氨基酸取代的苯基醚類截短側耳素衍生物的合成與抗菌活性研究

摘要：目的 設計合成截短側耳素衍生物，尋找廣譜、高效、安全的新化合物。方法 以天然產物截短側耳素為起始原料，合成3個氨基苯醚類截短側耳素衍生物和8個氨基酸取代的苯基醚類截短側耳素衍生物，并進行活性測試、初步成藥性評價以及分子對接研究。結果 設計合成了11個未見文獻報道的新型截短側耳素衍生物，其結構經核磁、ESI-MS和HRMS確證。大多數化合物對標準金黃色葡萄球菌和標準大腸埃希菌的抗菌活性均優于lefamulin，并且其細胞毒活性低（IC50gt;10 μmol/L），理化性質預測良好。分子對接結果表明，化合物側鏈連接的氨基苯醚與氨基酸能夠與結合空腔的核苷酸形成更多的氫鍵相互作用。結論 氨基苯酚以及氨基酸的修飾有助于提高截短側耳素類抗生素的抗菌活性和理化性質。

關鍵詞：截短側耳素；天然產物結構修飾；抗菌活性；分子對接；細胞毒活性

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Synthesis and antibacterial activity of amino acid substituted phenyl ether pleuromutilin derivatives

Xiang Jin1，2，3， Luo Xinyu3， Zhang Wenxuan3， Pan Weidong1， and Wu Song1，3

（1 School of Pharmaceutical Sciences/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550025; 2 Natural Products Research Center of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550014; 3 State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica， Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100050）

Abstract Objective The objective of this study was to design and synthesize pleuromutilin derivatives in order to discover new compounds that exhibit broad-spectrum antibacterial activity， high efficiency， and safety. Methods The starting material used for the synthesis of the pleuromutilin derivatives was the natural product pleuromutilin. Three aminophenyl ether pleuromutilin derivatives and eight amino acid substituted phenyl ether pleuromutilin derivatives were synthesized. Activity tests， preliminary druggability evaluations， and molecular docking studies were conducted. Results Eleven novel pleuromutilin derivatives were designed and synthesized. The structures of these derivatives were confirmed using NMR， ESI-MS， and HRMS. Most of the compounds exhibited better antibacterial activity against standard Staphylococcus aureus and standard Escherichia coli compared to lefamulin. Additionally， these compounds demonstrated low cytotoxic activity （IC50gt;10 μmol/L） and their physicochemical properties were accurately predicted. The results of the molecular docking studies indicated that the aminophenyl ether and amino acid modifications in the side chains of the compounds enabled the formation of more hydrogen bond interactions with the nucleotides in the binding cavity. Conclusion The modification of pleuromutilin antibiotics with aminophenols and amino acids was beneficial in improving their antibacterial activity and physicochemical properties.

Key words Pleuromutilin; Structure modification of natural products; Antibacterial activity; Molecular docking; Cytotoxic activity

自20世紀青霉素發現以來，多種具抗菌活性的微生物天然代謝產物被廣泛用于細菌感染的治療[1]。抗生素的出現拯救了數百萬人的生命，全世界每年使用的抗生素超過了10萬噸[2]。然而，隨著抗生素的大量使用，細菌耐藥性顯著增加，出現了多重耐藥性和“超級細菌”等問題，導致抗生素療效下降甚至喪失[3]。因此，越來越多的研究人員開始著眼于新型抗生素的開發以對抗細菌耐藥性持續發展的問題。其中，微生物天然代謝產物及其半合成衍生物依舊是新型抗生素研發的重要來源[4]。

截短側耳素（pleuromutilin）是一種來自擔子菌屬的三環二萜類天然產物，能夠有效抑制革蘭陽性菌和肺炎支原體等微生物[5-6]。自20世紀50年代以來，截短側耳素類抗生素在獸醫臨床的應用取得了可觀的效果，同時近年也在人醫臨床中取得了突破性進展。目前，已有4個截短側耳素半合成衍生物成功上市。泰妙菌素（tiamulin）和沃尼妙林（valnemulin）作為動物專用抗菌藥，主要用于豬痢疾和豬呼吸道病的治療[7-8]。瑞他妙林（retapamulin）是第一個人用截短側耳素類抗生素，但僅用于膿皰病的局部用藥治療[9-10]。來法莫林（lefamulin）是首個用于治療全身系統性感染的截短側耳素類人用藥，同時也是近20年FDA批準的第一個具有新作用機制的抗菌藥物[11]。

截短側耳素及其衍生物能夠同細菌核糖體50S亞基形成獨特的結合模式，通過抑制細菌蛋白質的合成來抑制細菌繁殖[12]。在已報道的核糖體50S亞基-截短側耳素衍生物共晶結構中，截短側耳素衍生物均與核糖體50S亞基肽酰轉移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）結合[12-14]，從PTC的A位點延伸至P位點。這種獨特的結合模式在抗生素中少有存在，降低了截短側耳素衍生物與其他抗生素發生交叉耐藥的可能[15]。

氨基酸作為一種重要的有機化合物，在生物體新陳代謝中具有許多功能。研究表明，氨基酸衍生物可以有助于化合物穩定性、效力、選擇性、滲透性的增強以及毒性的降低[16]。氯霉素的氨基酸衍生物與細菌核糖體的肽基轉移酶中心的結合力要強于氯霉素[17]。沃尼妙林通過其C14位氨基酸側鏈延伸與結合腔形成額外的相互作用，并且盡管其結構母核的結合位點發生了變化，但仍與靶點保持很強的結合作用[18]。此外，連接氨基酸與截短側耳素母核的“連接臂”也對化合物的活性和理化性質有一定影響。湯有志等[19]以2-氨基苯硫酚為“連接臂”合成了一系列截短側耳素衍生物，發現部分化合物較泰妙菌素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）具有更好的體內外抗菌活性。

本研究將“連接臂”氨基苯硫酚替換為氨基苯酚與截短側耳素側鏈相連，并以其為 “連接臂”連接極性和非極性氨基酸，得到結構新穎的氨基酸取代的苯基醚類截短側耳素衍生物，以期達到提高截短側耳素衍生物抗菌活性的目標。通過不同的保護策略、磺酰化和酰胺縮合反應制備合成了11個全新截短側耳素衍生物，并對目標化合物進行了抑菌活性測試、細胞毒活性測試、ADMET性質（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion and Toxicity）預測以及分子對接研究，以期發現抗菌活性好、細胞毒活性低和成藥性好的先導化合物。

1 材料

1.1 主要儀器

IKA-RCT型磁力攪拌器（IKA公司），N-1200B型旋轉蒸發儀（東京理化Eyela公司），Bruker ANV-500型超導核磁共振波譜儀（美國Bruker公司），H-Class-SQD型質譜儀（美國Waters公司），Shimadzu LC-6AD型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），PSL-1810型低溫反應儀器（東京理化Eyela公司），YRT-3型熔點儀（天大天發科技有限公司）。

1.2 主要試劑

二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、氯化銨、氯化鈉、碳酸鉀、無水硫酸鈉購自北京市通廣精細化工公司；2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、4-二甲氨基吡啶、氨基苯酚、對甲苯磺酰氯、鹽酸1，4～二氧六環購自北京伊諾凱科技有限公司；截短側耳素購自北京偶合科技有限公司；Lefamulin購自北京雅源生物科技有限公司。所用試劑均為市售C.P.級或者 A.R.級，未經進一步純化。

2 實驗方法

2.1 化合物合成路線

本研究主要對截短側耳素C14側鏈進行結構修飾。首先，利用截短側耳素（A，圖1）作為原料，使用磺酰氯對截短側耳素C22位醇羥基進行酯化，得到相應的磺酸酯中間體B。然后，以碳酸鉀為縛酸劑，中間體B與鄰/間/對氨基苯酚發生親核取代反應得到中間體C。在HATU縮合劑、三乙胺以及催化量DMAP作用下，中間體C與多種N-叔丁氧羰基-氨基酸（甘氨酸、D-丙氨酸、D-纈氨酸、L-鳥氨酸和L-精氨酸）進行酰胺縮合得到中間體D。最后，中間體D在適當條件下脫氨基保護基策略制備相應的目標產物E（表1），化合物的總合成路線及反應條件如圖1所示。

中間體B：22-O-對甲苯磺酰基截短側耳素。稱取10 g截短側耳素（26 mmol）溶于60 mL二氯甲烷中，加入5.5 g對甲苯磺酰氯（28.9 mmol）和7.3 mL三乙胺（98.8 mmol）。常溫攪拌12 h后，加入40 mL二氯甲烷稀釋反應液，使用50 mL飽和氯化鈉溶液洗滌反應液3次，合并水相并使用30 mL二氯甲烷反萃一次，合并有機相經無水硫酸鈉干燥、過濾、蒸干后通過柱層析純化（石油醚： 乙酸乙酯=2： 1），得到12 g中間體B，淡黃色固體，產率為85%。ESI-MS（m/z）： 533.69[M+H]+。1H-NMR （500 MHz， Chloroform-d） δ 7.85 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.39 （d， J=8.0 Hz， 2H）， 6.45 （dd， J=17.4， 11.0 Hz， 1H）， 5.81 （d， J=8.5 Hz， 1H）， 5.37 （d， J=11.0 Hz， 1H）， 5.23 （d， J=17.4 Hz， 1H）， 4.52 （s， 2H）， 3.38 （s， 1H）， 2.49 （s， 3H）， 2.35～2.17 （m， 3H）， 2.15～2.04 （m， 2H）， 1.79 （dq， J=14.9， 3.0 Hz， 1H）， 1.73-1.61 （m， 3H）， 1.45 （s， 3H）。

化合物C-1：22-O-（2-氨基）苯基截短側耳素。稱取2 g中間體B（3.8 mmol）溶于10 mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入533 mg 2-氨基苯酚（4.9 mmol）和1.6 g碳酸鉀（11.3 mmol）。常溫攪拌12 h后，加入15 mL飽和氯化銨水溶液淬滅反應液，分3次使用15 mL乙酸乙酯萃取水相，合并有機相經無水硫酸鈉干燥、過濾、蒸干后通過柱層析純化（石油醚： 乙酸乙酯=1： 1），得到1.4 g化合物C-1，淡黃色固體，產率為81%。m.p： 128.1～130.5 ℃. ESI-MS（m/z）： 470.23[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， Chloroform-d） δ 6.83 （m， 1H）， 6.75 （d， J=8.1 Hz， 1H）， 6.66 （m， 2H）， 6.48 （dd， J=17.3， 10.9 Hz， 1H）， 5.85 （d， J=8.5 Hz， 1H）， 5.34 （dd， J=10.9， 1.6 Hz， 1H）， 5.20 （dd， J=17.4， 1.6 Hz， 1H）， 4.54 （s， 2H）， 3.36 （d， J=6.5 Hz， 1H）， 2.35 （m， 1H）， 2.22 （m， 2H）， 2.07 （m， 1H）， 1.77 （m， 1H）， 1.69～1.62 （m， 2H）， 1.56 （m， 1H）， 1.47 （m， 1H）， 1.45 （s， 3H）， 1.38 （m， 1H）， 1.28 （d， J=15.9 Hz， 1H）， 1.16 （s， 3H）， 1.12 （m， 1H）， 0.88 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.73 （d， J=7.1 Hz， 3H）. 13C NMR （126 MHz， Chloroform-d） δ 217.1， 168.2， 145.9， 139.0， 136.5， 122.8， 118.8， 117.6， 116.1， 112.9， 74.7， 69.5， 67.0， 58.3， 45.6， 44.9， 44.1， 42.0， 36.8， 36.2， 34.6， 30.5， 26.9， 26.5， 25.0， 16.8， 14.9， 11.6. HRMS calcd for C28H39NO5[M+Na]+： 492.2720， found： 492.2726。

化合物C-2：22-O-（3-氨基）苯基截短側耳素。合成方法同化合物C-1類似，得到1.5 g化合物C-2，淡黃色固體，產率為85%。m.p： 188.2～190.1 ℃. ESI-MS（m/z）： 470.58[M+H]+. 1H NMR （400 MHz， Methanol-d4） δ 6.87 （t， J=8.1 Hz， 1H）， 6.28～6.14 （m， 2H）， 6.10 （dd， J=8.2， 2.5 Hz， 1H）， 5.71 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 5.10～5.01 （m， 2H）， 4.42 （d， J=3.3 Hz， 2H）， 3.38 （d， J=6.2 Hz， 1H）， 2.30～2.20 （m， 2H）， 2.19～2.12 （m， 1H）， 2.10～1.96 （m， 2H）， 1.72 （dd， J=14.5， 3.3 Hz， 1H）， 1.64～1.55 （m， 1H）， 1.55～1.45 （m， 2H）， 1.33 （s， 3H）， 1.28～1.23 （m， 2H）， 1.10～1.04 （m， 2H）， 1.03 （s， 3H）， 0.83 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.64 （d， J=6.5 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 170.0， 160.4， 150.2， 141.1， 130.8， 116.7， 110.2， 103.3， 75.5， 71.2， 66.8， 59.3， 46.8， 45.9， 45.3， 43.2， 38.1， 37.8， 35.3， 31.5， 28.2， 28.0， 25.8， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C28H39NO5[M+Na]+： 492.2720， found： 492.2727。

化合物：22-O-（4-氨基）苯基截短側耳素。合成方法同化合物C-1類似，得到1.3 g化合物C-3，淡黃色固體，產率為75%。m.p： 94.4～96.8 ℃. ESI-MS（m/z）： 470.76[M+H]+. 1H NMR （400 MHz， Methanol-d4） δ 6.73 （d， J=9.4 Hz， 2H）， 6.69 （d， J=9.4 Hz， 2H）， 6.30 （dd， J=17.5， 11.2 Hz， 1H）， 5.81 （d， J=8.5 Hz， 1H）， 5.17 （d， J=11.2 Hz， 1H）， 5.14 （d， J=17.5 Hz， 1H）， 4.52 （d， J=16.4 Hz， 1H）， 4.47 （d， J=16.4 Hz， 1H），" 3.48 （d， J=6.2 Hz， 1H）， 2.39～2.29 （m， 2H）， 2.29～2.20 （m， 1H）， 2.19～2.07 （m， 2H）， 1.81 （dd， J=14.6， 3.0 Hz， 1H）， 1.74～1.65 （m， 1H）， 1.65～1.52 （m， 2H）， 1.50～1.42 （m， 1H）， 1.42 （s， 3H）， 1.39～1.24 （m， 3H）， 1.14 （s， 3H）， 0.93 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.72 （d， J=6.6 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 170.2， 152.7， 142.4， 141.1， 118.1， 116.9， 75.5， 71.1， 67.8， 59.3， 46.8， 46.0， 45.3， 43.2， 38.1， 37.8， 35.3， 31.5， 28.2， 28.0， 25.8， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C28H39NO5[M+H]+： 470.2901， found： 470.2910。

中間體D-a1：22-O-（2-（（（叔丁氧羰基）氨基）乙酰氨基））苯基截短側耳素。稱取82 mg N -（叔丁氧羰基）-甘氨酸（0.47 mmol），211 mg HATU（0.55 mmol）溶于5 mL二氯甲烷中，室溫攪拌30 min，加入200 mg中間體C-1（0.43 mmol），89 μL三乙胺（0.64 mmol）。常溫攪拌2 h后，加入5 mL二氯甲烷稀釋反應液，使用5 mL飽和氯化鈉溶液洗滌反應液3次，合并水相并使用10 mL二氯甲烷反萃1次，合并有機相經無水硫酸鈉干燥后通過柱層析純化（石油醚： 乙酸乙酯=1： 1），得到231 mg中間體D-a1，淡黃色固體，產率為86%。ESI-MS（m/z）： 627.63[M+H]+。

化合物E-a1：22-O-（2-氨基乙酰氨基）苯基截短側耳素。將中間體D-1溶于2 mL二氯甲烷中，向上述溶液中滴加0.5 mL 4 mol/L的鹽酸1，4 –二氧六環，室溫攪拌2 h后，減壓旋蒸除去有機溶劑，使用反相柱層析（甲醇： 水=10： 1）純化，冷凍干燥后獲得130 mg米白色固體化合物E-1，產率為67%。m.p： 90.1～92.6 ℃. ESI-MS（m/z）： 527.50[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， Methanol-d4） δ 8.14 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 7.09 （t， J=7.8 Hz， 1H）， 7.00 （t， J=7.7 Hz， 1H）， 6.95 （d， J=8.2 Hz， 1H）， 6.29 （dd， J=17.9， 10.8 Hz， 1H）， 5.84 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 5.18～5.10 （m， 2H）， 4.78 （d， J=16.4 Hz， 1H）， 4.71 （d， J=16.9 Hz， 1H）， 3.96 （s， 2H）， 3.50 （d， J=6.1 Hz， 1H）， 2.38 （s， 1H）， 2.29 （m， 2H）， 2.21～2.10 （m， 2H）， 1.82 （d， J=14.6 Hz， 1H）， 1.71～1.61 （m， 2H）， 1.58～1.48 （m， 1H）， 1.44 （s， 3H）， 1.41～1.29 （m， 3H）， 1.19～1.16 （m， 1H）， 1.15 （s， 3H）， 0.94 （d， J=6.9 Hz， 3H）， 0.74 （d， J=6.8 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， methanol-d4） δ 219.5， 172.0， 169.7， 149.1， 141.1， 136.4， 128.9， 125.6， 122.9， 122.4， 116.6， 113.7， 75.4， 71.7， 67.7， 59.2， 46.8， 45.8， 45.3， 45.2， 43.2， 38.0， 37.8， 35.3， 31.5， 28.3， 28.0， 25.8， 16.9， 15.2， 11.8. HRMS calcd for C30H42N2O6[M+H]+： 527.3116， found： 527.3124。

中間體D-a2：22-O-（3-（（（叔丁氧羰基）氨基）乙酰氨基））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-a1類似，得到202 mg中間體D-a2，淡黃色固體，產率為75%。ESI-MS（m/z）： 627.40[M+H]+。化合物E-a2：22-O-（3-氨基乙酰氨基）苯基截短側耳素。合成方法同化合物E-a1類似，冷凍干燥后獲得107 mg米白色固體化合物E-a2，產率為63%。m.p： 91.4～93.1 ℃. ESI-MS（m/z）： 527.25[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， Methanol-d4） δ 7.37 （s， 1H）， 7.25 （d， J=7.9 Hz， 1H）， 7.15 （d， J=8.1 Hz， 1H）， 6.70 （d， J=8.6 Hz， 1H）， 6.36～6.26 （dd， J=17.9， 10.8 Hz， 1H）， 5.84 （d， J=8.2 Hz， 1H）， 5.17 （m， 2H）， 4.66～4.59 （m， 2H）， 3.86 （s， 2H）， 3.51 （d， J=6.1 Hz， 1H）， 2.39～2.25 （m， 3H）， 2.20～2.08 （m， 2H）， 1.84 （d， J=14.3 Hz， 1H）， 1.75～1.55 （m， 3H）， 1.44 （s， 3H）， 1.38～1.30 （m， 4H）， 1.16 （s， 3H）， 0.96 （d， J=6.7 Hz， 3H）， 0.76 （d， J=6.2 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 169.6， 165.9， 159.8， 141.2， 140.5， 130.8， 116.6， 114.0， 111.2， 108.0， 75.4， 71.4， 66.9， 59.3， 46.8， 45.9， 45.3， 43.2， 42.4， 38.1， 37.8， 35.3， 31.5， 28.3， 28.0， 25.8， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C30H42N2O6[M+H]+： 527.3116， found： 527.3128。

中間體D-a3：22-O-（4-（2-（（叔丁氧羰基）氨基）乙酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-a1類似，得到242 mg中間體D-a3，淡黃色固體，產率為90%。ESI-MS（m/z）： 627.28[M+H]+。化合物E-a3：22-O-（4-（2-氨基乙酰氨基））苯基截短側耳素。合成方法同化合物E-a1類似，冷凍干燥后獲得159 mg米白色固體化合物E-a3，產率為78%。m.p： 92.2～94.3 ℃. ESI-MS（m/z）： 527.36[M+H]+. 1H NMR （400 MHz， Methanol-d4） δ 7.51 （d， J=9.0Hz， 2H）， 6.88 （d， J=9.0Hz， 2H）， 6.29 （dd， J=17.5， 11.2 Hz， 1H）， 5.81 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 5.16 （s， 1H）， 5.14～5.11 （m， 1H）， 4.63 （d， J=16.5 Hz， 1H）， 4.57 （d， J=16.5 Hz， 1H），" 3.76 （s， 2H）， 3.50 （d， J=6.1 Hz， 1H）， 2.36 （m， 1H）， 2.29 （m， 2H）， 2.13 （m， 2H）， 1.80 （dd， J=14.2， 3.2 Hz， 1H）， 1.74～1.63 （m， 1H）， 1.62～1.45 （m， 2H）， 1.42 （s， 3H）， 1.39～1.34 （m， 2H）， 1.18～1.14 （m， 1H）， 1.13 （s， 3H）， 0.93 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.73 （d， J=6.7 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 169.7， 166.8， 156.0， 141.2， 133.2， 122.5， 116.6， 116.0， 75.3， 71.3， 67.1， 59.2， 47.8， 46.7， 45.9， 45.3， 43.1， 38.0， 37.7， 35.3， 31.5， 28.3， 28.0， 25.8， 16.9， 15.3， 11.9. HRMS calcd for C30H42N2O6[M+H]+： 527.3116， found： 527.3113。

中間體D-a4：22-O-（3-（（R）-2-（（叔丁氧羰基）氨基）丙酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-a1類似，得到223 mg中間體D-a4，淡黃色固體，產率為81%。ESI-MS（m/z）： 641.27[M+H]+。化合物E-a4：22-O-（3-（（R）-2-氨基丙酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同化合物E-a1類似，冷凍干燥后獲得101 mg米白色固體化合物E-a4，產率為54%。m.p： 171.5～174.2 ℃. ESI-MS（m/z）： 541.04[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， Methanol-d4） δ 7.36 （t， J=2.1 Hz， 1H）， 7.22 （dd， J=9.1， 7.3 Hz， 1H）， 7.15～7.09 （m， 1H）， 6.67 （dd， J=8.4， 2.4 Hz， 1H）， 6.28 （dd， J=17.4， 11.3 Hz， 1H）， 5.80 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 5.18～5.14 （s， 1H）， 5.14～5.11 （d， J=11.3 Hz， 1H）， 4.62 （m， 2H）， 3.75～3.69 （q， J=6.9 Hz， 1H）， 3.48 （d， J=6.4 Hz， 1H）， 3.37 （s， 1H）， 2.38～2.29 （m， 2H）， 2.26 （m， 1H）， 2.20～2.06 （m， 2H）， 1.81 （m， 1H）， 1.68 （m， 1H）， 1.64～1.53 （m， 2H）， 1.44 （d， J=7.1 Hz， 3H），" 1.42 （s， 3H）， 1.38～1.31 （m， 3H）， 1.18～1.15 （m， 1H）， 1.13 （s， 3H）， 0.93 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.74 （d， J=6.8 Hz， 3H）. 13C NMR （126 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 169.6， 159.7， 141.1， 140.7， 130.7， 116.7， 114.1， 111.4， 107.9， 75.4， 71.4， 66.8， 59.3， 51.5， 46.8， 45.9， 45.3， 43.2， 38.0， 37.8， 35.3， 31.5， 28.3， 28.0， 25.8， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C31H44N2O6[M+H]+： 541.3272， found： 541.3287。

中間體D-a5：22-O-（4-（（R）-2-（（叔丁氧羰基）氨基）丙酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-a1類似，得到223 mg中間體D-a5，淡黃色固體，產率為81%。ESI-MS（m/z）： 641.43[M+H]+。

化合物E-a5：22-O-（4-（（R）-2-氨基丙酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同化合物E-a1類似，冷凍干燥后獲得103 mg米白色固體化合物E-a5，產率為55%。m.p： 163.2～165.4 ℃. ESI-MS（m/z）： 541.21[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， Methanol-d4） δ 7.50 （d， J=9.2Hz， 2H）， 6.89 （d， J=9.2Hz， 2H）， 6.29 （dd， J=17.3， 11.3 Hz， 1H）， 5.81 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 5.15 （s， 1H）， 5.12 （m， 1H）， 4.62 （d， J=16.4 Hz， 1H）， 4.58 （d， J=16.5 Hz， 1H）， 4.04 （m， 1H）， 3.47 （d， J=6.7 Hz， 1H）， 2.40～2.30 （m， 2H）， 2.29～2.21 （m， 1H）， 2.21～2.07 （m， 2H）， 1.81 （d， J=14.6 Hz， 1H）， 1.73～1.60 （m， 3H）， 1.49～1.43 （m， 1H）， 1.43～1.41 （s， 3H）， 1.38～1.26 （m， 2H）， 1.18～1.14 （m， 4H）， 1.13 （s， 3H） 0.93 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.74 （d， J=7.0 Hz， 3H）. 13C NMR （126 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 169.7， 168.9， 156.3， 141.2， 133.1， 122.7， 122.6， 116.6， 116.1， 116.1， 75.4， 71.3， 67.1， 59.3， 50.8， 46.0， 45.3， 43.2， 38.9， 38.1， 37.8， 35.3， 31.5， 28.2， 28.0， 25.8， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C31H44N2O6[M+H]+： 541.3272， found： 541.3281。

中間體D-a6：22-O-（4-（（R）-2-（（叔丁氧羰基）氨基）-3-甲基丁酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-a1類似，得到241 mg中間體D-a6，淡黃色固體，產率為84%。ESI-MS（m/z）： 669.28[M+H]+。

化合物E-a6：22-O-（4-（（R）-2-氨基-3-甲基丁酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同化合物E-a1類似，冷凍干燥后獲得88 mg米白色固體化合物E-a6，產率為43%。m.p： 167.7～170.1 ℃. ESI-MS（m/z）： 569.36[M+H]+. 1H NMR （400 MHz， Methanol-d4） δ 7.49 （d， J=9.1， 2H）， 6.88 （J=8.9， 2H）， 6.29 （dd， J=17.4， 11.3 Hz， 1H）， 5.82 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 5.17 （s， 1H）， 5.13 （m， 1H）， 4.61 （d， J=16.5 Hz， 1H）， 4.60 （d， J=16.4 Hz， 1H），" 3.61 （d， J=7.0 Hz， 1H）， 3.48 （d， J=6.1 Hz， 1H）， 3.35 （m， 2H）， 2.40～2.30 （m， 2H）， 2.29～2.20 （m， 1H）， 2.17～2.05 （m， 2H）， 1.81 （m， 1H）， 1.72～1.53 （m， 3H）， 1.50～1.43 （m， 1H）， 1.42 （s， 3H）， 1.38～1.32 （m， 2H）， 1.21～1.15 （m， 2H）， 1.13 （s， 3H）， 1.04 （d， J=6.9 Hz， 3H）， 1.00 （d， J=6.8 Hz， 3H）， 0.93 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.74 （d， J=6.5 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， Methanol-d4） δ 219.5， 173.1， 169.7， 156.1， 141.1， 133.2， 122.8， 116.7， 116.0， 75.4， 71.3， 67.2， 61.7， 59.3， 46.8， 46.0， 45.3， 43.2， 38.1， 37.7， 35.3， 33.2， 31.5， 28.2， 28.0， 25.8， 17.9， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C33H48N2O6[M+H]+： 569.3585， found： 569.3600。

中間體D-a7：22-O-（4-（（S）-2，5-雙（（叔丁氧羰基）氨基）戊酰胺））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-a1類似，得到222 mg中間體D-a7，淡黃色固體，產率為66%。ESI-MS（m/z）： 784.11[M+H]+。

化合物E-a7：22-O-（4-（（S）-2，5-二氨基戊酰胺））苯基截短側耳素。合成方法同化合物E-a1類似，冷凍干燥后獲得81 mg米白色固體化合物E-a7，產率為49%。m.p： 192.4～195.2 ℃. ESI-MS（m/z）： 584.14[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， Methanol-d4） δ 7.57 （d， J=9.0， 2H）， 6.90 （d， J=8.9， 2H）， 6.29 （dd， J=18.2， 10.3 Hz， 1H）， 5.82 （d， J=8.2 Hz， 1H）， 5.16 （s， 1H）， 5.13 （t， J=6.0 Hz， 1H）， 4.63 （d， J=16.4 Hz， 1H）， 4.58 （d， J=16.5 Hz， 1H）， 4.11 （t， J=6.6 Hz， 1H）， 3.49 （d， J=5.9 Hz， 1H）， 2.38～2.22 （m， 3H）， 2.20～2.09 （m， 2H）， 2.08～1.96 （m， 2H）， 1.88～1.79 （m， 3H）， 1.72～1.53 （m， 3H）， 1.48～1.45 （m， 1H）， 1.42 （s， 3H）， 1.39～1.28 （m， 2H）， 1.20～1.15 （m， 1H）， 1.14 （s， 3H）， 0.93 （d， J=7.0 Hz， 3H）， 0.73 （d， J=6.7 Hz， 3H）. 13C NMR （101 MHz， Methanol-d4） δ 219.6， 169.7， 167.5， 156.4， 141.2， 132.8， 122.7， 116.6， 116.1， 75.4， 71.3， 67.1， 59.3， 54.4， 46.8， 46.0， 45.3， 43.2， 40.1， 38.1， 37.8， 35.3， 31.5， 29.7， 28.3， 28.0， 25.8， 24.2， 16.9， 15.3， 11.8. HRMS calcd for C33H49N3O6[M+H]+： 584.3694， found： 584.3707。

中間體D-b：22-O-（3-（（S）-2-（（（（9氫-芴-9-基）甲氧基）羰基）氨基）-5-（3-（（（2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氫苯并呋喃-5-基）磺酰基）胍基））戊酰胺基））苯基截短側耳素。合成方法同中間體D-1類似，得到435 mg中間體D-b，淡黃色固體，產率為92%。ESI-MS（m/z）： 1100.54[M+H]+。

中間體D-c：22-O-（3-（（S）-2-氨基-5-（3-（（（2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氫苯并呋喃-5-基）磺酰基）胍基））戊酰胺基））苯基截短側耳素。將300 mg中間體D-c溶解于5 mL甲醇中加入1 mL哌啶。常溫攪拌2 h后，真空旋蒸除去有機溶劑，經柱層析純化（二氯甲烷： 甲醇=10： 1），得到213 mg中間體D-4b，淡黃色固體，產率為89%。ESI-MS（m/z）： 878.36[M+H]+。

化合物E-b：22-O-（3-（（S）-2-氨基-5-胍基戊酰胺））苯基截短側耳素。將中間體D-4b溶于1 mL二氯甲烷中，向上述溶液中滴加1 mL三氟乙酸，室溫攪拌2 h后，真空旋蒸除去有機溶劑，使用反相柱層析進行純化，冷凍干燥后獲得96 mg米白色固體化合物E-b，產率為63%。m.p： 184.3～186.4 ℃. ESI-MS（m/z）： 626.65[M+H]+. 1H NMR （500 MHz， DMSO-d6） δ 10.0 （s， 1H）， 7.8 （s， 3H）， 6.9 （t， J=5.8 Hz， 1H）， 6.7～6.7 （m， 3H）， 6.5 （qd， J=7.9， 7.0， 3.0 Hz， 2H）， 6.1 （dd， J=8.3， 2.5 Hz， 1H）， 5.5 （dd， J=17.7， 11.2 Hz， 1H）， 5.0 （d， J=8.3 Hz， 1H）， 4.5～4.4 （m， 3H）， 4.1 （d， J=13.4 Hz， 2H）， 2.8 （d， J=5.9 Hz， 2H）， 2.5 （q， J=6.7 Hz， 3H）， 2.1 （s， 1H）， 1.7 （s， 1H）， 1.6 （dd， J=19.3， 10.7 Hz， 2H）， 1.5 （ddt， J=21.8， 15.6， 8.8 Hz， 4H）， 1.2 （p， J=7.8 Hz， 3H）， 1.1～1.0 （m， 2H）， 1.0 （tt， J=14.4， 8.3 Hz， 5H）， 0.9 （ddt， J=10.9， 7.5， 3.8 Hz， 2H）， 0.7 （s， 3H）， 0.4 （s， 3H）， 0.2 （s， 2H）. 13C NMR （126 MHz， DMSO-d6） δ 219.7， 168.5， 168.0， 158.6， 157.4， 141.2， 139.6， 130.8， 116.5， 113.7， 110.7， 107.5， 73.8， 70.6， 65.9， 58.3， 53.6， 45.9， 44.9， 42.3， 41.1， 37.1， 34.9， 30.7， 29.1， 27.3， 25.2， 24.8， 16.8， 15.4， 12.3. HRMS calcd for C34H51N5O6[M+H]+： 626.3912， found： 626.3938。

2.2 抗菌活性測試

采用微量肉湯稀釋法測定11個化合物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），詳細參考美國國家臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗菌藥物敏感性試驗操作規程。取潔凈無菌的96孔培養板，第一列加入供試菌液200 μL，后11列依次加入菌液100 μL。將4 μL待測樣品（6.4 mg/mL，溶劑為DMSO）加入第一孔中，同時設置陽性對照組（加入濃度為6.4 mg/mL的lefamulin 4 μL）及空白對照組（DMSO 4 μL）。用8道微量移液槍插入第一列孔吹打均勻后，依次從前一列取100 μL樣品加入到后一列，進行2倍梯度稀釋，加樣至最后一孔時，混勻后再將液體吸取100 μL，稀釋后各孔中的化合物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.50、0.25、0.125和0.0625 μg/mL。將加樣接種后的96孔板置于37 ℃培養箱內培養16～20 h。培養結束后，肉眼觀察各孔內細菌的生長情況，以檢定小孔內細菌未生長的最低藥物濃度為其MIC值。實驗中所用菌株為甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌ATCC29213和大腸埃希菌 ATCC2592。

2.3 細胞毒活性測試

用于細胞毒活性的測試方法是MTT法。細胞用培養基（含血清）培養至對數生長期，然后制備單細胞懸液并計數。按接種密度3000～10000個細胞/孔，將細胞接種于96孔培養板中，通常每孔加入6000個細胞進行細胞毒性實驗。根據實驗的具體需要，給予干預藥物0～20 μL，在37 ℃、5% CO2條件下培養至合適的時間，一般為6～24 h。培養結束，每孔棄去培養基后加入100 μL新鮮培養基，然后每孔加入10 μL MTT溶液，繼續孵育4 h后再次將培養基棄去，并在每孔加入110 μL藍紫色結晶甲臜溶液，用搖床低速震蕩10 min，使結晶充分溶解。然后在570 nm下用酶聯免疫吸附測定法測量每個孔的吸光度。

2.4 分子對接實驗

2.4.1 配體與蛋白準備

本文以S. aureus（NTCT 8325）核糖體50S亞基與lefamulin形成的X-射線晶體結構（PDB ID：5HL7）為基礎，使用Autodock vina 1.2.5軟件對化合物進行分子對接模擬。從PDB數據庫（https： //www.rcsb.org/）中下載晶體結構復合物（PDB ID： 5HL7）為分子對接受體。將得到的晶體結構使用Discovery Studio 2016（DS）軟件進行預處理，只保留一條鏈和配體，標準如下：刪去水分子、去除鹽、只保留一條鏈，并根據靶蛋白復合物中配體小分子的坐標定義分子對接的活性位點，從而確定活性位點坐標。利用DS軟件對靶蛋白進行去配體、加氫、加電荷和添加原子類型處理。利用DS軟件對配體分子進行添加原子類型、加氫和加電荷的處理。

2.4.2 分子對接

為了評估Autodock vina軟件應用于5HL7晶體結構對接的可靠性以及對接的精度，將復合物晶體結構中的配體抽取出來重新對接進相應的蛋白結構中，計算對接后的配體姿勢和原始姿勢之間的均方根偏差值（root mean square deviation，RMSD），以此來衡量此對接方法的可靠性。使用DS軟件中的Align模塊來計算相應的RMSD值，一般RMSD值小于2?時，表明該對接方法具有較高的精度。完成方法評估后，將準備好的分子通過Autodock vina軟件對分子進行分子對接。

2.5 ADMET性質分析

ADMET性質，即小分子在體內吸收、分布、代謝、排泄和毒性等藥動學性質。利用DS軟件中的ADMET Descriptors模塊對合成的化合物進一步進行以下性質的預測分析：①吸收（absorption）；②25 ℃水溶解度（solubility）；③血腦屏障通透性（blood brain barrier penetration，BBB）；④細胞色素P4502D6抑制性（cytochromeP4502D6 inhibition）；⑤血漿蛋白結合率（plasma protein binding，PPB）；⑥肝毒性（hepatotoxicity）。

3 結果與討論

3.1 化合物抗菌活性

根據CLSI指導原則的微量稀釋法，對新合成的11個化合物進行了抗菌活性測試，測試結果如表2所示。大多數化合物對標準敏感金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性均優于lefamulin，尤其是化合物E-a2和E-a3顯示出相對最好的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的活性都是陽性藥的4倍。化合物E-a7與E-b對標準金黃色葡萄球菌的抗菌活性弱于lefamulin，但它們對大腸埃希菌的抗菌活性與其他化合物基本相當，略強于lefamulin。這可能是由于上述分子中含有較多氨基，極性相對較大，因此較難穿過相對較厚的革蘭陽性菌細胞壁進入細胞內部與PTC結合。相比之下，革蘭陰性菌細胞壁較薄，同時具有相對不易透過的外膜，極性較大且具有氨基的分子可以相對容易地穿過細胞外膜和細胞壁進入細胞內部。

3.2 化合物細胞毒活性結果

通過MTT法在體外水平測定，衍生物對4種人類癌細胞系（HepG2、HGC27、HCT-116 和MCF-7）的抑制活性，評估該系列衍生物的細胞毒性。實驗結果如表3所示，化合物經氨基苯酚以及氨基酸的修飾后，化合物的細胞毒性均較低（IC50≥10 μmol/L）， 具有良好的選擇性。

3.3 化合物分子對接結果

3.3.1 方法學的建立驗證

將5HL7復合物中的配體小分子按照分子對接流程，利用Autodock vina軟件再次對接到結合口袋。在對接結果中挑選出最佳構象并與原晶體結構中的配體比較，利用DS軟件中的RMSD模塊計算RMSD值。結果表明，其重原子RMSD=0.5275 ?，對接構象與原配體構象重合程度較高（圖2），證明了所選蛋白晶體結構及對接方法的可靠性。

3.3.2 對接結果分析

為了進一步探究化合物的構效關系，我們將抗菌活性相對較強的化合物E-a2和E-a3與金黃色葡萄球菌核糖體50S亞基與lefamulin復合的X射線晶體結構（PDB ID：5HL7）進行分子對接模擬，結果如圖3所示。化合物E-a2、E-a3與lefamulin的母核的相互作用基本相同，但化合物E-a2和E-a3的側鏈連接的氨基苯醚與氨基酸能夠與結合空腔的核苷酸形成更多的氫鍵相互作用，增強了化合物與PTC的結合，這可能是化合物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性優于lefamulin的原因之一。

3.4 化合物ADMET預測結果

將合成的化合物利用DS軟件的ADMET Descriptors模塊進行ADMET預測，預測結果如表4所示，Solubility水平為2，表示25 ℃下化合物水溶性良好；BBB水平為4，表明幾乎不能通過血腦屏障；Absorption水平為0～2表明口服后腸道吸收效果良好，水平為3表明口服后腸道吸收效果較差；CYP2D6 1表明化合物對CYP2D6酶無抑制作用；Hepatotoxic 1表示不存在肝毒性；PPB 1表示化合物血漿蛋白結合率低，true表示化合物血漿蛋白結合率高。從預測結果可以看出，大部分化合物的水溶性好、腸道吸收效果良好、無CYP2D6酶抑制作用和肝毒性，擁有較好的成藥性，具有進一步研究價值。

4 結論

本研究以截短側耳素作為母核，在其C14側鏈進行結構改造，合成3個氨基苯醚類衍生物和8個氨基酸取代的苯基醚類衍生物，并利用核磁、ESI-MS和HRMS對其結構進行了表征。氨基苯酚以及氨基酸的修飾提高了化合物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性，尤其是化合物E-a2和E-a3顯示出相對最好的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的活性都是陽性藥的4倍。通過分子對接發現，與lefamulin相比，化合物側鏈連接的氨基苯醚與氨基酸能夠與結合空腔的核苷酸形成更多的氫鍵相互作用，可能增強了化合物與PTC的結合，可能有助于截短側耳素類化合物抗菌活性的增強。同時，該類化合物的細胞毒活性低，理化性質預測良好，具有較好潛在的成藥性。

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