不同產地花椒中多酚類物質的鑒定與差異性分析

劉洋洋，袁源，陳龍，李如一，奎杰，李積華*，廖良坤*

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所農業農村部熱帶作物產品加工重點實驗室,廣東湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室,廣東湛江 524001）

花椒（ZɑnthoxylumbungeɑnumMaxim.）是蕓香科、花椒屬植物的果皮,是典型的“藥食同源”作物。全世界大約有260 種花椒,我國目前栽培約有39 種[1]。我國是花椒第一生產大國,主產區為河北、陜西、山西、四川、云南等地。最新研究表明,花椒中含有生物堿、香豆素、類固醇、萜類等化學成分,具有擴張血管、調節血脂、抑制單胺氧化酶等生物活性[2]。花椒中的麻味素是一類生物堿類化合物,作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑[3],能夠改善小鼠的糖脂代謝紊亂,具有潛在的2-型糖尿病治療作用[4]。

多酚是一類具有多元酚結構的化學物質的統稱,廣泛存在于植物體內。研究表明,多酚可以防止紫外線破壞膠原蛋白的合成,起到抗衰老的作用[5]。多酚是大量草本植物及植物果實的主要抗氧化活性物質[6],可以通過清除自由基,起到預防腫瘤、保護心腦血管、治療或預防人體慢性疾病的作用。針對多酚、黃酮類化合物的分析和鑒定,是食品及中醫藥領域的熱門方向之一。石青浩等[7]通過高效液相色譜電噴霧離子化串聯質譜（high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS）方法鑒定鼠曲草乙醇提取物中含有11 種多酚類化合物,包括8 種黃酮類化合物和3 種酚酸類化合物。李帆等[8]采用代謝組學技術從鐵皮石斛樣品中分析出202 種黃酮類化合物。花椒中含有豐富的多酚類化合物,孟憲華等[2]通過分離純化鑒定手段,鑒定出青花椒中12 種多酚糖苷類化合物,并發現其具有良好的抗氧化活性。

本文以河北石家莊、江蘇徐州、陜西安康、陜西韓城、四川汶川、四川儀隴、湖北宜昌、云南昭通六省八地的大紅袍花椒為原料,采用超高壓液相色譜串聯高分辨飛行時間質譜儀（ultra high performance liquid chromatography tandem triple TOF high resolution mass spectrometry,UPLC-Triple TOF MS/MS）方法,鑒定多酚類物質并進行定量分析。此外,通過主成分分析法對8 個產地花椒進行分類描述,進而從多酚含量角度,闡述不同產地花椒之間的差異性,以期為花椒加工綜合利用,如花椒精油提取等企業的加工廢棄物多層次開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大紅袍花椒:江蘇金椒鴻香料科技研究院有限公司,來源于石家莊、徐州、安康、韓城、汶川、儀隴、宜昌、昭通8 個基地。

金絲桃苷、綠原酸、槲皮苷、異鼠李素標準品:上海麥克林生化科技有限公司；咖啡酸、7-羥基香豆素、山奈酚、秦皮乙素、原花青素B2標準品:上海源葉生物科技有限公司；表兒茶素、阿魏酸、兒茶素、槲皮素、香草酸、沒食子酸標準品:阿拉丁試劑（上海）有限公司；原兒茶酸、石吊蘭素標準品:北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）:美國Sigma 公司。除特殊標注外,所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Eksigent ekspert ultraLC 110-XL 超高效液相色譜儀、Triple TOFTM5600+電噴霧飛行時間高分辨質譜儀:美國SCIEX 公司；CPA225D 電子分析天平:德國賽多利斯公司；HAS-2000 型超聲波清洗機:深圳市好順超聲設備有限公司；MJ-BL25B3 研磨機:九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

干花椒去梗、去籽,研磨粉碎后過40 目篩。稱取5 g 花椒粉末置于250 mL 具塞三角瓶中,加入50 mL 80%乙醇,超聲輔助提取60 min,反復提取3 次。合并濾液并抽濾,60 ℃真空濃縮至5 mL。

1.3.2 標準品溶液的制備

稱取綠原酸、咖啡酸、香草酸等17 種標準品各0.2 mg,用2 mL 50%甲醇溶液溶解。繼續使用50%甲醇溶液對各標準品溶液進行梯度稀釋至適當檢測濃度。

1.3.3 液質聯用分析

色譜條件:ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm）；流動相:100% 乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B）,梯度洗脫:0～3 min,5%～12%A；3～33 min,12%～20% A；33～48 min,20%～35% A；48～50 min,35%～80%A。采用自動進樣器進樣,進樣量為5μL,柱溫40 ℃。

質譜條件:通過全掃描獲得一級譜圖,并通過數據采集模式獲得二級譜圖。電噴霧離子源:負離子模式；質量掃描范圍m/z 100～1 000；離子源霧化氣:55 psi（1 psi=6 894.757 Pa）；輔助加熱氣:55 psi；氣簾氣:40 psi；輔助加熱溫度:550 ℃；噴霧電壓:-4 500 V；去簇電壓:-80 V；碰撞能一級-10 V,二級-35 eV；擴展碰撞能量:15 eV。

1.4 數據分析

采取3 次平行試驗,Excel 進行數據整理分析；質譜數據導入Peak ViewTM2.0 譜圖數據分析處理工作站進行處理,采用Multi QuantTM3.0 工作站進行標曲繪制及定量分析；采用SPSS 22.0 軟件進行數據相關性及主成分分析；采用ChemDraw 繪制質譜裂解圖。

2 結果與分析

2.1 多酚類物質的結構鑒定

通過對不同產地花椒的UPLC-Triple TOF MS/MS檢測,并經過與標準品及相關文獻等比對分析后,在8 個產地花椒中共檢測出35 種多酚類物質,其中酚酸類物質10 種、黃酮類物質20 種、苯丙素類（香豆素類）物質4 種和1 種酚醛類物質,具體裂解規律如表1 所示。

表1 花椒中多酚類化合物的鑒定Table 1 Identification of phenolic compounds in Zanthoxylum bungeanum

由表1 可知,花椒中發現的酚酸類化合物主要為羥基苯甲酸類和苯丙酸類兩類化合物。以化合物3 為例,其分子離子峰為m/z 315[M-H]-,其主要碎片離子有m/z 153[M-H-Glu]-、m/z 109[M-H-Glu-CO2]-、m/z 91[M-H-Glu-CO2-H2O]-,結合Zhong 等[9]研究結果,鑒定其為原兒茶酸-4-O-葡萄糖苷,其裂解途徑如圖1 所示。

圖1 原兒茶酸-4-O-葡萄糖苷裂解途徑Fig.1 Mass fragmentation pathways of protocatechuic acid 4-O-glucoside

花椒中20 種黃酮類化合物多以槲皮素和山奈酚衍生物為主,如化合物16,比對標準品被鑒定為槲皮苷。分子離子峰m/z 447 經斷裂而失去一分子鼠李糖形成苷元碎片m/z 301。苷元碎片C 環的RDA 裂解可丟失中性片段—C7H2O4形成m/z 151 碎片；或在電離過程中失去CO,形成m/z 271[M-H-Rha-2H-CO]和255[MH-Rha-CO-OH]兩個片段。

4 種香豆素類化合物（化合物31～34）秦皮乙素、7-羥基香豆素、6-羥基-7-甲氧基香豆素和8-羥基-6,7-二甲氧基香豆素,其分子結構類似,主體化學結構見圖2。

圖2 香豆素類化合物的化學結構Fig.2 Chemical structure of coumarins

質譜碎裂方式也類似。以秦皮乙素為例,具有最高豐度（100%）的分子離子峰m/z 177 [M-H]-片段,在連續脫離一分子CO,一分子CO2后形成碎片m/z 149和m/z 105。或者,分子離子峰m/z 177 連續斷裂2 分子CO2而形成m/z 133 和m/z 89 片段,秦皮乙素裂解途徑如圖3 所示。

圖3 秦皮乙素裂解途徑Fig.3 Mass fragmentation pathways of esculetin

2.2 多酚類化合物的定量分析

花椒中多酚類化合物的定量分析見表2。

表2 花椒中多酚類化合物的定量分析Table 2 Quantitative analysis of phenolic compounds in Zanthoxylum bungeanum

由表2 可以看出,綠原酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮苷、金絲桃苷、原花青素B2等多酚類化合物含量較高,其中綠原酸、槲皮苷和金絲桃苷含量最高,這與Yang等[20]的結果一致。

金絲桃苷是黃酮類物質中含量最為豐富的一類,在8 個產地花椒中均有較高分布,其中宜昌產花椒金絲桃苷量高達（3 787.8±8.7）μg/g。槲皮素、異鼠李素在結構上僅相差一個—OCH3,而在含量分布上,兩者也比較相似,徐州、石家莊、韓城、宜昌四地樣品中均檢出。兒茶素和表兒茶素是一對同分異構體,是構成原花青素類物質的基本組成單位,在不同產地中均有較高分布,較高的兒茶素含量與原花青素含量具有正相關。在所有產地的花椒中,兒茶素的含量整體高于表兒茶素,并且基本維持在2∶1 的比例關系。

秦皮乙素和7-羥基香豆素是香豆素類衍生物。7-羥基香豆素也是唯一一種存在于所有8 個產地的香豆素類物質,其中徐州產地花椒含量最多,為（137.0±2.0）μg/g,秦皮乙素在石家莊和韓城兩地樣品中沒有檢出,與石吊蘭素似乎有一種不相容的現象。在所有6 個產地中,秦皮乙素的含量分布差異最大,安康花椒幾乎是昭通的15 倍,是含量汶川樣品的2.7 倍。

綜上,安康樣品的多酚含量較高,在被定量的17 種物質中,原兒茶酸（212.9±10.4）μg/g、沒食子酸（5.4±0.1）μg/g、秦皮乙素（1 208.0±35.7）μg/g、兒茶素（2 782.7±17.3）μg/g、表兒茶素（1 449.9±6.3）μg/g、槲皮苷（3 099.0±33.4）μg/g 和原花青素B2（2 432.5±37.3）μg/g 7 種物質含量最高。

2.3 花椒多酚相關性分析

將不同產地來源花椒的17 種多酚物質進行皮爾遜相關分析,結果見表3。

表3 花椒多酚間的皮爾遜相關性分析Table 3 Pearson correlation analysis of polyphenols in Zanthoxylum bungeanum

由表3 可知,原兒茶酸、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、秦皮乙素、原花青素6 種物質相互之間存在極顯著正相關（P<0.01）,與異鼠李素、槲皮素呈負相關。而咖啡酸、香草酸、羥基香豆素、金絲桃苷呈極顯著正相關（P<0.01）,與異鼠李素和槲皮素呈顯著正相關（P<0.05）。阿魏酸與其它16 種酚類物質無論在正向還是負向上均沒有顯著相關性,石吊蘭素由于僅在韓城和石家莊樣品中有所發現,因此與其它酚類物質相關性也不大。此外,綠原酸、山奈酚、槲皮苷3 種物質與其它酚類物質的相關性較小,這些物質對后續的主成分分析均有很大影響,因此沒有被作為變量進行后續的主成分分析。

2.4 主成分分析及綜合評價

根據多酚物質的相關性分析結果,將12 種相關性多酚物質作為指標,采用SPSS 22.0 軟件進行主成分分析,結果見表4。

表4 旋轉后的成分矩陣、特征值和方差貢獻率Table 4 Rotated component matrix，eigenvalue and variance contribution rate

由表4 可知,特征值大于1 的主成分共有3 個,累計方差貢獻率為92.696%,能夠代替原有的12 個指標,達到降維目的。

表4 反映了各個指標作用,第一主成分代表槲皮素、異鼠李素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素5 種黃酮類物質,其方差貢獻率為36.419%,其中槲皮素和異鼠李素與其它3 種化合物呈負相關；第二主成分主要代表沒食子酸、秦皮乙素和原兒茶酸3 種物質,是以酚酸類物質為主導的多酚化合物,其方差貢獻率為28.579%；第三主成分主要代表咖啡酸、香草酸和7-羥基香豆素,是以苯丙素為主體的多酚化合物,其方差貢獻率為27.698%。根據得分系數矩陣中各個成分對應的得分系數為特征向量,構建主成分得分表達式如下。

F1=0.088X1-0.314X2-0.078X3-0.146X4-0.230X5-0.394X6+0.036X7+0.211X8+0.207X9-0.114X10+0.236X11。

F2=-0.043X1+0.195X2+0.157X3+0.398X4+0.468X5+0.225X6-0.044X7-0.016X8-0.012X9+0.355X10-0.046X11。

F3=0.338X1+0.113X2+0.314X3+0.067X4-0.007X5-0.063X6+0.308X7+0.024X8-0.005X9+0.007X10+0.035X11。

以方差貢獻率為權重,構建花椒綜合評價模型:Dn=36.419%F1+28.579%F2+27.698%F3,并計算綜合得分,結果如表5 所示。

表5 各主成分綜合得分Table 5 Comprehensive score of each principal component

3 結論

我國花椒產地較多,尤其以西南地區品質較佳。儀隴、韓城的大紅袍等優質紅椒產區均是建立在以香氣濃郁、麻味醇厚的基礎上,更符合調味品的分類方式。本文選取六省八地大紅袍花椒,以多酚類活性物質為指標,對不同產地花椒進行評價發現,安康、宜昌、徐州的花椒多酚類物質總體含量較高,處于前三位置。盡管花椒生長并不需要大量水分,但三地優越的水文條件很有可能是酚類物質聚集的原因。而傳統產區四川儀隴及汶川地區,花椒多酚產量居中,優于昭通、韓城、石家莊三地。

通過UPLC-Triple TOF MS/MS 定性定量分析發現,8 個產地花椒不僅在多酚種類分布上存在特異性,在含量上也有顯著差別。被鑒定的35 種多酚類物質中,僅有18 種多酚分布在全部樣品中,并且其中7 種為酚酸類物質。酚酸類物質在植物體內是構成木質素、細胞壁基本成分,因此在各種植物體內均有分布。在定量分析中發現,含量越高的物質,越傾向于更廣的分布。槲皮苷和金絲桃苷是花椒中含量最為豐富的兩種黃酮類化合物,在8 個產地中的分布較為均衡。而石吊蘭素、異鼠李素、槲皮素等含量較低的酚類物質,分布較少,且集中分布在石家莊和韓城。定量結果發現,兒茶素和表兒茶素的含量,存在一個穩定的關系,這需要進一步的代謝機制分析。本文首次對大紅袍花椒中的多酚類物質進行了較為系統的研究,并對其分布差異和含量差異做了總結分析,并以含量差異為指標,對花椒物質做了評價分析,為花椒產業深加工、提質增效提供數據支撐。