新創制豫南黑香糯米的營養特性分析

李春英，劉慧鴿，喬云柯，曲姍姍，李俊周4，，李瑜，3

（1.河南農業大學食品科技學院,河南鄭州 450002；2.農業農村部大眾糧食加工重點實驗室,河南鄭州 450002；3.鄭州市蔬菜加工貯藏與安全控制重點實驗室,河南鄭州 450002；4.河南省水稻生物學重點實驗室,河南鄭州 450002；5.河南農業大學農學院,河南鄭州 450002）

水稻屬于禾本科（Poaceae/Gramineae）稻亞科（Oryzoideae）稻屬（OryzɑLinnɑeus）的一年生草本植物。水稻適應性廣,普遍分布于全球各稻區,稻米粉具有低致敏性、低鈉、易消化等優點,全球以水稻替代小麥粉備受關注。糙米的果皮和種皮約占2%,糊粉層占5%～6%,胚占2.5%～3.5%,胚乳占88%～93%,維生素[1]、礦物質、必需氨基酸以及酚酸、γ-谷維素、γ-氨基丁酸等大部分的生物活性物質都在胚芽和種皮中[2],具有抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等生物功效。黑香糯米是聚合色稻、濃郁芳香氣味的香稻和糯稻多種性狀的特種稻,蒸煮后米飯紫黑晶瑩,濃郁芳香,口感軟糯有彈性；冷飯具有不易回生的特點[6]。黑香糯米因其營養豐富,多食具有健脾暖肝、明目活血、婦女產后虛弱、貧血、腎虛等補養作用,被譽為“黑珍珠”、“補血米”、“長壽米”[7]。

河南省水稻主產區地處豫南的亞熱帶向暖溫帶過渡區,適合種植特種稻。近年來,水稻種質資源也向外觀好、食味佳、富含礦物質、富含花青素等功能性稻米變化,選育、研究和開發優質營養的功能性稻米符合中國水稻產業發展和市場需求。本研究對新創制的4份豫南黑香糯米進行淀粉、花青素和礦質元素含量分析,以期篩選出精準功能營養特性的特種稻資源,為豫南稻區特種稻種質資源創新研究和利用提供新品系的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豫南黑香糯米（‘晉谷60 號’經6 代輻射誘變得到的已穩定的誘變株系）、‘日本晴’（‘NIP’、‘山彥’與‘幸風’雜交得到的粳稻品種）:2021 年河南農業大學農學院水稻研究組提供。‘NIP’為白米對照樣品,‘LN48-2’、‘LN48-3’、‘LN54’、‘LN55’是經‘LN56 CK’輻射誘變得到的新品種。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3,5-二葡萄糖苷（純度≥98%）、直鏈淀粉（CAS:9005-82-7）、支鏈淀粉（CAS:9037-22-3）:北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）:天津市四友精細化學品有限公司；正己烷、甲酸、碘化鉀、氫氧化鉀、無水乙醇、鹽酸、硝酸（均為分析純）:國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

掃描電子顯微鏡（S-3000N）:日立科學儀器有限公司；噴金儀（IS150）:江蘇雷博科學儀器有限公司；超高效液相色譜儀（Ultimate 3000）:上海硅儀生化科技有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-2600）:日本島津企業管理有限公司；微波消解儀（TANK 40）:山東海能未來技術集團股份有限公司；離心機（TDZ5-WS）:湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；等離子質譜儀（Agilent 700）:美國安捷倫科技有限公司；超細微粉碎機（FW80）:天津市泰斯特儀器有限公司；漩渦儀（VORTEX-5）:海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉制備

稻米采用超細微粉碎機粉碎制粉,過篩（80 目）,利用正己烷去脂處理后,干燥,獲得去脂米粉樣品,備用。

精確稱取3.00 g 米粉,0.4% KOH 浸泡20 min,4 000 r/min 離心10 min,棄去上清液,沉淀用蒸餾水洗滌至中性,過篩（200 目）,4 000 r/min 離心10 min,取出沉淀于45 ℃干燥,粉碎,過篩（100 目）,最終得到粗淀粉樣品,置于干燥器中常溫保存備用。

1.3.1.1 淀粉顆粒結構觀察

每份淀粉樣品用導電雙面膠帶紙固定在銅樣臺上,對淀粉樣品進行噴金,于掃描電子顯微鏡下觀察其淀粉顆粒形態。測試條件:加速電壓5.00 kV、放大倍數5 000 倍。

1.3.1.2 標準曲線繪制

準確稱取直鏈淀粉0.100 g 于燒杯中,加入1 mL無水乙醇分散淀粉后加入0.5 mol/L 氫氧化鉀溶液9 mL,在沸水浴中加熱糊化30 min,不斷攪拌使其完全溶解后加蒸餾水定容至100 mL,制得1 mg/mL 直鏈淀粉標準工作液。分別吸取直鏈淀粉標準工作液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,調pH 值至3.5,滴加顯色劑后加蒸餾水定容至100 mL,于400～800 nm 波段掃描,獲得吸收光譜圖,并用等吸收點作圖法確定直鏈淀粉的檢測波長。

準確稱取支鏈淀粉0.100 g 于燒杯中,參照直鏈淀粉標準工作液制作方法獲得1 mg/mL 支鏈淀粉標準工作液。分別吸取支鏈淀粉標準工作液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,用鹽酸調pH 值至3.5,滴加顯色劑后加蒸餾水定容至100 mL,利用紫外-可見分光光度計在400～800 nm 波段光譜掃描,獲得吸收光譜圖,并確定支鏈淀粉的檢測波長。

1.3.1.3 淀粉含量測定

精確稱取0.100 g 淀粉樣品,加入1 mL 無水乙醇分散淀粉后加入0.5 mol/L 氫氧化鉀溶液9 mL,在沸水浴中加熱糊化30 min,不斷攪拌使其完全溶解后轉移至100 mL 容量瓶中定容,制得1 mg/mL 的淀粉糊化液。吸取淀粉糊化液1 mL,加水后調pH 值至3.5,滴加1 mL 碘-碘化鉀試劑,定容至50 mL,并靜置30 min,測定其吸光度,根據回歸方程計算出直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。蒸餾水作為空白對照。

淀粉含量計算公式見公式（1）～（5）。

式中:Y粗為粗淀粉得率,%；m粗為堿浸法提取后的樣品質量,g；m米為稱取樣品米粉質量,g；m總為總淀粉含量,%；W直為直鏈淀粉含量,%；W支為支鏈淀粉含量,%；c1為根據直鏈淀粉回歸方程測得樣品溶液濃度,mg/mL；c2為根據支鏈淀粉回歸方程測得樣品溶液濃度,mg/mL；V為定容體積,mL；n為稀釋倍數；m為樣品提取后干燥淀粉質量,g；P為樣品淀粉純度,%。

1.3.2 花青素含量測定

花青素含量的測定參考Park 等[8]的方法,并稍作修改。精確稱取1.00 g 樣品,用20 mL 80% 甲醇（含0.1% HCl）溶液常溫提取24 h,4 000 r/min 離心10 min,取上清液用0.2μm 膜濾器過濾,用超高效液相色譜儀進行分析。色譜條件為檢測器:光二極管陣列檢測器（photo-diode array,PDA）；色譜柱Endeavorsil C18（520 nm）；進樣量5μL；流動相A:0.1% 三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）溶液,流動相B:甲醇（含0.1%TFA）,0 min 20%B,0.4 min 25%B,6.5 min 35%B,9 min 20%B,10 min 20%B,流速0.5 mL/min。

標準溶液利用80% 甲醇（含0.1% HCl）溶液配制為1 mg/mL,置于棕色瓶中,-20 ℃保存備用。

1.3.3 礦物質相對含量測定

準確稱取0.5 g 米粉,加入濃硝酸并放置微波消解儀進行消解,通過等離子質譜儀分析各種礦物質,使用匹配標準物質曲線求出每種礦物質相對含量。

1.4 數據處理

試驗重復3 次,以平均值±標準差表示,并采用Excel 2016 和SPSS 26.0 軟件進行數據處理和統計分析,通過單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）檢驗顯著性差異分析（P<0.05）,采用Origin 64 軟件分析數據并繪圖。

2 結果與分析

2.1 淀粉結果分析

2.1.1 淀粉提取

堿浸法提取所得粗淀粉樣品如圖1 所示。

圖1 豫南黑香糯米粗淀粉Fig.1 Crude starch extracted from Yunan black fragrant glutinous rice

由圖1 可知,除‘LN48-2’的淀粉樣品中混有少量色素外,其余淀粉樣品的色澤潔白、顆粒大小比較均勻。

2.1.2 淀粉結構

創新豫南黑香糯米提取的淀粉顆粒用掃描電子顯微鏡進行形態和顆粒大小觀測,結果如圖2 所示。

圖2 豫南特種稻黑香糯米淀粉掃描電子顯微鏡圖（5 000×）Fig.2 Scanning electron microscope（SEM）image of rice starches from Yunan black fragrant glutinous rice（5 000×）

由圖2 可知,各品系間淀粉顆粒的形狀和大小差異不明顯,均表現出淀粉顆粒形狀為不規則多角形,棱角分明,大小不一。淀粉顆粒表面觀察到一些溝壑,可能是機械力造成,因為采用高速萬能粉碎機結合篩分的方式獲得的米粉,破損淀粉含量增加,而且淀粉粒度越小,損傷越多[9]。研究報道,從米粉的制作過程中超細微粉碎到淀粉的超聲提取,都有可能造成淀粉顆粒大小不均勻、顆粒表面粗糙、顆粒內部層狀結構的出現[10-11]。淀粉顆粒表面出現的空洞可能是淀粉提取過程中使用的堿造成的一定程度的損傷[12]。

2.1.3 淀粉含量

黑香糯米粉的粗淀粉得率、總淀粉含量和淀粉純度對比如圖3 所示。

圖3 豫南黑香糯米粗淀粉得率、總淀粉含量和淀粉純度對比Fig.3 Comparison of crude starch yield，total starch content and starch purity from Yunan black fragrant glutinous rice

由圖3 可知,黑香糯米粉的粗淀粉得率（52.8%～60.7%）低于‘NIP’（71.2%）。黑香糯米中‘LN54’的粗淀粉得率最高,達60.7%；‘LN48-3’的粗淀粉得率最低,為52.8%；對照‘LN56 CK’的粗淀粉得率為54.3%。黑香糯米粉的總淀粉含量（36.5%～50.2%）低于‘NIP’（64.7%）,其中‘LN54’的淀粉含量（50.2%）最高,‘LN48-3’的淀粉含量（36.5%）最低,對照‘LN56 CK’的淀粉含量為47.0%。通過堿浸法獲得淀粉純度分析,發現‘NIP’的提取純度高達90% 以上,‘LN55’、‘LN54’和‘LN56 CK’的純度達80%以上,而‘LN48’系列品系的淀粉純度低,只有70%左右。

2.1.4 淀粉組成

直鏈淀粉和支鏈淀粉的標準溶液通過紫外-可見分光光度計在400～800 nm 波段進行掃描,根據雙波長測定原理,將掃描圖譜進行繪圖,結果如圖4 所示。

圖4 直鏈淀粉和支鏈淀粉雙波長掃描光譜Fig.4 Dual-wavelength scanning spectra of amylose and amylopectin

由圖4 可知,直鏈淀粉的最大吸收波長為620 nm,支鏈淀粉的最大吸收波長為530 nm。根據最大吸收波長繪出的直鏈淀粉和支鏈淀粉的參比波長分別是429 nm 和749 nm。因此,測定直鏈淀粉含量的雙波長分別為λmax620 nm、λ參比429 nm,測定支鏈淀粉含量的雙波長分別為λmax530 nm、λ參比749 nm。

直鏈淀粉和支鏈淀粉的掃描光譜和標準曲線分別如圖5、圖6 所示。

圖5 直鏈淀粉掃描光譜和標準曲線Fig.5 Scanning spectrum and standard curve of amylose

圖6 支鏈淀粉掃描光譜和標準曲線Fig.6 Scanning spectrum and standard curve of amylopectin

由圖5 可知,根據不同濃度的直鏈淀粉標準溶液在最大吸收波長620 nm 處和參比波長429 nm 處的吸光度,求出兩波長下的吸光度差值（△A）=A620nm-A429nm,繪制出直鏈淀粉的標準曲線,得到回歸方程y=20.423x-0.003 2,R2=0.999 4。由圖6 可知,根據不同濃度支鏈淀粉標準溶液在最大吸收波長530 nm 處和參比波長749 nm 處的吸光度,求出兩波長下的吸光度差值（△A）=A530nm-A749nm,繪制出支鏈淀粉的標準曲線,其回歸方程y=5.403 9x-0.001 2,R2=0.999 8。

豫南黑香糯米的淀粉組成及其含量和含量分布如圖7 所示。

圖7 豫南黑香糯米的淀粉組成及其含量和含量分布Fig.7 Starch composition，content and distribution of Yunan black fragrant glutinous rice in southern Henan

由圖7 可知,新創制的不同品種的黑香糯米中支鏈淀粉的組成及其含量差異顯著。‘LN54’、‘LN55’和‘LN56 CK’由支鏈淀粉組成,直鏈淀粉含量幾乎為零。‘LN48’系列品系和‘NIP’中提取的淀粉中支鏈淀粉分別約占84.0% 和88.0%,直鏈淀粉分別約占16.0% 和12.0%。新創制的4 個品系中‘LN54’與對照‘NIP’和‘LN56 CK’以直鏈淀粉和支鏈淀粉含量繪制分布,可清晰地觀察到‘LN54’、‘LN55’和黑香糯米對照‘LN56 CK’的直鏈淀粉和支鏈淀粉的分布特性相同,而‘LN48-2’和‘LN48-3’的直鏈淀粉和支鏈淀粉分布特性相似,更接近對照‘NIP’的淀粉組成和分布。

豫南黑香糯米的淀粉反應體系掃描光譜如圖8所示。

圖8 豫南黑香糯米的淀粉反應體系掃描光譜Fig.8 Scan spectrum of starch reaction system of Yunan black fragrant glutinous rice

由圖8 可知,通過對淀粉反應體系進行波長掃描,進一步證實了‘LN54’、‘LN55’的糯性和‘LN56 CK’相同。‘LN54’、‘LN55’和‘LN56 CK’均在520 nm 處出現最大吸收峰,‘LN48’系列品系和‘NIP’則在570 nm 處出現了最大吸收峰。推測這可能是由淀粉的組成直鏈淀粉和支鏈淀粉的組成比例不同所致。‘LN54’、‘LN55’和‘LN56 CK’中幾乎不含直鏈淀粉,其淀粉的反應體系最大吸收峰出現在支鏈淀粉的最大吸收波長520 nm 處。‘LN48’系列和‘NIP’中均含有約14%左右的直鏈淀粉,導致‘LN48’系列品系與‘NIP’淀粉的反應體系的最大吸收峰出現在570 nm 處。

2.2 花青素含量

新創制的5 種黑香糯米花青素在520 nm 波長下的超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography,UPLC）如圖9 所示。

圖9 豫南黑香糯米花青素在520 nm 處的UPLCFig.9 UPLC of anthocyanin from Yunan black fragrant glutinous rice at 520 nm

豫南黑香糯米花青素的色譜特性如表1 所示,花青素含量如圖10 所示。

表1 豫南黑香糯米花青素的色譜特性Table 1 Chromatographic characteristics of anchocyanins in Yunan black fragrant glutinous rice

圖10 豫南黑香糯米花青素含量Fig.10 Contents of anthocyanins from Yunan black fragrant glutinous rice

由圖9 和表1 可知,豫南黑香糯米色中檢測到4 種花青素,分別為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷（cyanin-3,5-di-O-glucoside）,保留時間為5.34 min；天竺葵素3,5-二葡萄糖苷（pelargonidin-3,5-di-O-glucoside）,保留時間為6.65 min；矢車菊-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glu-coside）,保留時間為9.40 min；芍藥素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）,保留時間為19.26 min。其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量最高,相對含量平均值達90%,其次是芍藥素-3-O-葡萄糖苷,相對含量達8%～10%。由此可見,豫南黑香糯米花青素主要是由矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷構成。

由圖10 可知,‘LN48-3’品系的總花青素含量最高,為109.29 mg/100 g,其中,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量99.25 mg/100 g,芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量為9.09 mg/100 g。其次是對照‘LN56 CK’（104.45 mg/100 g）,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量分別為95.45 mg/100 g 和8.12 mg/100 g。‘LN48-2’和‘LN55’的花青素含量較低,分別為84.39 mg/100 g和87.15 mg/100 g,其矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量分別為76.02 mg/100 g 和78.00 mg/100 g。紫米的花青素組成以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為主,占總花青素的90%以上,芍藥素-3-O-葡萄糖苷占10%左右,而紅米中檢不出花青素[13-14]。Pengkumsri 等[15]的研究報道中指出,泰國品種黑米利用含1% 鹽酸的甲醇提取物中,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷占了26.7%,芍藥素-3-O-葡萄糖苷占了53.8%。有色稻米的花青素組分含量不同跟稻米品種關系密切。

2.3 礦物質相對含量

豫南黑香糯米礦物質相對含量如圖11 所示。

圖11 豫南黑香糯米礦物質相對含量Fig.11 Relative contents of minerals in Yunan black fragrant glutinous rice

由圖11 可知,黑香糯米的礦物質含量明顯高于‘NIP’普通稻米,其中,創制的豫南黑香糯米中Ca、Mn、Zn 等礦物質含量明顯高于對照‘LN56 CK’,可作為培育礦物質特種米或加工成高礦物質功能性米制品的重要原材料。‘LN48-2’和‘LN54’的Ca 和Zn 含量明顯高于‘LN56 CK’,Ca 含量分別是‘LN56 CK’的約5 倍和3.5 倍,Zn 含量分別是‘LN56 CK’的約2.7 倍和2.5 倍。‘LN48-3’和‘LN54’的Mn 含量明顯高于‘LN56 CK’,分別高于‘LN56 CK’26.5%和32.6%。‘LN56 CK’的Fe 含量明顯高于‘NIP’59.4%,‘LN48-2’的Fe 含量也明顯高于‘NIP’50.0%。礦物質是人體中含量少,但非常重要的微量營養素,膳食結構的不平衡,容易造成人體礦物質營養素的缺乏。一般情況下,黑米的Fe、Zn 等礦物質含量顯著高于普通稻米[16]。黑米可作為人體獲取礦物質重要的途徑[17]。

近年來,特種稻作為具有特殊利用價值的水稻品種而不斷擴展種質資源,對于特種稻營養功能的研究也逐漸深入。研究表明,特種稻中Ca、Fe、Zn 等礦物質含量普遍高于白米對照[18]。豫南稻區特種稻的礦質元素含量分析結果,Ca 含量普遍較高,變幅范圍在161.5～384.0 mg/kg[19]。高鈣天然配方米品種‘云光109’的Ca 含量為166 mg/kg[20]。綜合對黑米和白米礦質元素含量的比較分析文章中指出,黑米中尤以Fe、Zn 微量元素,含量顯著高于白米[21]。國際水稻所培育的富鐵水稻‘IR164’中Fe 含量為25 mg/kg,上海‘黑糯2’的Fe 含量高達21.9 mg/kg,被稱之為“富鐵米”,‘黑香糯米193’和‘黑糯2’中Zn 含量也高達24 mg/kg 以上,被認為是一種“富鋅米”[19]。本研究結果,‘LN48-2’的Ca 含量高達1 370.8 mg/kg,‘LN54’為956.3 mg/kg,‘LN55’為557.2 mg/kg,均可稱之為“富鈣米”品系。‘LN56 CK’對照品種的Fe 含量高達87.57 mg/kg,創新品系的Fe 含量變幅范圍為57.0～82.3 mg/kg,均高于“富鐵米”‘水稻IR164’品種。‘LN56 CK’對照品種的Zn 含量為22.3 mg/kg,而‘LN48-2’和‘LN54’中Zn 含量分別為60.3 mg/kg 和55.2 mg/kg,‘LN48 - 3’和‘LN55’中也含有31.6 mg/kg 和39.4 mg/kg,均高于“富鋅米”品種。

3 結論

本研究根據新創制的適合河南地區南部種植的豫南黑香糯米,通過田間性狀和產量的篩選,選出優異的4 份豫南黑香糯米品系。通過對淀粉、花青素和礦物質等豫南黑香糯米典型營養特性指標的分析,結果表明,黑香糯米的總淀粉含量顯著低于‘日本晴’（‘NIP’,白米）,且淀粉的提取率和提取的淀粉純度均顯著低于‘日本晴’,這與黑香糯米殼中分布豐富的多酚類、花青素、膳食纖維有關。新創制的豫南黑香糯米淀粉顆粒結構與日本晴沒有顯著差異。黑香糯米品系不同,淀粉的組成有顯著差異,‘LN48-2’和‘LN48-3’品系接近‘日本晴’的淀粉組成,直鏈淀粉含量約在14% 左右,而‘LN54’和‘LN55’品系與‘LN56 CK’品種的淀粉組成相同,直鏈淀粉含量不到1%,具有典型的糯稻特性。黑香糯米品系間的花青素含量差異顯著,但其組成相同,含有90%以上的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷,且黑香糯米中富含Ca、Fe、Zn 等多種礦物質營養素,是優質的“富鈣米”、“富鐵米”、“富鋅米”。

綜上所述,黑香糯米的營養價值高,根據淀粉特性選擇不同的加工方式生產出適合的產品,可推動特種稻的發展。