北蒼術固態發酵菌株的篩選、鑒定及發酵工藝優化

張悅，林瑛蘭，丁敏，李闊，鄒靜，常學東

（河北科技師范學院,河北秦皇島 066004）

北蒼術（Atrɑctylodeschinensis）為菊科植物北蒼術的干燥根莖,始載于《神農本草經》,藥用歷史悠久,以根莖入藥,屬祛濕類中藥[1]。北蒼術有著復雜的化學成分和顯著的藥理活性,其成分主要分為揮發性成分和非揮發性成分,具有調節腸道菌群、抗腫瘤、抑菌等多種藥理作用[2-4],其中多糖是非揮發性成分的主要物質。研究發現,近年來,蒼術多糖因其在增強機體免疫力、抗炎癥、抗病毒等方面的生物活性備受關注[5-7]。

微生物代謝活動具有增強中草藥的療效、產生新的活性成分、降低毒副作用、提高生物利用度等作用[8],研究表明,通過益生菌發酵中藥可促進有效成分的溶出和轉化、增加新的活性成分、增強藥效[9-12]。Zhang 等[9]采用乳酸菌、醋酸菌、酵母菌混合發酵制成的康普茶對玫瑰和棗仁進行發酵,結果表明具有鎮靜作用的典型功能物質6-阿魏酰肌肽的作用效果增加了7%,具有抗氧化功能的沒食子酸含量提升了15.9%。Chen 等[10]從土大黃的共生真菌尖孢鐮刀菌ZZP-R1 的發酵液中分離得到了2 種新的化合物:鐮刀菌素C（1）和D（2）,這2 種新型鐮刀菌素分別對金黃色葡葡球菌有較強和中等強度的抑制作用。陳鑫等[11]用白腐菌和產朊假絲酵母混茵對紅芪藥渣進行固態發酵生產蛋白飼料,通過優化發酵工藝使發酵產物中蛋白含量比原來提高101.16%,粗纖維含量比原來降低34.79%。

近年來,中草藥在疾病的預防和治療方面越來越受到國際醫療市場的認可,其發酵產品也逐漸成為世界需求的新趨勢,但是北蒼術發酵卻鮮有報道,本試驗從實驗室保存的67 株乳酸菌中篩選出3 株能在北蒼術生長且顯著提高北蒼術粗多糖得率的乳酸菌,然后通過單因素試驗及響應面試驗法優化北蒼術發酵工藝,提高粗多糖得率,并對發酵前后北蒼術粗多糖的抗氧化活性進行比較,以期為開發北蒼術應用提供途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

67 株菌株樣本:河北科技師范學院食品科技學院暨葡萄酒學院實驗室保藏菌株（從酒曲中分離,經初步鑒定為乳酸菌,編號G1～G40、H30～H40、DH10～DH27）；北蒼術（Atrɑctylodeschinensis）:河北荷花池藥業有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）（純度≥98%）、蒽酮、石油醚（60～90 ℃）、無水乙醇:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；濃硫酸:國藥集團上海試劑公司；鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、30%過氧化氫:天津市風船化學試劑科技有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

組織搗碎機（JJ-2）:江蘇科析儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV 2600A）:尤尼柯（上海）儀器有限公司；生化培養箱（SPX-250B-8）:上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；旋轉蒸發儀（N-1100）:上海愛朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北蒼術粗多糖得率測定

1.3.1.1 北蒼術粗多糖的提取

參考李夢依等[13]和許靜[14]的方法,并稍作修改,稱取北蒼術樣品5.0 g 于試管中,加入20 mL 95% 乙醇,靜置30 min,超聲30 min 后3 000 r/min 離心15 min,棄上清液,重復上述操作一次,于通風窗中隔夜揮干乙醇,得脫脂樣品。稱取脫脂樣品按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水超聲輔助提取30 min,沸水浴提取1 h。然后用6 層紗布趁熱過濾后于3 000 r/min 離心10 min得粗多糖提取液。旋蒸濃縮至5 mL 后加入4 倍體積95% 乙醇,4 ℃靜置24 h,于3 000 r/min 離心10 min,棄去上清液,沉淀清洗3 次,于干燥器中室溫放至恒重即得北蒼術粗多糖。

1.3.1.2 北蒼術粗多糖得率測定

采用蒽酮-硫酸法測定,首先繪制葡萄糖標準曲線,標準曲線方程為y=12.911x+0.011 9,R2=0.999 1,將1.3.1.1 中得到的北蒼術粗多糖加蒸餾水溶解,定容至100 mL,得供試溶液。將供試溶液進行稀釋,準確吸取稀釋后的溶液1 mL 于10 mL 干燥的試管中加入4 mL蒽酮-硫酸溶液,混勻,水浴加熱10 min,在625 nm 處測其吸光度,粗多糖得率（X,%）的計算公式如下[13]。

式中:C為樣品稀釋液中粗多糖濃度,mg/mL；N為稀釋倍數；V為樣品稀釋液體積,mL；m為北蒼術質量,g。

1.3.2 發酵菌株篩選

1.3.2.1 菌株活化及北蒼術固體培養基的配制

將保存的菌株樣本接至MRS 斜面培養基,37 ℃培養24 h,進行菌種活化。挑取1 環活化好的菌株接入50 mL 液體培養基中,37 ℃靜置培養24 h 作為種子發酵液備用。

北蒼術固體培養基:取適量北蒼術粉碎過40 目篩,60 ℃烘干至恒重,調節含水量至50% 作為北蒼術固體培養基,121 ℃高壓滅菌20 min,備用。

1.3.2.2 不同菌株在北蒼術固體培養基中繁殖能力測定

將待測的菌株以6% 的接種量接種種子發酵液,37 ℃恒溫培養3 d。參考史洪濤等[15]的方法,稍作修改。準確稱量10 g 發酵樣品,置于裝有100 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中,置于搖床150 r/min 搖30 min,制成1∶10 體積比的樣品勻液。吸取1 mL 樣品勻液做10 倍梯度稀釋,選取適宜梯度的稀釋液0.1 mL 注入到MRS 平板上均勻涂布,在37 ℃條件下倒置厭氧培養48 h。每個菌株做3 次平行,取平均值。發酵后北蒼術固體培養基活菌數（Y,CFU/g）的計算公式如下。

式中:n為同一稀釋度3 組平行的平均菌落數,CFU/g；N為稀釋倍數；m為平板中菌液添加量,g。

1.3.2.3 菌株復篩

以北蒼術粗多糖得率為篩選指標,將初篩得到的菌株分別以6%的接種量接種于1.3.2.1 配制的北蒼術固體培養基中,對照組按6% 接種量接種至北蒼術固體培養基,37 ℃培養3 d 后取出,60 ℃烘至恒重,研磨成粉后按1.3.1 中方法測定發酵前后北蒼術粗多糖得率,以多糖得率提高顯著為指標篩選目標菌株。

1.3.2.4 菌種鑒定

1）篩選出的3 株菌的生理生化鑒定試驗的方法參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[16]。

2）分子生物學鑒定:將篩選得到的菌株送往北京六合華大基因科技有限公司進行菌株的16S rDNA 序列測序。然后登錄GenBank 中的BLAST 程序比對測序菌株,選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA 序列,利用MEGA7 軟件中的鄰接算法構建系統發育樹。

1.3.3 發酵工藝單因素試驗設計

將1.3.1 篩選得到菌株以體積比1∶1∶1 接種到北蒼術固體培養基中,以北蒼術粗多糖得率為指標,分別考察含水量（20%、30%、40%、50%、60%）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、發酵時間（1、2、3、4、5 d）、發酵溫度（31、34、37、40、43 ℃）對北蒼術粗多糖得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上,選擇含水量（A）、接種量（B）以及發酵時間（C）3 個自變量,以發酵北蒼術粗多糖得率為響應值進行響應面優化試驗。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 抗氧化能力測定

分別配制濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的發酵前后兩種粗多糖溶液。

參考李夢依等[13]方法,稍作修改,分別配制濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的發酵前后兩種多糖溶液作為樣品液。吸取1 mL 樣品,加入2 mL 的DPPH 無水乙醇溶液（0.2 mmol/L）混勻,室溫避光靜置30 min,測定A517nm。按以下公式計算粗多糖的DPPH 自由基清除率（Y,%）。

式中:A0為等體積無水乙醇代替待測樣品,同樣處理測得的吸光度；A1為試驗組吸光度；A2為等體積無水乙醇代替DPPH 溶液,同樣處理測得的吸光度。

參考倪彩新等[17]方法,稍作修改,分別配制濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的發酵前后兩種多糖溶液作為樣品液。試管中依次加入1 mL 5 mmol/L 鄰菲羅比、2 mL 0.2 mmol/L PBS（pH7.4）緩沖液及1 mL 樣品液,充分混勻后,加入1 mL 5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液,混勻后,加入1 mL 0.1 mmol/L H2O2,于37 ℃水浴60 min 后,測定A536nm。按以下公式計算粗多糖的羥基自由基清除率（Y,%）。

式中:A0為等體積水代替待測樣品,同樣處理測得的吸光度；A1為等體積水分別代替待測樣品和H2O2,同樣處理測得的吸光度；A2為試驗組吸光度。

1.4 數據分析

每組試驗重復3 次,采用Excel 2010、SPSS 25.0 分析處理數據。利用t檢驗和方差分析進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 菌株初篩

將67 株乳酸菌接種到北蒼術固體培養基中培養3 d,通過平板計數法檢測菌落數量,結果見圖1。

圖1 不同菌株在北蒼術固體培養基中的菌落數Fig.1 Total bacterial count of different strains in the solid medium of Atractylodes chinensis

67 株菌中共有28 株能夠在北蒼術培養基中生長,由圖1 可知,其中11 株乳酸菌長勢較好,且菌落數均高于1.0×108CFU/g,其中菌落數最高為G32,達到1.13×109CFU/g,G36 最低,為1.20×108CFU/g。

2.1.2 菌株復篩

將初篩得到的11 株乳酸菌接種到北蒼術固體培養基中,測定發酵前后北蒼術粗多糖得率,結果見圖2。

圖2 不同菌株發酵對北蒼術的粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of different strains on polysaccharide yield of Atractylodes chinensis

由圖2 可知,發酵后北蒼術粗多糖得率均顯著高于未發酵組（P<0.05）。這可能是由于北蒼術中含有大量纖維素,為乳酸菌的生長提供了營養基質,誘導乳酸菌產生大量纖維素酶,分解北蒼術的細胞壁,使纖維素之間的酯鍵易斷裂而發生剝皮反應,促使北蒼術粗多糖從細胞壁或者蛋白復合體中游離出來,從而發酵后北蒼術粗多糖得率提高[18-19]；此外發酵后粗多糖得率提高也可能是因為發酵后粗多糖的水溶性優于未發酵粗多糖[20]。G1、G21、H38 3 株菌發酵的北蒼術粗多糖得率顯著高于其它乳酸菌（P<0.05）,H38 的得率最高,為9.60%。因此選定G1、G21、H38 作為北蒼術發酵的菌株。

2.1.3 菌株鑒定

2.1.3.1 形態觀察及生理生化試驗

為了進一步鑒定篩選出來的菌株G1、G21、H38,參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[16]進行生理生化試驗,結果見表2。

表2 3 株菌株的生理生化試驗結果Table 2 Physiological and biochemical tests of three strains

由表2 可知,3 株菌的革蘭氏染色和產淀粉酶試驗為陽性；吲哚試驗、甲基紅試驗、V-P 試驗、檸檬酸利用試驗、過氧化氫酶試驗均為陰性；且能利用淀粉酶。從中可以看出3 株菌具有乳酸菌應有的生理生化特征,因此可初步證明3 株菌株為乳酸菌。

2.1.3.2 分子生物學鑒定

將篩選得到的3 株乳酸菌進行16S rDNA 測序,將測序結果與NCBI 數據庫進行BLAST 同源性比對,并將菌株序列同源性高于99% 的菌株進行BLAST 分析,構建系統發育樹,結果見圖3。

圖3 基于16S rDNA 基因序列菌株G1、G21、H38 的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains G1，G21，H38 based on 16S rDNA gene sequence

結合生理生化試驗,可確定G1 為乳酸片球菌（Pediococcusɑcidilɑctici）,G21 和H38 為戊糖片球菌（Pediococcuspentosɑceus）。乳酸片球菌因其分泌具有抑菌效果的片球菌素在食品業具有廣泛的研究價值和應用前景[21]；戊糖片球菌對提高發酵食品的營養、風味及安全性具有重要作用,具有用于人類或動物的微生態制劑的開發潛力[22]。

2.2 北蒼術發酵條件的確定

2.2.1 單因素試驗分析

含水量、接種量、發酵時間、發酵溫度是影響固態發酵的重要因素,會影響微生物的生長、繁殖以及代謝產物的產生[23-25]。以粗多糖得率為衡量指標,確定上述4 個因素是否對北蒼術粗多糖得率有影響,結果見圖4。

圖4 不同因素對北蒼術粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of variables on polysaccharide yield of Atractylodes chinensis

從圖4 可以看出,發酵北蒼術含水量（圖4A）、接種量（圖4B）、發酵時間（圖4C）以及發酵溫度（圖4D）均是影響北蒼術粗多糖得率的影響因素。由圖4A 可知,粗多糖得率隨著含水量的增加先升高后降低,當含水量為50% 時,粗多糖得率達到最高；由圖4B 可知,粗多糖得率隨著接種量的增加先升高后降低,當接種量為6%時,粗多糖得率達到最高；由圖4C 可知,粗多糖得率隨著發酵時間的延長先升高后降低,當發酵時間為2 d 時,粗多糖得率達到最高。由圖4D 可以看出,粗多糖得率在37 ℃時達到最大,當發酵溫度高于37 ℃時粗多糖得率差異相較其它因素不顯著,繼續增加溫度會造成能源的浪費,也不利于優化工藝流程,而且從試驗結果看發酵溫度對多糖得率的影響不大,所以響應優化因素不再考慮發酵溫度。因此選含水量、接種量以及發酵時間為影響因素,利用響應面法進行最佳發酵工藝的優化,發酵溫度固定為37 ℃。

2.2.2 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果,發酵溫度固定為37 ℃,以北蒼術粗多糖得率為響應值,選擇含水量、接種量以及發酵時間3 個因素進行響應面試驗設計,并優化發酵關鍵工藝參數。北蒼術固體發酵工藝優化的響應面設計與結果見表3,方差分析見表4。

表3 不同因素水平下北蒼術發酵粗多糖得率Table 3 Effect of variables on polysaccharide yield of Atractylodes chinensis

表4 17 組試驗的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

根據表3 結果,利用Design-Expert 軟件建立發酵北蒼術粗多糖得率（Y）對含水量（A）、接種量（B）、發酵時間（C）的二次項回歸模型為Y=10.11-0.16A-0.21B+0.14C+0.16AB-0.21AC+0.35BC-1.14A2-0.65B2-0.86C2。

由表4 可知,由試驗數據所得模型的P<0.01,表示該模型極顯著,失擬項>0.05,不顯著,說明模型擬合程度好,可用來分析和預測北蒼術發酵的工藝條件。模型的一次項系數A和C對粗多糖得率影響不顯著,B影響顯著（P<0.05）；BC交互對粗多糖得率影響顯著（P<0.05）,AB和AC影響不顯著；二次項系數A2、B2和C2影響極顯著（P<0.01）。由F值可知,含水量、接種量和發酵時間對粗多糖得率的影響次序為接種量>含水量>發酵時間。

通過對北蒼術發酵的二次多項數學模型進行解析,北蒼術發酵的最佳工藝條件為含水量為49.15%、接種量為5.68%、發酵時間為2.06 d,在此參數下預測的粗多糖得率10.14%。

2.2.3 驗證試驗

在響應面法確定的發酵工藝條件下進行3 次驗證性試驗,北蒼術粗多糖得率平均為10.10%,與預測值的相對誤差為0.04%。考慮實際條件的可操作性,將條件適當調整為含水量為50%、接種量為5.5%、發酵時間為2 d。因此,利用響應面法優化出的提取工藝參數基本準確可靠。利用最優的發酵條件,比較了發酵前后北蒼術粗多糖得率,結果見圖5。

圖5 發酵工藝優化對北蒼術粗多糖得率的影響Fig.5 Effect of fermentation process optimization on polysaccharide yield of Atractylodes chinensis

由圖5 可知,發酵工藝優化后發酵北蒼術粗多糖得率顯著增加（P<0.05）,相比未發酵提高了37.45%,這可能是由于乳酸菌代謝產生的纖維素酶使粗多糖溶出導致得率上升,而3 種乳酸菌可能存在共生作用,代謝產物發生互補效應增加了北蒼術粗多糖得率[26]。

2.3 發酵對北蒼術粗多糖抗氧化性的影響

DPPH 自由基清除能力和羥自由基清除能力是衡量粗多糖抗氧化能力的常用指標。DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率越大,說明樣品的抗氧化性越強[27-28]。對發酵前后北蒼術粗多糖自由基清除能力進行比較,結果見表5。

表5 發酵前后北蒼術粗多糖自由基清除能力比較Table 5 Antioxidant activity of polysaccharides from Atractylodes chinensis before and after fermentation

如表5 所示,北蒼術粗多糖對DPPH 自由基和羥基自由基均具有清除能力,但是發酵后粗多糖對兩種自由基的清除率明顯高于發酵前,且表現出較強的濃度依賴性。這可能是因為發酵改變了北蒼術粗多糖的結構從而提高了抗氧化活性[28]。此外,馬升等[28]研究表明發酵可以改變金針菇菇根多糖的單糖組成,使具有較高抗氧化活性單糖的比例增加,因此發酵后北蒼術粗多糖抗氧化能力增強的具體原因還有待進一步的研究。

3 結論

本研究在實驗室保存的菌株中篩選出3 株能夠在北蒼術中生長且能顯著提高北蒼術粗多糖得率的乳酸菌,鑒定為1 株乳酸片球菌（Pediococcusɑcidilɑctici）和2 株戊糖片球菌（Pediococcuspentosɑceus）。將3 株乳酸菌作為發酵菌株,以體積比1∶1∶1 接種到北蒼術固體培養基中,通過單因素和響應面法優化發酵工藝條件為含水量50%、接種量5.5%、發酵時間2 d、發酵溫度37 ℃,其粗多糖得率為10.10%。此外,本研究也發現發酵北蒼術粗多糖抗氧化能力顯著高于未發酵北蒼術粗多糖。本試驗采取固態發酵法來提高北蒼術粗多糖得率,該類方法條件溫和、操作簡便、效果顯著,具有一定的應用前景。