布魯氏菌病的診斷技術進展

摘要：隨著分子生物學、納米、化學發(fā)光免疫診斷等新技術的迅速發(fā)展，布魯氏菌病的實驗室檢測技術也有了更多種選擇，他們具有靈敏、特異、快速、直接定量、可自動化等多種優(yōu)勢，正逐步被廣泛使用，有些已經占據(jù)了布病實驗室診斷的重要位置，但傳統(tǒng)的診斷技術也不可就此丟棄，它是現(xiàn)代檢測技術的前提和基礎，依然在生產實踐的一線起著不可替代的重要作用。

關鍵詞：布魯氏菌病；檢測；技術進展

1 布魯氏菌病傳統(tǒng)的診斷技術

家畜布魯氏菌病傳統(tǒng)的診斷技術包括流行病學、臨床癥狀、病理變化、病原的分離鑒定以及實驗室里的虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、全乳環(huán)狀試驗、瓊脂擴散實驗、補體結合試驗、ELISA等血清學檢測技術以及適合現(xiàn)場操作的變態(tài)反應等。

1.1 流行病學特點

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人和多種動物共患的變態(tài)反應性傳染病，幾乎所有陸生動物和海洋里的哺乳動物都易感，陸生家畜中羊、牛、豬最易感，接觸性傳播，無明顯的季節(jié)性。布魯氏菌細胞內寄生，典型癥狀過后，細菌寄生胞內，藥物很難對它起到作用，至今尚無根治辦法，主要侵害生殖系統(tǒng)，母畜比公畜易感，成年畜比幼年畜易感。

1.2 臨床癥狀

多數(shù)動物隱性感染、排毒卻無明顯癥狀；典型癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流產、關節(jié)炎、乳房炎、睪丸炎等相關癥狀。

1.3 病理變化

子宮、胎盤炎性浸潤、化膿性壞死、睪丸炎、關節(jié)內膜炎，多器官特征性肉芽腫、胎兒敗血癥等病變。

1.4 病原分離鑒定

1）取典型病變組織。取典型病變組織抹片，柯氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)紅色球桿狀小桿菌，其他菌為藍色時可做出初步判斷。

2）實驗室準備。實驗室人員在做好個人防護的前提下，取典型未污染病料，在馬丁瓊脂（含10%馬血清）、肝浸液瓊脂等培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，通過其特異性單向血清A、M凝集試驗、生化試驗、分離物的特點、菌體粗糙程度等綜合判斷。

1.5 血清學試驗

1）虎紅凝集試驗（RBT）。虎紅平板凝集是目前在生產一線運用最廣的一種試驗，具有操作簡便、材料簡單、成本低、反應快、可定性也可定量等優(yōu)點。其原理是將布氏桿菌抗原滅活后，用虎紅染色，當遇到被檢血清中特異性抗體后發(fā)生凝集，形成肉眼可見的凝集顆粒。適合大面積初篩。但虎紅抗原主要與IgM發(fā)生凝集，對疾病后期產生的IgG檢出率低，另外，受到觀察者主觀判斷的差異、抗原質量差異、環(huán)境溫度等因素影響，容易出現(xiàn)漏檢和假陽性結果[1]。

2）試管凝集試驗（SAT）。其原理與虎紅凝集試驗相似，常用于虎紅凝集試驗的復檢，操作相對復雜，結果判斷受實驗環(huán)境光線等多種因素影響，同樣有一定的主觀性和差異性，對IgM的敏感性高于IgG，適合于布病的早期診斷。

3）全乳環(huán)狀試驗（MRT）。用于檢測乳汁中布病抗體，陽性乳汁會在抗原和乳汁的界面上形成白色沉淀環(huán)。操作簡單、靈敏度高，但對乳汁檢樣要求苛刻，也有非特異性結果，適用于布病的初篩。

4）補體結合試驗（CFT）。補體結合試驗是布病檢測的“金標準”，目前收錄在國標中。主要用于檢測布病感染后機體中后期產生的IgG，由于補體抗體產生的晚，在體內保持時間長，對于慢性病例診斷意義較大。但此方法試驗條件比較苛刻，所用試劑種類多、操作復雜、對試驗操作者的要求較高、結果判斷也有主觀性。此方法也不適于豬的診斷。

5）瓊擴試驗。此方法主要針對綿羊種布魯氏菌的檢測，用全乳環(huán)狀抗原檢測乳汁中的布病抗體，陽性乳與標準抗原兩孔間會形成肉眼可見的沉淀線。此方法操作簡單，適合大批量檢測，但需24～72 h判結果。

6）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。這種方法是將抗原或抗體吸附于聚苯乙烯反應板表面，再與被檢樣本中的抗體或抗原相結合，形成抗原抗體復合物，再加入酶標記的抗體（或抗原），加入底物后，底物被酶催化后形成有色產物，顏色的深淺與被檢物中抗原（或抗體）含量正相關，通過酶標儀檢測吸光度的值來計算被檢物的含量。這種方法具有敏感度高、操作簡單、易于自動化操作，適合大批量檢測，主要檢測IgG，效果與補體結合試驗相當，但也存在假陽性或假陰性的現(xiàn)象。布病的檢測常用I-ELISA和C-ELISA，此方法已納入布病檢測的國家標準[2]。

7）變態(tài)反應。用布魯氏菌水解素注射于被檢動物尾根皺褶處的皮內，在24 和48 h各觀察一次有無紅腫現(xiàn)象來判斷陰陽性的一種診斷方法，這種方法操作簡單，但等待結果時間較長，需要多次保定被檢動物，對于慢性病例檢出率較高。傳統(tǒng)的血清學方法有一個共同的缺點就是無法區(qū)別疫苗和野毒。

2 布魯氏菌病檢測的新技術

隨著分子生物學、納米和基因缺失技術的快速發(fā)展，近年來，對于布病的檢測又有了一些新的方法，比如PCR技術、熒光偏振技術、化學發(fā)光技術等。

2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR并不屬于新技術，但它在不斷發(fā)展和改進，日益親民化，目前在疫病檢測中逐步占據(jù)了主要位置，在實驗室診斷中被廣泛應用。他的基本原理是將檢材中特定的微量的DNA片段迅速呈幾何倍的擴增，利用特定的儀器設備進行檢測的技術。

PCR技術目前發(fā)展到了第三代。第一代是將核酸擴增后，采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產物進行分析，只能用于定性分析。目前，國標布病的PCR檢測中只收錄了此種方法。第二代是采用特定的儀器采集擴增產物熒光強度的熒光定量PCR技術，目前廣泛使用。第三代是以微滴化處理步驟為主要特征的數(shù)字PCR，是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它直接計數(shù)目標分子，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目。

1）AMOS-PCR屬于第一代PCR，對于家畜布病的檢測，AMOS-PCR可以對所檢布氏桿菌進行分型，它是根據(jù)IS711在各菌株中的插入位置不同和拷貝不同而進行鑒別分型的，可以鑒別牛種生物型1、2、4，羊種生物型1、2、3，豬種生物型1和綿羊附睪種。可以區(qū)分疫苗株和野毒株。

2）多重引物PCR或復合PCR是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段，可以鑒別除綿羊附睪種外的牛種、羊種、豬種、沙林鼠種、犬種布魯氏菌。

3）熒光定量PCR既可鑒別布魯氏菌屬，也可進行種型鑒定，適合布病的早期快速診斷。PCR技術具有敏感性高、特異性強、操作簡便快速、對起始材料質量要求低等特點。但PCR技術也不能完全克服假陰性和假陽性的現(xiàn)象，造成的原因比較復雜，比如：實驗室環(huán)境的問題，如：污染、氣溶膠等；樣品本身存在問題，如：樣品質量差、保存不當?shù)龋淮送猓瑢嶒灢僮鞯牟灰?guī)范、試劑的質量問題、數(shù)據(jù)分析中的誤差、擴增儀溫度不準確、反應液處理不好導致PCR抑制物進入反應體系等都可能導致實驗結果失真[3]。

2.2 熒光偏振試驗（FPA）

熒光偏振試驗是一種抗原/抗體相互作用的簡單技術，該試驗基于物理原理：在溶液中，在布魯氏菌屬的抗體的存在下，和抗原形成了大的熒光復合物。在陰性樣品中，抗原是未結合的狀態(tài)，與布魯氏菌屬陽性樣本相比，這些較小的抗原分子旋轉得更快，因此引起光的更大去極化。這種方法操作快速（幾分鐘出結果）、簡便，在實驗室和野外都可操作，相比凝集試驗SAT，其結果更客觀，特異性和敏感性與ELISA相似，但需要專業(yè)的熒光偏振儀器，成本較高，適合大規(guī)模布魯氏菌病的篩查和檢測，未來值得推廣。

2.3 bp26-iELISA

這是一種將基因缺失技術與傳統(tǒng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗相結合的方法。bp26蛋白具有良好的抗原性，其基因在布魯氏菌7個種21個生物型中幾乎完全一樣，是比較保守的序列，將純化的bp26蛋白包被ELISA板，建立檢測布魯氏菌病的間接ELISA方法，它比SAT方法更敏感。這種方法為以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的應用提供配套性血清學檢測奠定基礎，可區(qū)分基因缺失苗和野毒感染。

2.4 化學發(fā)光分析技術

化學發(fā)光免疫分析技術是將免疫反應和化學發(fā)光分析相結合，化學發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，當他回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā)射出光子（hM），免疫反應系統(tǒng)是將發(fā)光物質直接標記在抗原或抗體上，或酶作用于發(fā)光底物，利用發(fā)光信號測量儀測量光子強度。

盡管目前還沒有看到針對布魯氏菌病的化學發(fā)光免疫分析技術的報道，但此項技術已經運用于多種疾病的檢測，隨著科研工作者的不懈努力，這項技術很快就會運用到布魯氏菌病的檢測上來，尤其是微粒體發(fā)光免疫分析技術更具有推廣應用前景，它將納米級的磁微粒作為反應載體，可實現(xiàn)多項目同步檢測、全自動運行、結果定量、靈敏度高等特點，是一種劃時代的獸醫(yī)免疫學診斷技術。

3 結語

診斷一種疾病不僅要考慮實驗室結果，還要綜合考慮臨床癥狀、流行病學、病理變化等綜合因素。近年來隨著科學技術的飛速發(fā)展，布病的檢測技術更新得也很快。但不論是哪一種技術都有其優(yōu)缺點，它的應用要綜合考慮實際條件的限制。從技術角度來看，血清學診斷方法比較經濟和相對簡單，更適合進行大規(guī)模的篩查和診斷，特別是在流行地區(qū)。

參考文獻：

[1] 楊海榮，關平原，范偉興.AMOSPCR在布魯氏菌種型鑒定中應用的研究[J].中國動物檢疫，2007，24（10）：25-28.

[2] 田克恭，李明.動物疫病診斷技術-理論與應用[M].中國農業(yè)出版社，209-218.

[3] 加洛子哈.動物布魯氏菌病的診斷技術及防治措施[J].山東畜牧獸醫(yī)，2017，38（3）：29+33.