接頭連接和末端修復、片段長度篩選、文庫混合等，其中擴增產物純化和片段長度篩選步驟是利用磁珠對PCR產物進行富集，包括磁珠孵育和2次75%酒精洗滌等多個步驟，操作煩瑣；AllTypeTM"NGS試劑盒說明書中PCR產物定量采用Qubit?"dsDNA高靈敏分析試劑盒在Qubit熒光儀上分析，只能手工單個樣本檢測，非常耗時；而濃度定量和文庫混合手工操作步驟不僅煩瑣且極易出錯，不利于大批量樣本操作。本實驗室研發的通過Hamilton"Microlab"STARlet全自動液體處理系統、96通道小型液體工作站、熒光化學發光分析儀等多臺儀器聯合的自動化操作平臺，可大大簡化手工操作步驟，避免手工操作導致的誤差，節約檢測時間。且與手工操作相比，對實驗結果無影響。另外，本實驗室建立的自動化平臺的核心儀器Hamilton"Microlab"STARlet液體處理系統可根據需要增減不同的配件，靈活多變，且可根據不同試劑盒和測序平臺的要求編寫相應的計算機程序，可適用于多種試劑盒和實驗操作，極大地方便NGS技術在大批量樣本檢測中的應用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–10–08）

（修回日期：2024–01–25）

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