鼠李糖乳桿菌對新生兒壞死性小腸結腸炎保護作用的研究進展

[摘要]"新生兒壞死性小腸結腸炎（necrotizing"enterocolitis"of"newborn，NEC）是導致新生兒死亡的主要疾病之一。研究認為，NEC與腸道菌群失調、腸上皮屏障功能改變、腸道炎癥、腸黏膜脂多糖激活Toll樣受體4等有關。目前，臨床對NEC尚無有效治療措施。益生菌在NEC的預防和治療中所發揮的作用得到人們越來越多的認可。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus"rhamnosus"GG，LGG）是當前研究較為廣泛的益生菌之一，其已被應用于多種胃腸道微生態失調相關疾病的預防和治療中。本文就LGG在NEC的預防和治療中的相關機制研究進展作一綜述，以期為其臨床應用提供理論支持。

[關鍵詞]"新生兒壞死性小腸結腸炎；鼠李糖乳桿菌；益生菌；Toll樣受體4

[中圖分類號]"R722.1""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.07.025

新生兒壞死性小腸結腸炎（necrotizing"enterocolitis"of"newborn，NEC）是一種新生兒特有的壞死性腸道炎癥疾病，由Mizrahi等[1]于1965年首次提出。NEC起病急、進展快、預后差，在早產兒中尤為多見，嚴重威脅新生兒的生命，是導致新生兒死亡的重要原因之一。NEC遠期可導致短腸綜合征、腸狹窄、生長和神經發育遲緩等[2]。胎齡越小、出生體質量越低的早產兒，NEC發病率越高。近年來，隨著救治技術的不斷進步，早產兒的病死率不斷下降，但NEC的發病率卻迅速升高。被懷疑或確診為NEC的患兒在進行積極的非手術治療后，如病情繼續進展惡化則需行外科治療，但外科手術指征難以把握，術后后遺癥較多，嚴重影響患兒及其家庭的生活質量。探尋預防和治療NEC的有效措施至關重要。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus"rhamnosus"GG，LGG）是一種革蘭陽性乳酸桿菌，具有耐胃酸、耐膽汁鹽、耐多種抗生素等生物學特點，是目前研究較為廣泛的益生菌之一[3]。LGG已在多種動物模型和臨床試驗中用于NEC的預防和治療。本文就LGG在NEC預防和治療相關機制的研究進展作一綜述，以期為其臨床應用提供理論支持。

1""LGG具有平衡腸道菌群的作用

研究表明腸道菌群的定植始于胎兒期[4]。足月兒出生后最初的腸道菌群包括需氧菌和兼性厭氧菌，出生后1周左右其以擬桿菌、雙歧桿菌等厭氧菌為主[5]。相比之下，早產兒腸道菌群的多樣性低于足月兒，以兼性厭氧菌為主。胎齡、分娩方式、喂養方式及環境因素等均可影響腸道菌群的分布[6]。NEC患兒和健康個體的生物多樣性和菌群構成比例存在差異。具體表現為NEC患兒的變形菌門豐度增加，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度減少，革蘭陰性兼性厭氧桿菌和潛在致病菌過多，而專性厭氧菌過少，腸道菌群在NEC的發生發展中起重要作用[7-9]。

LGG可通過增加有益菌群的相對豐度平衡腸道菌群。姜麗[10]應用LGG對極低出生體質量的早產兒進行為期30d的干預，結果顯示干預后的早產兒腸道菌群中乳桿菌屬占比明顯上升，鏈球菌屬占比明顯下降，NEC的發生率低于對照組，提示早產兒在出生后早期補充LGG可促進其腸道內乳桿菌屬的定植，抑制鏈球菌屬增殖，從而調節腸道菌群平衡。另有研究發現，NEC小鼠補充LGG"4d后腸道菌群α的豐度增加，具有與對照組不同的腸道菌群構成，提示LGG有助于重塑NEC小鼠腸道中的微生物群落，增加菌群多樣性，起到治療NEC的作用[11]。Chrzanowska-Liszewska等[12]給予早產兒添加LGG的配方奶，結果發現第7天和第21天早產兒糞便中乳酸菌數量及腸桿菌科陽性的糞便樣本數量顯著增加，提示LGG有利于早產兒腸道內有益菌的繁殖。

2""LGG具有維持腸上皮屏障的作用

腸上皮屏障是一種選擇性滲透屏障，由單層極化的上皮細胞及連接細胞間的緊密連接（tight"junction，TJ）、黏附連接（adherence"junction，AJ）和橋粒組成。目前認為，TJ是構成腸機械屏障的最重要結構，對腸黏膜通透性起決定性作用[13]。TJ被破壞，腸黏膜的通透性增加，引起腔內促炎分子滲透，激活黏膜免疫系統，導致持續的炎癥和組織損傷。早產兒的腸上皮屏障功能及其組成部分發育尚未成熟，多種致病因素可致其功能障礙，從而激活炎癥級聯反應引發NEC。

LGG可通過增加TJ蛋白的表達強化腸上皮屏障的功能。Patel等[14]研究發現LGG可加速腸屏障的成熟并誘導TJ蛋白Claudin"3表達，強化腸屏障功能，保留TJ的分子結構，從而預防NEC的發生。Li等[11]"觀察NEC小鼠模型發現，小鼠的腸道干細胞和腸屏障遭到破壞，TJ數量減少，腸道干細胞分化及Wnt/β-聯蛋白（β-catenin）信號通路受到抑制；LGG干預小鼠的腸道Wnt/β-catenin信號通路被激活，β-catenin表達增加，腸道干細胞分化增多，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素（interleukin，IL）-6水平降低，TJ數量增加，腸道通透性得以改善，腸屏障功能得以加強，NEC緩解。LGG還可通過增加腸黏蛋白的表達強化腸屏障功能。p40是LGG的衍生蛋白，其可激活腸上皮細胞中的表皮生長因子受體，促進腸上皮細胞增殖、分化及TJ形成，促進腸上皮細胞產生黏蛋白，上調腸上皮細胞中增殖誘導配體的表達，維持腸屏障功能，保護腸上皮細胞免受炎癥損傷[15]。Yan等[16]研究發現，LGG可通過p40激活蛋白激酶B信號通路，抑制細胞因子誘導的上皮細胞凋亡，顯著減輕腫瘤壞死因子誘導的腸上皮損傷，維持腸上皮的完整性。LGG菌株表面存在大量Spa-CBA菌毛，使其具有較強的黏附能力，有利于腸上皮細胞形成生物膜，加固受損的腸上皮屏障[17]。

3""LGG具有調節腸道免疫反應、抑制炎癥的作用

腸道免疫系統分為固有免疫和適應性免疫。與足月兒相比，早產兒的自然殺傷細胞數量明顯減少，加之其組織屏障薄弱等多種因素，早產兒的固有免疫功能低下[18]。正常情況下，足月兒出生后，其適應性免疫系統才逐漸發育完善，早產兒表現為免疫低下狀態。而由配方奶粉喂養的早產兒適應性免疫防御功能顯著降低，面臨更大的炎癥相關疾病風險，如NEC[19]。因此，減較炎癥反應、加強腸道免疫防御系統是預防NEC的主要策略之一。

3.1""增強腸道免疫力

LGG可通過加強巨噬細胞的功能、促進腸道中免疫球蛋白A的生成以增強腸道的免疫力。巨噬細胞是固有免疫系統的重要效應細胞，其通過釋放活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）等細胞毒性分子、分泌腫瘤壞死因子-α和IL-8等促炎細胞因子阻止病原體的入侵[20]。Miettinen等[21]研究發現，LGG可直接激活核因子κB（nuclear"factor-κB，NF-κB），間接刺激促炎細胞因子IL-6和α干擾素的表達，誘導人巨噬細胞中信號轉導及轉錄活化因子（signal"transducer"and"activator"of"transcription，STAT）1、STAT3和刺激基因因子3復合物的形成，從而增強巨噬細胞的功能。Rocha-Ramírez等[22]研究發現，LGG可通過合成促炎因子、參與信號級聯反應以激活巨噬細胞的體外炎癥反應，從而發揮免疫特性。此外，Wang等[23]研究表明，p40在小鼠腸上皮細胞中以表皮生長因子受體依賴方式上調增殖誘導配體的表達，促進B細胞中免疫球蛋白A的產生，刺激腸道非特異性免疫反應。另一項使用LGG溶液喂養低出生體質量早產兒的臨床試驗研究發現，在早產兒出生后的第1天即給予LGG口服溶液，其血清中自然殺傷細胞和CD4+T細胞數量顯著增加，早產兒的免疫功能增強，NEC的發生率較對照組降低[10]。

3.2""抑制腸道炎癥

LGG通過影響NF-κB信號通路發揮抗炎作用。Toll樣受體（toll-like"receptor，TLR）的激活可誘導下游信號級聯反應調節各種細胞因子的表達，激活下游NF-κB等信號通路[24]。Lopez等[25]用LGG預處理Caco-2細胞，結果發現由致病配體鞭毛蛋白刺激的Caco-2細胞中IL-8的產生顯著減少。LGG之所以能在鞭毛蛋白感染的Caco-2細胞模型中發揮抗炎作用，是因為LGG可通過NF-κB/NF-κB抑制蛋白IκB信號通路抑制NF-κB的核易位。TLR在黏膜免疫應答中起重要作用，可識別微生物相關分子模式，參與腸道炎癥的調節。而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為微生物相關分子模式之一，可通過TLR4在腸上皮細胞中引發炎癥，激活下游NF-κB信號通路。Gao等[26]對豬腸上皮細胞進行LGG預干預、后干預和聯合干預，結果表明在LPS刺激下，LGG可下調LPS誘導的促炎細胞因子表達，上調TLR2和TLR9信使RNA表達。

LGG還可通過激活炎癥信號觸發細胞因子的產生，維持宿主的腸道穩態。另外，LGG的部分結構成分也可通過影響NF-κB達到抗炎目的。LGG的組分（表層蛋白、DNA、胞外多糖等）對豬腸上皮細胞也具有免疫調節作用；胞外多糖在腸道中形成對抗先天免疫因子的保護性屏障，經LGG、表層蛋白或胞外多糖預處理可顯著緩解LPS誘導的炎癥細胞因子表達。Lin等[27]研究證實，給予未成熟小鼠LGG可通過誘導局部ROS的產生減少未成熟腸道的炎癥信號。先前有研究團隊在體外建立的未成熟腸上皮細胞模型中證實，ROS可通過調節NF-κB激活的關鍵酶Ubc12的氧化失活減少炎癥信號[28]。因此，LGG在體內外均能誘導未成熟腸上皮細胞產生ROS。

4""LGG具有抑制TLR4表達的作用

TLR是一類典型的信號傳導型模式識別受體，目前研究最廣泛的是LPS的受體TLR4，其在早產兒腸細胞中高表達。LPS是革蘭陰性菌外膜的一種糖脂成分，可激活腸內固有免疫受體TLR4[29]。LPS活化后可引起腸上皮細胞凋亡、腸黏膜修復受損、腸黏膜屏障破壞等一系列腸道黏膜炎癥反應。細菌通過腸黏膜易位后活化血管內皮細胞TLR4，引起腸微循環障礙、腸缺血和壞死，導致NEC的發生。而TLR4突變小鼠卻免受NEC的發展，表明LPS激活TLR4在NEC的發生發展中發揮重要作用[30]。

LGG通過誘導TLR的負調控因子發揮其抑制TLR4的作用。Cuna等[31]在NEC造模前用LGG預處理新生小鼠3d，發現小鼠腸道組織TLR4的表達信號減弱，炎癥因子表達降低，小鼠腸道凋亡細胞減少，其機制可能與LGG通過誘導TLR的負調控因子抵抗炎癥反應防止TLR4介導的腸道損傷有關。另外，LGG的DNA可激活TLR9抑制TLR4在腸道上皮內產生促炎信號，降低NEC的嚴重程度。TLR9是TLR4的同源受體，可識別細菌DNA。研究發現TLR9在介導益生菌對腸道黏膜的抗炎作用中至關重要[32]。LGG對腸道炎癥的保護作用并不是由其代謝物或腸道定植能力所決定的，而是由其自身DNA所介導的。LGG細胞壁的肽聚糖及其非甲基化的CpG序列激活TLR9抑制TLR4，從而實現其保護作用[33]。Gribar等[34]研究表明，細菌去甲基化CpG"DNA激活TLR9，可產生抑制TLR4的相關激酶，使TLR4表達受限并減少NEC時TLR4活化而導致的腸細胞凋亡和細菌易位定植。因此，TLR9被認為對NEC具有保護作用，同時也提示應用TLR9配體CpG-DNA治療NEC具有可能性。

5""小結與展望

本文對LGG預防及治療NEC的機制進行回顧總結。盡管大量體外實驗證實，LGG對NEC具有保護作用，但也有臨床試驗發現免疫力低下人群應用LGG后會引起菌血癥、敗血癥等不良反應。使用LGG的衍生蛋白p40或其純化DNA作為替代物，或許可產生同樣的治療效果。此外，臨床上LGG的使用劑量及療程仍需進一步確定，需要更多的臨床和實驗研究完善LGG的使用標準，進一步評估LGG的替代物治療NEC的可能性并確定相關的安全性參數，從而為臨床安全使用LGG預防及治療NEC提供更多循證醫學依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–03–13）

（修回日期：2024–02–17）