羔羊源鏈球菌分離鑒定與耐藥性試驗

摘要：為了鑒定引起山東省東明縣規模化養殖場中羔羊死亡的病原菌，本試驗2023年3月采集東省東明縣規模化養殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟、腎臟等病料組織，采用細菌培養、形態學觀察、生化試驗、PCR方法進行鏈球菌分離鑒定，對分離的病菌采用人工感染小鼠試驗和K-B藥敏紙片法分別檢測鏈球菌分離菌株的致病性和耐藥性。結果顯示：從山東省東明縣規模化養殖場中死亡羔羊的病料組織中分離得到1株鏈球菌，命名為 DMS1株，分離的DMS1株對小鼠具有較強的致病力，致死率為100%（5/5）； DMS1株對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星環丙沙星4種藥物高度敏感，對氨芐西林、多西環素、林可霉素中度敏感，對青霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考4種藥物耐藥。本研究為該地區規模化養殖場中羔羊鏈球菌病綜合防控及指導臨床用藥提供參考。

關鍵詞：羔羊；鏈球菌；分離鑒定；致病性；耐藥性試驗

鏈球菌（streptococcus suis，SS）為革蘭氏陽性球菌，該菌廣泛存在于自然界及養殖環境中，可以感染豬、牛、羊、鹿、雞、鴨、鵝等多種家畜和家禽及人，該菌引起多種動物和人的敗血癥、腦膜炎、關節炎、肺炎、乳腺炎、腹瀉、化膿及毒素引起的休克等一系列的疾病，同時可以引起人的發病，嚴重危害著動物和人的健康，是臨床中常見的人畜共患的病原菌之一[1-3]。羊的鏈球菌病是溶血性鏈球菌引起的山羊、綿羊一種急性熱性傳染病，多發于冬春寒冷季節（每年11月至次年4月），主要通過消化道、呼吸道等多種途徑感染，臨床中以出血性敗血癥、漿液纖維素性胸膜肺炎、化膿性肺炎為主要癥狀，該病可以感染不同階段的羊，其中對羔羊具有發病率迅速、致死率比較高、傳染性比較強的特點，嚴重威脅養羊業的健康發展[4-8]。

近年來，關于羔羊鏈球菌病的報道越來越多，鏈球菌可以感染不同階段的山羊和綿羊，其中對羔羊最易感，尤其10～30日齡羔羊易感，當羔羊感染鏈球菌后，主要表現為咳嗽、流漿液性鼻液、呼吸困難、肺炎，嚴重者可以出現敗血癥，個別出現急性死亡，其死亡率高達60%以上，給養羊業造成嚴重的經濟損失[9-10]。國內外相關研究表明，隨著臨床中抗菌藥物的不合理使用，鏈球菌的耐藥性呈現逐年增高的趨勢，耐藥性鏈球菌菌株不斷地出現，給臨床用藥造成一定困難，鏈球菌的耐藥性在養殖場中普遍存在，由于鏈球菌為人畜共患的病原菌，其鏈球菌的耐藥性可以在動物和人之間相互傳播，已成為公共衛生安全問題[11]。本試驗采集山東省東明縣規模化養殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病料組織，采用不同的方法進行鏈球菌分離鑒定，并檢測其致病性和耐藥性，以期為該地區規模化養殖場中羔羊鏈球菌病綜合防控及指導臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1病料來源

2023年3月采集山東省東明縣規模化養殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟、腎臟等病料組織，將采集的樣品進行無菌處理進行鏈球菌的分離鑒定。

1.2細菌分離與培養

將采集的規模化養殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病料組織樣品進行處理后，在無菌的條件下接種于7%綿羊脫纖血液培養基，在37 ℃恒溫條件下培養12～18 h后，挑取單個菌落接種于鏈球菌培養基進行鑒別培養，37 ℃培養12～18 h，進行革蘭氏染色鏡檢觀察其形態學。

1.3 生化試驗鑒定

將從死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病料組織樣品中分離得到的菌株，無菌的條件下，接種在營養肉湯中培養至對數期，調整菌液濃度為2個麥氏濁度，參照Ｒaid ID 32 STREP陽性菌鑒定試劑盒說明書，將2個麥氏濁度菌液，在無菌的條件接種于Ｒaid ID 32 STREP陽性菌鑒定紙質條中，在37 ℃恒溫條件下培養12～18 h后生化特性鑒定。

1.4 細菌PCR鑒定

按照參考文獻[7]的方法設計細菌16SrRNA 基因通用引物（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。 采用水煮沸提取分離菌株的基因組DNA，以提取的分離菌株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，將分離菌株的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢驗目的條帶。

1.5致病性試驗

按照參考文獻[8]報道的方法，將分離菌株DMS1株接種于營養肉湯中培養至對數期調整菌液濃度為106～7 cfu/mL，將10只小鼠分為2組，攻毒組5只，將DMS1株通過腹腔注射攻毒5只昆明系小鼠，攻毒的劑量為0.25 mL（106～7 cfu/mL），對照組5只小鼠給予等量的無菌生理鹽水。試驗期為7 d并觀察小鼠發病情況。

1.6藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2013年推薦的藥敏試驗法標準進行操作與結果判定。

2結果

2.1細菌分離培養

在死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病理組織分離的疑似鏈球菌的菌株，通過在7%綿羊脫纖血液培養基、鑒別鏈球菌（GBS）培養基的培養特性及鏡檢觀察其形態學結果，與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的鏈球菌的培養特性及鏡檢觀察其形態學基本一致。其分離菌株形態學結果見圖1。

2.2細菌生化試驗

分離菌株DMS1株通過Raid ID 32 STREP陽性菌鑒定試劑盒進行生化鑒定，結果顯示分離菌株DMS1株的生化特性與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的鏈球菌的生化特性一致，初步鑒定為鏈球菌。

2.3 細菌PCR鑒定

對初步鑒定為鏈球菌用PCR進行進一步鑒定。結果顯示，DMS1株均擴增出大約為1 500 bp的目條帶（圖2）。通過測序對比分離菌株與參考株（鏈球菌）的同源性在97.7%～98.9%之間，說明分離的DMS1株為鏈球菌。

2.4 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后2～3 d出現了精神沉郁、采食量減少、抽搐等不同的發病情況，個別攻毒的小鼠出現急性死亡，剖檢死亡的小白鼠后采集病料組織，分離得到鏈球菌，攻毒試驗結束對照組小鼠健康存活，攻毒組的小鼠死亡率為100%（5/5）。

2.5 藥敏試驗

分離菌株的耐性分析顯示：DMS1株對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星、環丙沙星4種藥物高度敏感，對氨芐西林、多西環素、林可霉素中度敏感，對青霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考4種藥物耐藥。

3 討論

相關研究表明，鏈球菌可以感染多種動物和人，是臨床中常見的人畜共患的條件性致病菌，可以通過多種途徑在不同動物與人之間傳播[12]。鏈球菌可以引起羊的急性病例，具有發病比較急、死亡率較迅速等特點，為臨床中畜禽常見的急性、敗血性的一類疾病[13]。近年來，關于羊鏈球菌病的報道越來越多，尤其對羔羊的危害較大。本試驗從山東省東明縣規模化養殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的病料組織中分離得1株鏈球菌，命名為DMS1株，致病性試驗結果表明，DMS1株對小鼠致死率為100%，說明DMS1株是引起羔羊死亡的主要的病原菌。臨床中羊鏈球菌病主要通過抗菌藥物進行防治[14]。通過藥敏試驗顯示，DMS1株對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星、環丙沙星4種藥物高度敏感，對其他的藥物產生不同的耐藥性。因此，在臨床中治療該病應該進行藥敏試驗，選擇敏感的藥物進行交替使用，同時應該配合環境的消毒，提高治療效果，同時注意環境的衛生，加強飼養管理，提高羔羊的免疫力。

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