cphA基因特異性介導維氏氣單胞菌碳青霉烯耐藥的初步研究

摘要：目的 探究cphA基因對維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）β-內酰胺耐藥性的影響，解析基因功能。方法 以維氏氣單胞菌C4為研究對象，采用同源重組方法構建cphA基因敲除株；利用比濁法測定生長曲線，微量二倍稀釋法檢測不同β-內酰胺類抗生素對菌株的最小抑菌濃度，實時熒光定量PCR法測定cphA基因對抗生素的響應表達；并通過分子對接解析CphA酶與抗生素互作的重要活性位點。結果 成功構建cphA基因敲除株，發現cphA基因缺失不影響維氏氣單胞菌生長。雖然cphA基因在碳青霉烯類和青霉素類抗生素處理下均響應性表達增加，但cphA基因缺失僅特異性導致菌株對碳青霉烯類藥物由耐受變為敏感，而對其他β-內酰胺類的藥物敏感性表型并無影響。此外，分子對接結果表明，CphA酶的 Thr135、His174、Asn201 氨基酸殘基是與亞胺培南分子形成氫鍵作用的位點。結論 維氏氣單胞菌中的cphA基因特異性介導碳青霉烯耐藥。本研究為進一步完善維氏氣單胞菌的耐藥研究和β-內酰胺酶的功能研究提供了一定的理論基礎。

關鍵詞：維氏氣單胞菌；cphA基因；基因敲除；耐藥性

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

The preliminary study on carbapenem resistance specifically

mediated by cphA in Aeromonas veronii

Li Anyi， Li Hong， Liu Zhu， Li Juanjuan， Tang Yanqiong， Chi Xue， and Ma Xiang

（School of Life Sciences， Hainan University， Haikou 570228）

Abstract Objective To investigate the effect of cphA on β-lactam resistance in Aeromonas veronii and to elucidate the function of this gene. Methods A. veronii C4 was used as the research object， and a cphA gene knockout strain was constructed using the homologous recombination method. The growth curve was determined by measuring the turbidity， the minimum inhibitory concentrations of different β-lactam antibiotics against the strains were detected using the microdilution method， and the expression of cphA in response to antibiotic exposure was determined using real-time quantitative PCR. The important active sites of the CphA enzyme were analyzed through molecular docking. Results The cphA gene knockout strain was successfully constructed. It was found that the absence of cphA did not affect the growth of A. veronii. Although the expression of cphA increased significantly in response to the exposure of both carbapenem and penicillin， the lack of cphA specifically made the strain sensitive to carbapenem antibiotics while having no effects on the resistance phenotypes of other types of β-lactams. In addition， the results of molecular docking indicated that the amino acid residues Thr135， His174， and Asn201 of the CphA enzyme constitute the active sites that form hydrogen bond interactions with the imipenem molecule. Conclusion The cphA in A. veronii specifically mediated carbapenem resistance. This study provides a theoretical basis for further improving the research on drug resistance in A. veronii and the functional research on β-lactamases.

Key words Aeromonas veronii; cphA; Gene knockout; Antibiotic resistance

β-內酰胺類抗生素是使用最為廣泛的一類抗菌藥物，其主要類型包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單環內酰胺類（圖1）[1]。自1929年青霉素被發現以來，這類抗生素為人類醫學做出了巨大貢獻[2]。然而，大量使用β-內酰胺類抗生素導致了細菌耐藥性的出現與傳播，許多細菌通過產生可以水解藥物分子的β-內酰胺酶以抵御抗生素脅迫[3]。cphA基因家族編碼一類金屬β-內酰胺酶，它最初分離自嗜水氣單胞菌，被認為主要水解碳青霉烯類抗生素，而對青霉素和頭孢菌素具有較差的活性[4]。目前已有許多研究發現cphA基因廣泛存在于氣單胞菌屬內，包括簡氏氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和維氏氣單胞菌等[5-6]，可對于cphA基因在這些不同氣單胞菌中的功能研究較少。

維氏氣單胞菌是氣單胞菌屬的一員，因其在集約化水產養殖系統中常會造成魚類的感染并導致運動型氣單胞菌敗血癥，被認為是典型的水產病原菌[7]。

近年來越來越多的病例表明它已經成為一種宿主范圍非常廣泛的病原菌，可以感染包括家禽[8]、哺乳動物[9-10]以及人類[11-12]在內的大量宿主。此外，抗生素的廣泛和過度使用，加速了耐藥基因的傳播與耐藥菌的產生，多項研究中分離的維氏氣單胞菌都表現出了對多種抗生素的耐藥性[13-15]。作為一類典型的多重耐藥菌，維氏氣單胞菌在給養殖業造成巨大經濟損失的同時，也對人類健康構成嚴重威脅，因此對于其耐藥性及耐藥機制的研究逐漸受到重視。

本研究在前期對多重耐藥的維氏氣單胞菌分離株C4的基因組分析中發現，其中存在2個β-內酰胺酶基因cphA和ampS。為了探究維氏氣單胞菌中cphA基因的功能，本研究采用同源重組基因敲除的方法構建cphA基因敲除株，并通過藥敏試驗和實時熒光定量PCR驗證基因與菌株耐藥表型的關聯，再進一步利用分子對接初步闡明其作用機制。研究的結果為豐富維氏氣單胞菌的耐藥研究和β-內酰胺酶的功能研究提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

維氏氣單胞菌C4、大腸埃希菌WM3064、自殺質粒pRE112、pBBR-MCS-2質粒均為實驗室保存。實驗所用引物合成及測序服務均由上海生工生物工程有限公司提供。本研究所用引物見表1，所用酶和試劑盒見表2。

1.2 敲除載體pRE112-ΔcphA的構建

基于同源重組的方法構建敲除株（圖2）。使用FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit提取維氏氣單胞菌基因組DNA作為PCR模板，分別使用引物cphA-F1/R1和cphA-F2/R2擴增得到 cphA 基因上下游同源片段。同時以pRE112質粒作為模板，使用引物pRE112-Line-F/R擴增得到線性化載體。50 μL PCR反應體系：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，模板2 μL（30 ng/μL），上下游引物各2 μL（10 μmol/L），ddH2O 19 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（載體4 min），循環30次；最后72 ℃ 10 min。FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收同源臂片段與線性化載體后，使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit無縫克隆連接片段與載體，得到敲除質粒pRE112-ΔcphA。

1.3 敲除菌株ΔcphA的構建

熱激法將重組質粒pRE112-ΔcphA轉化至大腸埃希菌WM3064感受態細胞中，涂布于帶有氯霉素的平板中用于篩選。再利用雙親接合法，將大腸埃希菌WM3064中的重組敲除載體轉入野生型維氏氣單胞菌 C4 中，使用載體驗證引物 pRE112-F/R 驗證敲除載體是否轉移成功。最后將正確的陽性接合子涂布于含有 20%蔗糖的平板進行篩選，使用基因敲除驗證引物cphA-F0/R0 進行菌落PCR 以篩選ΔcphA菌株。

1.4 回補載體pBBR-cphA與回補菌株ΔcphA：： cphA的構建

以維氏氣單胞菌基因組DNA作為PCR模板，使用引物pBBR-cphA-F/R擴增得到cphA基因編碼區片段。同時以pBBR-MCS-2質粒為模板，pBBR-Line-F/R引物 PCR 擴增得到線性化 pBBR-MCS-2載體。FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收基因片段與線性化載體后，使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit無縫克隆連接片段與載體，得到回補載體pBBR-cphA。熱激法將重組質粒pBBR-cphA轉化至大腸埃希菌WM3064感受態細胞中，涂布于帶有卡那霉素的平板中用于篩選。然后利用雙親接合法，將大腸埃希菌WM3064中的重組載體轉入基因敲除菌株ΔcphA中，使用載體驗證引物pBBR-F/R 驗證回補載體是否轉移成功，得到回補菌株ΔcphA：： cphA。

1.5 生長曲線測定

將野生型維氏氣單胞菌C4和敲除菌株ΔcphA分別接種至LB液體培養基中，30℃ 150 r/min過夜培養。按2×106 CFU/mL的初始濃度分別轉接于新鮮LB液體培養基中，30℃ 150 r/min培養30 h，每隔2 h測定A600值。統計數據并使用Graphpad prism繪制生長曲線，每組實驗設置3個生物學重復。

1.6 菌株耐藥性測定

微量二倍稀釋法檢測不同抗生素對菌株的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）。用ddH2O配制濃度為10240 μg/mL的抗生素母液，倍比稀釋濃度至5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10和5 μg/mL。將過夜培養的菌株轉接至新鮮LB液體培養基，使初始濃度為2×106 CFU/mL。

于96孔培養板中加入95 μL菌液，再逐孔加入5 μL稀釋后藥液，使各孔藥品終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 μg/mL。充分混勻，于30℃恒溫培養箱靜置培養24 h后測定A600值。每組實驗設置3個重復，MIC值結果參考臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗標準進行判定。

1.7 實時熒光定量PCR

參考生長曲線的測定結果，分別選取t=3 h作為對數生長期，t=18 h作為穩定期，在LB液體培養基中將野生型維氏氣單胞菌C4培養至對應時期，以50 μg/mL氨芐西林與10 μg/mL亞胺培南分別處理30 min后收集菌體。使用Bacteria Total RNA Isolation Kit提取總 RNA，然后用HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）去除殘留的基因組DNA污染，并將RNA反轉錄為cDNA。20 μL實時熒光定量PCR（Quantitative reverse transcription PCR， RT-qPCR）反應體系：2×ChamQTM SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，10×Dilution Buffer 2 μL，模板2 μL（500 ng/μL），上下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），ddH2O 4.4 μL。RT-qPCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。反應結束后使用2-??Ct法計算結果，并使用Graphpad prism軟件作圖分析。每組實驗設置3個生物學重復，配對樣本t檢驗用于分析組間的差異性。

1.8 CphA酶與亞胺培南的分子對接

從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載亞胺培南的3D結構文件，通過Open Babel轉換為pdb格式。將維氏氣單胞菌中β-內酰胺酶CphA的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，保存得到的三維結構模型文件為pdb格式。利用PyMol處理受體蛋白與小分子文件，去除水分子并進行加氫。使用AutoDock Vina對配體和受體進行模擬分子對接，PyMol和LigPlot處理對接結果文件并進行可視化分析。

2 結果

2.1 敲除菌株ΔcphA構建

為了驗證敲除載體pRE112-ΔcphA，使用載體驗證引物pRE112-F/R，對轉化了cphA基因上下游同源片段和pRE112質粒連接產物的大腸埃希菌WM3064進行菌落PCR，結果如圖3所示。泳道1的陽性對照以pRE112空載體作為模板，PCR產物條帶大小為579 bp，泳道2～6以轉化子作為模板， PCR產物條帶大小為1579 bp，條帶大小與理論值相符，表明敲除載體pRE112-ΔcphA構建成功。

接下來通過細菌雙親接合實驗，將大腸埃希菌WM3064中的敲除載體pRE112-ΔcphA轉入野生型維氏氣單胞菌C4中，隨后涂布于含有20%蔗糖的LB培養基平板進行篩選。根據同源重組原理，敲除載體中的上下游同源片段會與細菌基因組中同源片段發生交換，使得細菌基因組中的目的基因缺失。而pRE112重組載體會在20%蔗糖壓力選擇下丟失，從而獲得基因敲除菌株。為了篩選敲除菌株ΔcphA，使用基因敲除驗證引物cphA-F0/R0，對候選克隆子進行菌落PCR，結果如圖4所示。泳道9的陽性對照以維氏氣單胞菌C4基因組為模板，PCR產物條帶大小為1916 bp，泳道1～8以待驗證的陽性克隆子為模板，PCR產物條帶大小為1151 bp的即為潛在的陽性敲除株。純化回收潛在陽性敲除株的基因組PCR產物進行測序，比對結果顯示上下游同源臂序列一致，且上下游同源臂之間的基因序列缺失（圖5），表明成功構建了基因敲除株ΔcphA。

2.2 回補菌株ΔcphA：：cphA構建

為了驗證回補載體pBBR-cphA，使用載體驗證引物pBBR-F/R，對轉化了cphA基因編碼區片段和pBBR-MCS-2質粒連接產物的大腸埃希菌WM3064進行菌落PCR，結果如圖6所示。泳道9的陽性對照以pBBR-MCS-2空載體作為模板，PCR產物條帶大小為611 bp，泳道1～8以待驗證的陽性轉化子作為模板，PCR產物條帶大小為1376 bp的即為潛在的陽性重組載體。純化回收潛在陽性重組載體的PCR產物進行測序，比對結果顯示基因序列一致，表明回補載體pBBR-cphA構建成功。

通過細菌雙親接合實驗，將大腸埃希菌WM3064中的回補載體pBBR-cphA轉入基因敲除菌株ΔcphA中，隨后涂布于含有卡那霉素的LB培養基平板進行篩選。使用載體驗證引物pBBR-F/R進行菌落PCR以篩選回補菌株ΔcphA：：cphA，結果如圖7所示。泳道9的陽性對照以pBBR-MCS-2空載體作為模板，PCR產物條帶大小為611 bp，泳道1～8以待驗證的陽性接合子作為模板，PCR產物條帶大小為1376 bp，條帶大小與理論值相符，表明回補菌株ΔcphA：：cphA構建成功。

2.3 cphA敲除對維氏氣單胞菌生長的影響

為了分析cphA基因敲除后對維氏氣單胞菌生長的影響，在LB培養基中比較野生型維氏氣單胞菌C4和敲除菌株ΔcphA的生長狀況。結果表明敲除菌株ΔcphA的生長速率與野生型相比無明顯差異（圖8）。

2.4 cphA介導的維氏氣單胞菌β-內酰胺耐藥性測定

首先，選取8種常見的β-內酰胺類抗生素，通過微量二倍稀釋法進行藥敏試驗，測定這類抗生素對維氏氣單胞菌各菌株的MIC值。結果顯示，維氏氣單胞菌C4野生型菌株對碳青霉烯（亞胺培南）和青霉素（青霉素、氨芐西林）兩類藥物均具有顯著的耐藥性，而對其他的β-內酰胺類，包括頭孢菌素（頭孢氨芐、頭孢噻吩）、酰胺型頭孢烯（頭孢噻肟）、頭霉素（頭孢西丁）及單環內酰胺（氨曲南），則較為敏感（表3）。cphA基因敲除后，亞胺培南對ΔcphA菌株的MIC值顯著下降，而回補菌株ΔcphA：：cphA的MIC值則恢復至與野生型一致。與該結果一致的是，通過RT-qPCR檢測cphA基因對藥物的響應時發現，與空白組相比，亞胺培南處理能夠在細菌生長的指數期和穩定期均顯著激活cphA基因的表達（圖9A）。上述結果表明，cphA基因能夠響應碳青霉烯藥物脅迫，并介導維氏氣單胞菌的碳青霉烯耐藥表型。

令人驚奇的是，藥敏試驗表明，cphA基因的敲除或回補并未顯著影響青霉素類藥物對維氏氣單胞菌的MIC值（表3）；但RT-qPCR檢測cphA基因對藥物的響應時則發現，與空白組相比，氨芐西林處理同樣能夠在細菌生長的指數期和穩定期均顯著激活cphA基因的表達（圖9B）。推測cphA基因也響應青霉素類藥物脅迫，但維氏氣單胞菌C4基因組中還存在另一個已知可水解青霉素的β-內酰胺酶基因ampS[16]，其在ΔcphA菌株中發揮功能也會介導菌株對青霉素的耐藥性。為了驗證這一假設，構建了cphA和ampS基因的雙敲菌株ΔcphAΔampS，以及單獨或全部回補cphA和ampS基因的菌株，并進行藥敏試驗。結果如表3所示，碳青霉烯和青霉素類藥物對雙敲菌株ΔcphAΔampS的MIC值均顯著下降，但是，單基因回補株ΔampSΔcphA：：cphA僅表現出碳青霉烯耐藥表型，并且單基因回補株ΔampSΔcphA：： ampS僅表現出青霉素耐藥表型。上述結果排除了cphA基因介導青霉素耐藥表型的可能性，表明cphA基因特異性介導維氏氣單胞菌的碳青霉烯耐藥。

2.5 CphA酶與亞胺培南的分子對接

為了探究cphA基因所編碼的β-內酰胺酶與碳青霉烯之間相互作用的分子基礎，使用AutoDock分析CphA酶與亞胺培南的結合，對接結合視圖和相互作用圖見圖10。分子對接結果顯示配體與受體間的結合能為-6.6 kcal/mol，小于-5 kcal/mol[17]，表明CphA酶與亞胺培南具備良好的結合活性。相互作用圖顯示二者之間的主要相互作用為氫鍵和疏水作用，其中亞胺培南與CphA酶的氨基酸殘基Thr135、His174和Asn201結合形成氫鍵作用，與 Leu139、Gly138、Trp68、Thr98、Asp99、Phe204、His97、Lys196、Gly200、His231、Phe134和Val48形成疏水作用。

3 討論

β-內酰胺酶可以通過水解的方式使β-內酰胺類抗生素失活，是細菌常見的耐藥手段[18]。本研究基于同源重組的方法在維氏氣單胞菌中構建了β-內酰胺酶基因cphA的敲除株。生長曲線表明cphA基因缺失后不影響菌株生長。而藥敏試驗結果顯示，cphA基因編碼了一類碳青霉烯酶，該酶有專一的底物選擇，不與其他種類的β-內酰胺類抗生素發生反應。這一結果與在嗜水氣單胞菌中的研究一致[4]，說明維氏氣單胞菌與嗜水氣單胞菌中的CphA酶具有相同的作用。同時我們在基因表達量的檢測中發現，盡管青霉素類藥物并不是CphA酶的作用底物，卻可以誘導cphA基因的表達。結構類似物誘導相同的基因表達的情況在生物學過程中十分常見[19-20]，碳青霉烯本身就是由青霉素改造而來的一類β-內酰胺類抗生素，二者具有相似的結構[21]，這可能是氨芐西林處理能夠激活cphA基因表達上調的原因。此外，分子對接結果表明，CphA酶的Thr135、His174、Asn201氨基酸殘基與亞胺培南分子之間結合形成氫鍵，這些殘基可能是酶發揮功能的重要活性位點。已有研究解析了一種來自嗜水氣單胞菌的CphA酶的結構，并提出其水解碳青霉烯的作用機制。水分子被His118和Asp120殘基所吸引，在被His118激活后作為親核試劑攻擊C-7羰基碳并導致C-N 鍵斷裂，而His196通過與β-內酰胺鍵的羰基氧形成氫鍵來促成氧陰離子孔，是酶發揮催化活性的關鍵步驟[22]。還有研究表明His118和His196的突變會導致該種CphA酶抗碳青霉烯類藥物的活性降低至少1000倍[23]。來自嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的CphA酶具有很高的同源性（圖11），本研究的結果進一步說明了保守的組氨酸殘基在金屬β-內酰胺酶的功能中起到了重要作用。研究β-內酰胺酶的作用機制對解決細菌的β-內酰胺耐藥具有十分重要的意義，后續可以對分析得到的活性位點氨基酸進行定點突變，進一步確定水解作用中起到重要作用的關鍵位點。甚至在下游針對β-內酰胺酶的關鍵活性位點研發抑制劑，與傳統藥物組合施用以克服細菌耐藥，達到理想的治療效果，這將是除了研發新型抗生素以外解決細菌耐藥的新思路。

參 考 文 獻

Bush K， Bradford P A. Epidemiology of β-lactamase-producing pathogens[J]. Clin Microbiol Rev， 2020， 33（2）： e00047-00019.

Tooke C L， Hinchliffe P， Bragginton E C， et al. β-lactamases and β-lactamase inhibitors in the 21st century[J]. J" Mol Biol， 2019， 431（18）： 3472-3500.

牛記軍， 孔志斌， 錢力. 頭孢哌酮哌拉西林與β-內酰胺酶抑制劑對肺炎克雷伯菌的抑菌作用及耐藥性分析[J]. 中國藥物與臨床， 2021， 21（24）： 3959-3962.

Segatore B， Massidda O， Satta G， et al. High specificity of cphA-encoded metallo-beta-lactamase from Aeromonas hydrophila AE036 for carbapenems and its contribution to beta-lactam resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1993， 37（6）： 1324-1328.

Balsalobre L C， Dropa M， Lincopan N， et al. Detection of metallo‐β-lactamases‐encoding genes in environmental isolates of Aeromonas hydrophila and Aeromonas jandaei[J]. Lett Appl Microbiol， 2009， 49（1）： 142-145.

Sinclair H A， Heney C， Sidjabat H E， et al. Genotypic and phenotypic identification of Aeromonas species and carbapenem resistance in Queensland， Australia[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2016， 85（1）： 98-101.

Dien L T， Ngo T P H， Nguyen T V， et al. Non-antibiotic approaches to combat motile Aeromonas infections in aquaculture： Current state of knowledge and future perspectives[J]. Rev Aquacult， 2022， 15（1）： 333-366.

Silver A C， Graf J. Prevalence of genes encoding the type three secretion system and the effectors AexT and AexU in the Aeromonas veronii group[J]. DNA Cell Biol， 2009， 28（8）： 383-388.

Liu Z， Li A， Wang Y， et al. Comparative analysis of microbial community structure between healthy and Aeromonas veronii-infected Yangtze finless porpoise[J]. Microb Cell Fact， 2020， 19（1）： 1-12.

Ramsamy Y， Mlisana K P， Amoako D G， et al. Comparative pathogenomics of Aeromonas veronii from pigs in South Africa： Dominance of the novel ST657 clone[J]. Microorganisms， 2020， 8（12）： 2008.

Chen P L， Tsai P J， Chen C S， et al. Aeromonas stool isolates from individuals with or without diarrhea in southern Taiwan： Predominance of Aeromonas veronii[J]. J Microbiol Immunol， 2015， 48（6）： 618-624.

Mencacci A， Cenci E， Mazzolla R， et al. Aeromonas veronii biovar veronii septicaemia and acute suppurative cholangitis in a patient with hepatitis B[J]. J Med Microbiol， 2003， 52（8）： 727-730.

Woo S J， Kim M S， Jeong M G， et al. Establishment of epidemiological cut-off values and the distribution of resistance genes in Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii isolated from aquatic animals[J]. Antibiotics， 2022， 11（3）： 343.

Tekedar H C， Arick M A， Hsu C Y， et al. Identification of antimicrobial resistance determinants in Aeromonas veronii strain MS-17-88 recovered from channel catfish （Ictalurus punctatus）[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2020， 10： 348.

Abu-Elala N， Abdelsalam M， Marouf S， et al. Comparative analysis of virulence genes， antibiotic resistance and gyrB-based phylogeny of motile Aeromonas species isolates from Nile tilapia and domestic fowl[J]. Lett Appl Microbiol， 2015， 61（5）： 429-436.

Walsh T R， Hall L， MacGowan A P， et al. Sequence analysis of two chromosomally mediated inducible β-lactamases from Aeromonas sobria， strain 163a， one a class D penicillinase， the other an AmpC cephalosporinase[J]. J Antimicrob Chemother， 1995， 36（1）： 41-52.

Ren G L， Zhong Y， Ke G， et al. The mechanism of compound Anshen essential oil in the treatment of insomnia was examined by network pharmacology[J]. Evid-Based Compl Alt， 2019， （2）： 1-9.

Lee J H， Bae I K， Lee S H. New definitions of extended-spectrum β-lactamase conferring worldwide emerging antibiotic resistance[J]. Med Res Rev， 2012， 32（1）： 216-232.

寇美辰， 唐欣影， 魏寶東. PI因子結構類似物對恰塔努加鏈霉菌發酵產納他霉素的影響[J]. 食品工業科技， 2017， 38（17）： 45-49.

馬浩迪， 李瑩， 肖紅艷， 等. 革蘭氏陰性細菌群體感應信號分子AHL結構類似物的合成及活性研究[J]. 化學研究與應用， 2021， 33（1）： 123-128.

Codjoe F S， Donkor E S. Carbapenem resistance： A review[J]. Med Sci， 2018， 6（1）： 1.

Garau G， Bebrone C， Anne C， et al. A metallo-β-lactamase enzyme in action： Crystal structures of the monozinc carbapenemase CphA and its complex with biapenem[J]. J Mol Biol， 2005， 345： 785-795.

Bebrone C， Anne C， Kerff F， et al. Mutational analysis of the zinc- and substrate-binding sites in the CphA metallo-beta-lactamase from Aeromonas hydrophila[J]. Biochem J， 2008， 414（1）： 151-159.