重復分批發酵與泡沫分離耦合生產多粘菌素E

李思雨，孟之超，鄭輝杰

（河北工業大學化工學院,天津 300401）

隨著生活水平的不斷提高,人們對食品健康安全越來越重視。在畜牧養殖業中,抗生素被大量應用于畜禽生病治療和提高抗病能力上,當這些畜禽被制作成食品時,就要考慮這些食品被食用后,畜禽類體內殘留的抗生素是否會影響到人類健康。多粘菌素E 是一種對革蘭氏陰性菌有很強抗菌作用的多肽類抗生素[1],其所含毒性不大,安全性較高,多粘菌素E 不易被人體腸道吸收,但能被畜禽吸收降解,作為飼料添加劑能夠促進畜禽生長,且在體內的藥物殘留率低。現今多粘菌素E 作為一種安全的添加劑用于食用的畜禽的飼料中,提高了多粘菌素E 的需求量。因此,為滿足市場需求,提高多粘菌素E 產量變得尤為重要[2-3]。

近年來,人們在提高多粘菌素E 產量上進行了許多研究:1）利用高通量策略篩選多粘菌素E 高產菌株[4]；2）優化發酵培養基[5],如Yu 等[6]用淀粉代替葡萄糖,優化多粘菌素E 發酵培養基,通過影響多粘菌素E生物合成的相關基因表達促進了多粘菌素E 的產生和多粘類芽孢桿菌的生長；3）改變發酵方式[7],如董凱等[8]采用分批補料的方式進行生產,提高了多粘菌素E的產量。而重復分批發酵的方式還未應用于多粘菌素E 的生產上,重復分批發酵通過定期去除發酵液并添加新鮮培養基的方式,來提高產物產量[9]。此發酵方法可縮短發酵的前期準備時間,延長發酵中產物的生產時間[10]。

發酵液的大量置換,會減少培養基中的菌種含量進而影響生產,故應選取合適的分離方法將發酵液中的菌種與產物分離,使含有菌種的部分發酵液重新進入重復分批發酵中。常用分離方法有色譜分離法[11]、大孔樹脂吸附法[12]、萃取分離法[13]和沉淀分離法[14],但是這些分離方法大多會對菌體造成損傷且難以與發酵耦合,分離出的菌體無法繼續應用于發酵生產。泡沫分離是在物質具有表面活性的基礎上,通過通氣產生氣泡,使需分離的物質吸附在氣液界面隨泡沫吹出,從而達到濃縮分離產物的目的。此分離方法具有分離條件溫和、設備機械部件少、易于工業放大等優點[15-16]。使用泡沫分離方法分離產物,對發酵液內的菌種傷害較小,且設備裝置簡單,易與發酵結合,泡沫分離法應用的前提是分離物質需為具有表面活性的物質,而多粘菌素E 具有表面活性可應用泡沫分離進行產物分離[17]。故可將重復分批發酵與泡沫分離耦合應用于生產分離多粘菌素E。

本研究的目的是通過重復分批發酵與泡沫分離耦合提高多粘菌素E 的產量并從發酵液中濃縮富集多粘菌素E。在發酵過程中加入非離子表面活性劑吐溫80,有試驗證明吐溫80 可以提高細菌素的產量,表面活性劑的添加也能夠提高起泡性和泡沫穩定性[18-19]。本文對發酵液的置換時間和置換比例進行優化,在此基礎上優化吐溫80 的添加時間和添加量,并確定氣體體積流量對多粘菌素E 分離的影響。在最優條件下將重復分批發酵與泡沫分離耦合,以細胞干重和多粘菌素E 效價為指標,探究耦合發酵分離方法對多粘菌素E 產量的影響。本文采用重復補料分批發酵和泡沫分離耦合的方法生產多粘菌素E,以解除產物抑制,簡化分離工序,促進多粘菌素E 生產,以期為多粘菌素E 的生產分離工藝提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多粘菌素E 生產菌多粘類芽孢桿菌（Bɑcilluspolymyxɑ）由河北工業大學生物工程系菌種保藏室提供；磷酸二氫鉀、蛋白胨、葡萄糖（均為分析純）:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、氨水（均為分析純）、乙腈（色譜純）:天津市科密歐化學試劑有限公司；吐溫80（分析純）:上海麥克林生化科技有限公司；硫酸銨、硫酸亞鐵（均為分析純）:天津市風船化學試劑科技有限公司；酵母浸粉（分析純）:北京奧博星生物技術有限責任公司；硫酸多粘菌素E 標準品（分析純）:河北圣雪大成制藥有限責任公司。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV-1100）:上海美譜達儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器（85-2A）:杭州儀表電機有限公司；高效液相色譜儀（LC-20A）:島津企業管理（中國）有限公司；發酵設備:河北工業大學發酵與生物分離工程實驗室自制；臺式高速離心機（3K18）:美國Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的制備

多粘類芽孢桿菌活化培養基:葡萄糖10 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨1 g/L,氯化鈉1 g/L。氨水調節pH值至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

多粘類芽孢桿菌種子培養基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉40 g/L,氯化鈉1 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L。氨水調節pH 值至6.8,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

多粘類芽孢桿菌發酵培養基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,硫酸銨10 g/L,氯化鈉1 g/L,硫酸亞鐵0.1 g/L,磷酸二氫鉀0.1 g/L。氨水調節pH 值至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 多粘類芽孢桿菌細胞干重測定

生物量與吸光值（OD600）的標準曲線繪制:在32 ℃、200 r/min 條件下搖瓶培養多粘類芽孢桿菌發酵液,從發酵開始到發酵結束,每1 h 取兩份發酵液樣品,待發酵液OD600值不再增大后停止取樣。一份樣品進行適當稀釋,在波長600 nm 下,測定吸光值。另一份樣品取5 mL 放入10 mL 已稱重的干燥離心管中,離心管質量為m1,放入高速離心機中,10 000 r/min 離心10 min 后取出上清液,再加入適當生理鹽水洗滌,同樣方法離心兩次后放入烘箱中在100 ℃條件下至完全干燥,稱重,質量記為m2。樣品的干重（dry cell weight,DCW）m=m2-m1。

細胞干重（y）與吸光值（x）的關系:y=12.43x+0.03,R2=0.998。通過測定600 nm 波長下的吸光值得到相應的細胞干重。

1.3.2.2 多粘菌素E 效價測定

利用高效液相色譜法定量檢測多粘菌素E 效價,使用色譜柱C18（160 mm×4.6 mm×3.5μm）,流動相為乙腈-無水硫酸鈉溶液,取多粘菌素E 標準品用稀硫酸稀釋至合適的濃度梯度,在波長215 nm、流速1 mL/min 條件下測定峰面積,將多粘菌素E 效價與其對應峰面積擬合標準曲線,得到多粘菌素E 效價（Y）與峰面積（X）的關系:Y=3.76X+393.01,R2=0.996。

1.3.2.3 泡沫分離性能評價

多粘菌素E 的泡沫分離效率用富集比（F）和回收率（R,%）評價,計算公式如下。

F=Tf/Ti

R=TfVf/TiVi

式中:Tf為泡沫液中多粘菌素E 效價,U/mL；Ti為發酵原液中多粘菌素E 效價,U/mL；Vf為泡沫液的體積,mL；Vi為發酵原液的體積,mL。

1.3.3 重復分批發酵條件的選擇

1.3.3.1 多粘類芽孢桿菌發酵

刮取斜面中的多粘類芽孢桿菌菌種接種于種子液中,在33 ℃、200 r/min 的搖床中培養24 h 后,將種子液以10%（體積比）的比例加入發酵液中,在32 ℃、200 r/min 的條件下搖床培養72 h,每4 h 取樣測定細胞干重和多粘菌素E 效價,繪制多粘類芽孢桿菌發酵生長曲線,初步選定重復分批發酵的置換時間。

1.3.3.2 重復分批發酵置換時間的確定

將300 mL 發酵液置于500 mL 搖瓶中發酵確定發酵液置換時間點分別為第24、36、48 小時,發酵置換比例設定為70%,發酵72 h,每6 h 從發酵液中取1 次樣,測定多粘菌素E 效價,探究發酵液置換時間對多粘菌素E 產量的影響。

1.3.3.3 重復分批發酵置換比例的確定

將300 mL 發酵液置于500 mL 搖瓶中,在32 ℃、200 r/min 的條件下進行發酵培養,在發酵的第36 小時進行發酵液置換,置換比例分別為50%、60%、70%、80%。每12 h 從發酵液中取1 次樣,測定多粘菌素E效價和多粘類芽孢桿菌細胞干重,探究發酵液置換比例對多粘菌素E 產量的影響。

1.3.3.4 吐溫80 添加時間的確定

將300 mL 發酵液置于500 mL 搖瓶中,在32 ℃、200 r/min 的條件下進行發酵培養,吐溫80 添加時間設定為第1 次發酵的第0、8、16、24、32 小時和置換后的第0、3、6、9 小時,吐溫80 添加量為0.15%。以不添加吐溫80 的發酵液作為對照組,分別在發酵液第1 次置換的第36 小時和置換后的第12 小時取樣,測定多粘菌素E 效價和細胞干重,探究吐溫80 添加時間對多粘菌素E 產量的影響。

1.3.3.5 吐溫80 添加量的確定

將300 mL 發酵液置于500 mL 搖瓶中,在32 ℃、200 r/min 的條件下進行發酵培養,在發酵的第24 小時添加吐溫80,吐溫80 添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%,在第36 小時取樣,測定多粘菌素E 的效價和多粘類芽孢桿菌的細胞干重,探究吐溫80 添加量對多粘菌素E 產量的影響。

1.3.4 泡沫分離氣體體積流量的選擇

將置換出的含有吐溫80 的發酵液導入泡沫分離塔中,氣體體積流量分別為40、60、80、100、120 mL/min,進行泡沫分離并測定富集比和回收率,探究氣體體積流量對多粘菌素E 分離效率的影響。

1.3.5 重復分批發酵與泡沫分離耦合裝置的構建

構建重復分批發酵與泡沫分離耦合裝置如圖1 所示,發酵罐的體積為1 L,裝液量為900 mL,將發酵罐與泡沫分離塔用蠕動泵連接,形成循環回流密閉裝置生產多粘菌素E,并在發酵罐上連接裝有新鮮發酵液的錐形瓶用于補充培養基,發酵罐上含有進料口、發酵液泵出口、殘液回流口和取樣口,以滿足試驗中發酵液置換、補料和取樣的要求。將發酵罐放在恒溫加熱磁力攪拌器上,發酵罐中放入轉子,發酵罐具有溫度檢測、pH 值檢測裝置放置處,以滿足發酵條件檢測需求,設置條件:溫度32 ℃、pH7、轉速200 r/min。及時補加氨水調節pH 值,將種子液以10%（體積比）的添加量加入發酵液中培養,在第36 小時進行耦合操作,首先將發酵液通過蠕動泵泵入泡沫分離塔中進行泡沫分離；在泡沫分離結束后,將殘液泵回發酵罐中,并將新鮮發酵液泵入發酵罐使發酵罐內發酵液含量至最初裝液量；然后繼續進行發酵至下次置換,并重復以上操作直至發酵結束。

圖1 重復分批發酵與泡沫分離耦合裝置圖Fig.1 Installation diagram of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation

1.3.6 重復分批發酵與泡沫分離耦合操作方法

在發酵培養的第24 小時和每次發酵液置換后的第6 小時向發酵罐中加入0.15%的吐溫80,并在發酵培養的第36 小時和每次發酵液置換后的第12 小時進行泡沫分離,在80 mL/min 的氣體體積流量下分離1 h后,將殘液泵回發酵罐中并添加新鮮培養基至初始容積,發酵過程中每12 h 測定1 次多粘菌素E 效價和細胞干重。

1.4 數據處理

所有試驗重復3 次,用Origin2023 進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌發酵結果

多粘類芽孢桿菌發酵過程見圖2。

圖2 多粘類芽孢桿菌發酵過程Fig.2 Fermentation process of Bacillus polymyxa

多粘類芽孢桿菌的發酵周期一般為48～72 h,由圖2 可知,在0～4 h 為多粘類芽孢桿菌細胞生長延滯期,細胞生長緩慢,多粘菌素E 產量也較低,在4～24 h為多粘類芽孢桿菌細胞生長對數期,此周期細胞生長迅速,但多粘菌素E 產量仍然較低；在24～40 h 為穩定期,此時菌體繁殖速度減弱,趨于平穩,在36 h 時多粘菌素E 產量大幅度上升至最高水平；在40 h 后菌體進入衰亡期,菌體停止生長并開始死亡,多粘菌素E 產量不再提高。多粘類芽孢桿菌發酵過程分為3 個不同時期:菌體繁殖期、分泌期和芽孢形成期[20],初步選定這3 個時期為發酵液置換時間點,即在發酵的第24、36、48 小時進行置換。

2.2 發酵液置換時間對多粘菌素E 效價的影響

表1 為不同發酵液置換時間點的多粘菌素E 效價,由于66、72 h 時的數據波動較小,故未列出。

表1 不同發酵液置換時間點的多粘菌素E 效價Table 1 Polymyxin E titer at different time points of fermentation broth replacement U/mL

由表1 可知,在3 個時間點進行置換,置換后效價都在置換后的第12 小時達到最高值,這是由于置換時發酵液中的多粘類芽孢桿菌含量遠高于初次接種量,并沒有明顯的生長延滯期,而是快速繁殖,分泌多粘菌素E。因此置換后選擇在第12 小時進行下次發酵液置換。在第36 小時進行發酵液置換,得到最高的多粘菌素E 產量為17 929.8 U/mL。這是因為在24 h 時處于多粘類芽孢桿菌發酵的菌體繁殖期,更換新的發酵液后,細菌不能快速適應新的環境,無法快速大量分泌多粘菌素E,且在此時期培養基內的營養物質還比較充足,置換培養基對發酵影響并不大。在48 h 時處于多粘類芽孢桿菌的芽孢形成期,此時菌體開始走向衰老,活性減小,不能很好地適應新的培養環境,此時置換發酵液會造成菌體的大量死亡,以致產量大大降低,所以置換后產量較其他置換時間點偏低。在36 h 時處于多粘類芽孢桿菌發酵的分泌期,即大多處于多粘類芽孢桿菌的穩定期,此時多粘菌素E 產量達到最高,且發酵液中營養物質被大量利用。此時更換發酵液,穩定期的細菌快速適應新的培養環境,細菌開始下一批生長繁殖,在穩定期進行置換時發酵罐中處于穩定期的細胞多于對數期和衰亡期,更有利于大量分泌多粘菌素E。故選擇在36 h 進行第1 次置換,之后每12 小時置換一次,直至多粘菌素E 產量降低。

2.3 發酵液置換比例對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響

發酵液置換比例對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響見圖3。

圖3 發酵液置換比例對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響Fig.3 Effect of replacement ratio of fermentation broth on polymyxin E titer and cell dry weight

由圖3A 可知,當置換比例為50%時,置換后多粘菌素E 產量均低于初始發酵中多粘菌素E 產量,在4 次循環后產量更是大大減小。且多粘類芽孢桿菌細胞濃度也逐漸下降,第3 次循環時得到置換中的最高細胞干重為5.63 g/L,遠低于第1 次發酵液中多粘類芽孢桿菌濃度（10.21 g/L）。這是因為多粘菌素E 的大量積累對多粘類芽孢桿菌造成產物抑制[21],而置換比例為50%時,置換后的發酵液中多粘菌素E 含量仍較高,產物抑制并沒有得到很大緩解,抑制了多粘菌素E 產量的增加。由圖3B 可知,當置換比例為60%時,置換后多粘菌素E 產量比置換比例50%時有所提高,在4 次循環后產量也大幅下降。由圖3C 可知,當置換比例為70%時,置換后多粘菌素E 產量在前5 次循環時都較為穩定且較高,分別為19 272.64、19 242.5、19 749.9、21 698.5、18 131.5 U/mL。第6 次循環時多粘菌素E 產量為17 023.5 U/mL 較前幾次循環的多粘菌素E 雖有所降低,但仍高于50%、60%時的多粘菌素E 產量。多粘類芽孢桿菌細胞干重分別為10.32、10.30、10.25、10.45、9.96、8.59 g/L,可知細胞能很快適應新的培養環境,快速繁殖。由圖3D 可知,置換比例為80%時,6 次循環的多粘菌素E 產量分別為18 624.2、16 388.6、16 384.2、17 096.4、15 510.3、14 987.2 U/mL,多粘類芽孢桿菌細胞干重分別為10.45、9.59、9.77、9.84、8.70、8.09 g/L,相較于置換比例為70%時,多粘菌素E 濃度和菌種含量均有所下降,這是因為置換比例變高后,新置換的發酵液內菌種含量減少,與置換比例70%相比,發酵液內穩定期的細菌含量以及對新培養環境的適應能力均降低。在置換比例為70%,最高的多粘菌素E產量出現在第4 次循環,之后產量開始逐漸降低,在第6 次循環后多粘類芽孢桿菌發酵能力開始出現明顯下降。綜上,多粘類芽孢桿菌重復分批發酵可穩定循環6 次,置換比例為70%時效果最好。故選擇發酵液置換比例為70%,重復分批發酵循環6 次后終止。

2.4 吐溫80 添加時間對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響

吐溫80 添加時間對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響見圖4。

圖4 吐溫80 添加時間對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響Fig.4 Effect of addition time of Tween 80 on polymyxin E titer and cell dry weight

由圖4A 可知,不添加吐溫80 的對照組的多粘菌素E 效價為17 879.9 U/mL,細胞干重為9.99 g/L。在發酵液置換前的第0、8、16、24、32 小時加入吐溫80 所獲得的多粘菌素E 效價分別為16 095.9、20 109.6、20 449.2、22 952.1、22 384.6 U/mL,細胞干重分別為6.35、7.53、7.54、9.62、9.77 g/L。Reese 等[22]研究表明吐溫80 加入發酵液中可提高細菌素產物的產量,而多粘菌素E 為氨基酸構成的多肽[23],也應在發酵液中加入吐溫80,以提高其產量。且與對照組相比,在發酵液置換前0 h添加吐溫80 的多黏菌素E 產量卻大大減少,且添加吐溫80 后的細菌含量均低于對照組的細胞干重,這是因為吐溫80 添加時細菌所處的生長時期不同,吐溫80 的加入可以增加細胞膜的通透性,這可以增加多粘菌素E 向胞外分泌,提高多粘菌素E 產量,但在發酵初期多粘類芽孢桿菌處于生長的延滯期,細菌受外界環境影響較其他時期更大,使菌體的生長受到抑制,從而使產量大大減小,發酵液置換前8、16 h 時處于細菌生長的對數期,也會影響菌體的生長,此時產量雖然得到了提高,但會不利于進一步的重復分批發酵。而在發酵液置換前24、32 h 時,細菌生長已經進入了穩定期,吐溫80 的加入對多粘類芽孢桿菌的繁殖存活影響很小,且產量大大增加。故選擇發酵液置換前24 h 作為吐溫80 添加時間。同理,由圖4B 可知,應選擇發酵液置換后第6 小時作為吐溫80 添加時間。

2.5 吐溫80 添加量對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響

吐溫80 添加量對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響見圖5。

圖5 吐溫80 添加量對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響Fig.5 Effect of Tween 80 addition on polymyxin E titer and cell dry weight

由圖5 可知,隨著吐溫80 添加量從0.05%增加到0.15%時,多粘類芽孢桿菌的細胞膜通透性逐漸增強,促進多粘菌素E 向胞外分泌,提高了多粘菌素E 的產量。吐溫80 添加量為0.15%～0.30%時,吐溫80 在培養基中的占比過多,使培養基過于黏稠,不利于營養物質被吸收利用,從而影響多粘菌素E 的生產。因此本研究中最佳吐溫80 添加量為0.15%。

2.6 氣體體積流量對泡沫分離的影響

氣體體積流量對多粘菌素E 富集比和回收率的影響見圖6。

圖6 氣體體積流量對多粘菌素E 富集比和回收率的影響Fig.6 Effect of gas volumetric flow rate on enrichment ratio and recovery rate of polymyxin E

由圖6 可知,氣體體積流量從40 mL/min 增加到120 mL/min,多粘菌素E 的回收率從42.7% 增加至82.5%,多粘菌素E 的富集比從5.98 下降至3.66。在通氣后,發酵液中產生大量氣泡,而多粘菌素E 吸附在氣液界面,在浮力的作用下,這些吸附著多粘菌素E的氣泡不斷聚集上升,在液相表面形成泡沫,而泡沫中的各個氣泡以多面體形式相互堆疊,每個氣泡的接合處有著很薄的液體薄膜,這層薄膜和氣泡中含有液體,這些液體通常被稱為普朗特邊界層,這些液體會向著氣泡交界處的壓力最低點,即普朗特邊界層的交界處流動,使平面液膜變薄。當氣體體積流量逐漸增大,會使氣泡在泡沫分離塔的時間變短,泡沫排液時間變短,普朗特邊界層中的液體流失減少,氣泡間的夾帶液體增多[24]。且氣體體積流量的增大,產生了更多的氣泡,提供了更多的氣液界面,增大了多粘菌素E 的吸附面積。故增大氣體體積流量會增加泡沫中持液率,即回收率增大。氣體體積流量越大,消泡液的體積增大,消泡液中多粘菌素E 濃度相對減小,富集比減小,回收率增大。氣體體積流量越小,泡沫的停留時間越長,小氣泡不斷破碎形成大氣泡,氣液界面減少,排液時間變長,持液率減小,消泡液中多粘菌素E 濃度變大,富集比變大,回收率減小。當氣體體積流量為80 mL/min時,富集比為4.77,回收率為77.1%。進一步提高氣體體積流量,回收率增加變緩,而富集比仍然下降較快,故選擇氣體體積流量為80 mL/min 進行泡沫分離。

2.7 重復分批發酵耦合泡沫分離對多粘菌素E 細胞干重和效價的影響

重復分批發酵耦合泡沫分離對多粘菌素E 細胞干重的影響見圖7。

圖7 重復分批發酵耦合泡沫分離對多粘菌素E 細胞干重的影響Fig.7 Effect of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation on the dry weight of polymyxin E cells

由圖7 可知,在耦合組和對照組的細胞在重復分批發酵過程中每批次的生長趨勢相同,但耦合組細胞干重大于對照組。這是因為耦合組將泡沫分離殘液泵回了發酵罐中,殘液中含有一定量的多粘類芽孢桿菌,使耦合組中多粘類芽孢桿菌含量大于對照組,使其更能充分利用新加入的新鮮培養基,進行細胞傳代。發酵批次在第4 次時細胞干重達到最高,細胞干重為11.21 g/L。比對照組的細胞干重提高了16.4%。第4 批次后細胞干重開始下降,在第6 批次細胞干重大幅降低,這是因為在多次重復培養后,培養基中一些具有毒性的產物積聚,使細菌生長受到影響或產生表型變異,細菌無法一直保持快速增殖狀態,隨著細胞干重的逐漸降低,在發酵的6 批次后,已不適于再次進行置換發酵。

重復分批發酵耦合泡沫分離對多粘菌素E 效價的影響見圖8。

圖8 重復分批發酵耦合泡沫分離對多粘菌素E 效價的影響Fig.8 Effect of repeated batch fermentation coupled with foam fractionation on the titer of polymyxin E

由圖8 可知,耦合組置換后發酵液中的多粘菌素E 效價均高于對照組,在產量最高的第4 批次,耦合組的多粘菌素E 效價為28 034.4 U/mL,與對照組（21 768.8 U/mL）相比提高了28.8%。這是因為耦合組中的細胞含量高于對照組,處于分泌期的細胞含量較多,且更換的培養基相較于對照組較少,細胞更易適應新培養環境,減少因環境改變而發生的細胞表型變異。在第6 批次時,多粘菌素E 產量大大減少甚至遠低于第1 次發酵,是因為細胞含量減少,且部分細胞在多次傳代中生產活性降低。發酵罐內衰老菌體積累,芽孢逐漸增加,pH 值開始快速升高,不易控制,環境逐漸不利于產物合成。綜上,重復分批發酵在第6 批次時細胞干重和多粘菌素E 效價均大大降低,較對照組分別減少了7.5%和9.1%,在第6 批次后終止發酵。

6 個批次的對照組發酵液、耦合組發酵液和消泡液中多粘菌素E 效價對比見圖9。耦合組泡沫分離的富集比和回收率見表2。

表2 耦合組泡沫分離的富集比和回收率Table 2 Enrichment ratio and recovery rate of foam fractionation in coupling group

圖9 耦合組、對照組和消泡液中多粘菌素E 效價Fig.9 Titer of polymyxin E in coupling group，control group，and defoamer

由圖9 可知,在產量最高的第4 批次對照組中的多粘菌素E 效價為21 768.8 U/mL,耦合組中多粘菌素E效價為28 034.4 U/mL,消泡液中多粘菌素E 效價為133 706.1 U/mL。由表2 可知,在第4 批次多粘菌素E的富集比為4.77,回收率為82.5%。第1、2 批次與第6 批次之間,第4 批次與第5 批次之間不存在顯著差異,其余批次間均存在顯著差異,不同批次富集比較為接近,在第5 批次達到最高值。不同批次回收率較為接近,其中第1、2 批次與第6 批次之間無顯著差異,第3 批次與第4 批次之間差異顯著（P<0.05）,回收率在第4 批次達到最高。重復分批發酵耦合泡沫分離不僅提高了多粘菌素E 的產量還對多粘菌素E 進行了初步濃縮,有利于多粘菌素E 的分離利用。

3 結論

本文開發了重復分批發酵與泡沫分離相結合生產多粘菌素E 的工藝,并考察了吐溫80 的加入對多粘菌素E 效價和細胞干重的影響。對操作參數進行優化,試驗結果表明,發酵液最適置換比例為70%,置換時間分別為初次發酵的第36 小時和置換后發酵的第12 小時,置換后發酵時間縮短為初次發酵的三分之一。吐溫80 的最適添加量為0.15%,添加時間分別為初次發酵的第24 小時和置換后發酵的第6 小時,多粘菌素E效價為21 245.3 U/mL,較對照組（19 123.1 U/mL）提高了11%。泡沫分離的最適氣體體積流量為80 mL/min。將重復分批發酵與泡沫分離耦合在最佳條件下,可發酵6 個批次,多粘菌素E 效價分別為19 397.43、21 599.1、25 446.1、28 034.4、20 449.2、17 638.0 U/mL,均高于對照組,在耦合過程中富集比和回收率分別保持在4.7 和80%左右。結果表明,重復分批發酵與泡沫分離相結合生產多粘菌素E,既提高了產率又達到了多粘菌素E 的濃縮分離。重復分批發酵與泡沫分離相結合生產多粘菌素E 有利于長期生產性能的提高,對多粘菌素E 的工業化生產具有重要意義。