雙蛋白對大鼠骨密度的影響

閆文杰，松偉，韓迪，李琥，馮朵，王靖*

（1.農業農村部食物與營養發展研究所,北京 100081；2.北京聯合大學生物化學工程學院,北京 100023）

骨密度改變是導致骨質疏松的直接原因,而骨吸收速率大于骨生成速率是骨密度下降的主要原因[1]。據推測2050 年約有4.49 億老年人,老齡化達37.3%[2]。我國中老年人跌倒、骨折的發生率接近20%,并且女性高于男性[3]。四川省骨科醫院調查了1 043 名60 歲以上人群的骨骼健康狀況,發現骨質疏松患者中女性患者（25%）比例高于男性患者（17.75%）[4]。河北省保定、石家莊、承德三市對6 195 名20～80 歲常住居民進行了骨密度檢測,結果表明女性患病率為1.72%,而男性患病率為0.99%。50 歲后是骨質疏松的高發時期[5]。朱潔云等[6]對68 932 例研究對象進行Meta 分析,中國60 歲以上骨質疏松患病率為37.7%。男性是27.3%,女性是48.4%。女性骨密度下降主要集中于50 歲后,體內激素水平發生改變,且絕經后患病率要明顯高于未絕經女性[7-9]。因此相較而言,解決女性骨質疏松問題更加地迫切、重要。

已有試驗證實,乳清蛋白及其水解肽二者均具有改善骨質疏松、增加骨骼密度的效果,可增加斑馬魚的骨密度及頭骨礦化量[10]。乳清蛋白肽含有類似酪蛋白磷酸肽成分,能夠促進小鼠鈣的吸收,增加骨密度。補充乳清蛋白可減少老年骨質流失[11],增加雌性大鼠骨骼礦物質含量及骨密度,并且能夠增加骨骼的承載能力。大豆分離蛋白可增加維甲酸所致骨質疏松模型小鼠子宮指數、增加骨質量及骨鈣含量[12]、改善更年期骨密度下降等情況[13]。另有研究表明,日常營養素的攝入與老年人身體健康狀況的相關性極高,特別是蛋白質類物質,高蛋白的攝入可顯著改善老年人身體衰弱的情況,因此認為蛋白的攝入與老年人身體健康狀況呈正相關[14-15]。本次實驗以去除卵巢的方法建立骨質疏松模型,該模型可造成雌鼠激素水平降低,與中年女性骨質疏松、骨密度下降病理類似,從而使得實驗結果準確性、可靠性更強,更加貼近中老年女性骨質疏松人群。

在此之前,乳清蛋白與大豆蛋白單一蛋白及其水解產物對骨密度影響已有考察,結果顯示單一蛋白起效劑量較大,有文獻表明給予10%乳清蛋白肽可提高大鼠骨密度[16],而30%的高蛋白大豆或牛奶的攝入可改善雌鼠骨骼形條[17]。在正式實驗之前已做預實驗對單一蛋白和雙蛋白效果進行對比。結果表明5 g/kg的乳清蛋白或大豆蛋白對大鼠骨密度并無改善效果,5 g/kg 雙蛋白也無明顯改善效果。故本次實驗不再設立單一蛋白對照組及雙蛋白濃度梯度,僅設立雙蛋白10 g/kg 一個劑量組,大豆蛋白與乳清蛋白質量比為1∶1。觀察該劑量下雙蛋白對雌性大鼠骨密度的影響,并考察兩者結合是否可降低起效劑量,以期為后續雙蛋白改善骨密度相關產品研發提供依據及一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BS2202S 電子天平:德國賽多利斯集團；Zeenit700P 原子吸收分光光度計:德國耶拿分析儀器股份公司；InAlyzer 雙能X 射線骨密度儀:韓國Medikors 公司；DHG9140A 電熱鼓風干燥箱:上海精宏實驗設備有限公司。

鈣標準液（1 000 mg/L）:國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸（優級純）:北京化工廠；高氯酸（優級純）:天津市鑫源化工有限公司；氯化鑭（優級純）:上海麥克林生化科技股份有限公司；苯甲酸雌二醇（分析純）:上海易恩化學技術有限公司；戊巴比妥鈉（分析純）:國藥集團化學試劑有限公司；雙蛋白固體飲料（由乳清蛋白、大豆分離蛋白、抗性糊精、碳酸鈣等復配而成,乳清蛋白與大豆分離蛋白質量比為1∶1,鈣含量5.2 g/100 g,蛋白質含量60 g/100 g,人體推薦劑量20 g/d）:農業農村部食物與營養發展研究所自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物

50 只無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級雌性SD 大鼠,體質量在285～300 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2019-0008],養于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心動物室[SYXK（京）2017-0038]。

1.2.2 模型建立

造模方法參考文獻[18-19],動物適應性飼養一周后,戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉,劑量為30 mg/kg。距陰道口3～4 cm 處去毛,碘酒、酒精消毒后,切開皮膚,找到子宮,夾住卵巢,絲線結扎輸卵管,剪除卵巢并檢查剪除是否完全。順勢將子宮送回腹腔,肌肉與皮膚分層縫合后肌肉注射青霉素2 萬U。假手術組操作與模型組一致,但不剪除卵巢,縫合肌肉及皮膚。

手術5 d 后,進行檢查,方法為陰道涂片,滴管插入雌鼠陰道,沖洗數次后吸出涂片,觀察是否有半透明、扁平的表皮細胞。連續檢查7 d,若出現動情反應,表明手術失敗。

1.2.3 實驗分組

實驗設假手術組、模型組、雙蛋白組[10.00 g/kg 體質量（body weight,BW）,相當人用推薦量30 倍]、碳酸鈣對照組（碳酸鈣1.30 g/kg BW,含鈣量均為0.52 g/kg BW,與雙蛋白組相同）和陽性對照組。

陽性對照組:本次實驗陽性物選擇苯甲酸雌二醇[20]。具體操作方法為手術后第4 周,肌肉注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/kg,每3 d 注射1 次。

雙蛋白受試物配制方法:稱取25.00 g 雙蛋白樣品加無菌水至50.0 mL,充分攪拌均勻；受試物按需求每日現用現配。雙蛋白10 g/kg BW,連續灌胃90 d。

碳酸鈣對照組受試物:稱取6.50 g 碳酸鈣研磨后加無菌水至100.0 mL,其他組均給予等量無菌水。灌胃體積為20 mL/kg BW,連續灌胃90 d。

1.2.4 樣品處理與測定方法

實驗結束后處死動物,剝離肌肉與組織取出右側股骨,將股骨置于鼓風干燥箱中105 ℃烘干至恒重。稱股骨干重,置于三角瓶中進行消化。

根據樣品中鈣含量范圍,準確稱取0.300～1.000 g股骨置于三角瓶中,加入硝酸與高氯酸體積比為4∶1制備而成的混合酸。加入15～20 mL 混合酸,置于加熱板上加熱消化,若混合酸劑量不足可再添加。消化至透明無色后加入去離子水,加熱煮沸去除多余混合酸,該操作重復兩次,最后剩余消化液體積不超過1 mL。消化樣品同時進行空白試驗對照,加入與樣品相同體積的混合酸,在相同條件下進行相同操作。

樣品消化結束后用原子吸收分光光度計測定股骨鈣含量,密度儀測定骨密度,并根據股骨干重與骨含量計算股骨的骨鈣含量,計算公式如下。

X=N/M

式中:X為骨鈣含量,mg/g；N為鈣含量,mg；M為股骨干重,g。

1.3 統計方法

用SPSS 軟件進行數據處理。數據結果分為兩部分,即方差齊性檢驗和關于均值相等的t檢驗。當方差齊次檢驗結果顯著性（significance,Sig）>0.05 認為方差齊,故取均值相等t檢驗第一欄的Sig 值,當Sig≤0.05 認為兩組間統計結果有差別；當方差齊次檢驗結果Sig≤0.05,認為方差不齊,取第二欄的Sig 值。數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 骨密度模型建立

在正式實驗開始之前,先做預實驗確定模型建立方法是否可成功制備骨密度降低模型。參照上述模型制備方法,按體質量分為假手術組與模型組,每組12 只動物,飼喂實驗專用低鈣飼料。飼養30 d 后處死動物,測定骨鈣含量及骨密度,結果見表1。

表1 大鼠骨鈣含量及骨密度Table 1 Bone calcium content and bone mineral density in rats

由表1 可見,與假手術組比,模型組骨鈣含量顯著下降（P<0.05）,股骨中點及遠心端骨密度極顯著降低（P<0.01）。表明本次實驗所選擇的去除卵巢方法可成功建立骨密度降低模型。

2.2 雙蛋白對大鼠體質量的影響

實驗期間每周對動物進行兩次稱重,觀察雙蛋白受試物及陽性物對動物體質量的影響,結果見表2。

由表2 可見,各組與假手術組比較,實驗起始到結束各組動物體質量無顯著差異（P>0.05）；第4 周假手術組體質量低于其他組,除碳酸鈣對照組,其余各組體質量與假手術組比有顯著差異（P<0.05）,實驗末期假手術組體質量明顯低于其余各組,與假手術組比各組體質量極顯著增加（P<0.01）。結果表明實驗期間給予雙蛋白對大鼠體質量無影響。

除假手術組外各組體質量無明顯差異。由此可知體質量變化原因應與去除卵巢手術有關。推測是卵巢剪除后導致動物體雌激素紊亂,從而影響日常攝食量及體內代謝水平,相關文獻亦有證實雌激素水平變化可導致機體體質量變化及體內代謝水平改變,結論與實驗結果一致[21-22]。

2.3 雙蛋白對大鼠骨鈣含量影響

雙蛋白對大鼠骨鈣含量的影響見表3。

表3 雙蛋白對大鼠骨鈣含量的影響Table 3 Effect of dual-protein on bone calcium content in rats

由表3 可見,與假手術組比,模型組骨鈣含量顯著下降（P<0.05）；與模型組比,陽性對照組骨鈣含量極顯著上升（P<0.01）；雙蛋白組與碳酸鈣對照組骨鈣含量無顯著變化（P>0.05）。結果表明雙蛋白對骨鈣含量無影響,推測雙蛋白改善骨密度機制與其中的鈣含量無關。

碳酸鈣對照組與雙蛋白組鈣含量一致,但二者對骨鈣含量有一定影響,且作用水平近似,但與模型組未產生差異,由此可知雙蛋白對骨鈣含量影響較小。研究表明碳酸鈣可增加雄性動物骨密度,因此推測雙蛋白對骨鈣含量無影響可能因為實驗選擇了雌性動物,且進行了剪除卵巢手術。有文獻表明女性在絕經后血清中25 羥維生素D3水平有所降低[23-24],同時發現雌激素可提高該物質含量,因此推測雌激素水平與維生素D 含量之間存在關聯[25]。產生本次實驗結果可能原因是造模后大鼠體內物質水平也發生改變,即使有外源鈣攝入也無法進行吸收及沉積。后續作用機理研究可進一步對該現象進行深入探討。

2.4 雙蛋白對大鼠骨密度影響

雙蛋白對大鼠股骨中點及遠心端骨密度的影響見表4。

表4 雙蛋白對大鼠股骨中點及遠心端骨密度的影響Table 4 Effect of dual-protein on bone mineral density at midpoint and distal end of femur in rats

由表4 可見,與模型組比較,雙蛋白組大鼠股骨中點骨密度顯著升高（P<0.05）,遠心端骨密度極顯著升高（P<0.01）,陽性對照組股骨中點骨密度及遠心端骨密度均極顯著升高（P<0.01）,碳酸鈣對照組遠心端骨密度極顯著升高（P<0.01）,對股骨中點骨密度無顯著影響。結果表明雙蛋白組有改善骨密度的效果,且增強遠心端骨密度效果優于中點骨密度。

2.5 股骨大體觀察及骨密度成像

雙蛋白對股骨顏色、骨質、脆度影響見圖1。

圖1 股骨大體觀察Fig.1 Macroscopic observation of femur

由圖1 可知,股骨觀察發現假手術組股骨顏色呈現白色,骨質正常,脆度正常不易折斷。模型組可觀察到股骨顏色加深呈現棕褐色,骨質酥脆,脆度低易折斷。雙蛋白組顏色呈白色,接近假手術組,骨質正常,脆度正常。陽性對照組顏色呈白色,骨質正常,脆度正常,與假手術組接近。碳酸鈣對照組股骨顏色略呈棕褐色,較模型組有一定改善,骨質略酥脆,脆度優于模型組。結果表明陽性物及雙蛋白對股骨有明顯改善作用,且變化明顯肉眼可見。碳酸鈣對照組顏色變化明顯,骨質、脆度也有所改善,但效果不如雙蛋白及陽性對照組。由此可知雙蛋白可起到改善骨密度的效果。

雙蛋白對股骨成像影響見圖2。

圖2 股骨成像Fig.2 Femur imaging

成像系統可通過顏色觀察股骨密度情況,顏色越深表明密度越大,顏色越淺表明密度越小。由圖2 可知,通過成像系統觀察發現,模型組股骨顏色略淺呈灰白色,正常股骨顏色較深呈灰黑色。陽性對照組及雙蛋白組顏色接近于正常股骨,碳酸鈣對照組無明顯變化。結果表明陽性物及雙蛋白對股骨密度有改善作用,而同等劑量碳酸鈣無明顯效果。由此可知雙蛋白可增強骨密度,且與所含有的鈣含量無關。

3 討論與結論

通過本次實驗結果可以得出10 g/kg 雙蛋白固體飲料可提高模型大鼠的骨密度,對于骨鈣含量并無影響,且該劑量雙蛋白對應的單一蛋白劑量為3 g/kg,低于預實驗使用劑量,單獨使用單一蛋白5 g/kg 未見改善,乳清蛋白與大豆分離蛋白各3 g/kg 結合的雙蛋白對骨密度有顯著改善效果,表明二者結合有一定的協同作用。對于股骨狀態的改善效果肉眼可見,與模型組差異顯著,與陽性對照組無明顯差別。并且碳酸鈣對照組對于骨鈣含量也無明顯影響,表明本次實驗中雙蛋白起效物質與鈣含量關系不密切,這可能與所選擇的剪除卵巢模型有關。有研究表明,婦女絕經后骨量每年都在流失,且流失速率較為穩定,約為每年1%。雌激素水平下降后,骨吸收速率增加,骨生成小于骨吸收,從而打破了骨轉換速率,導致了骨質疏松的形成。

本次實驗選擇的陽性物為苯甲酸雌二醇,是雌激素類藥物,臨床上常用于補充雌激素水平,同時還可增加鈣元素在骨骼中沉積。臨床試驗也證實苯甲酸雌二醇能夠增加卵巢早衰患者骨密度,并且無嚴重不良反應。故本實驗選用苯甲酸雌二醇為陽性物,實驗結果也表明其可顯著增加模型大鼠骨鈣含量及骨密度,對實驗期間動物體質量并無影響。另有研究表明大豆異黃酮對于雌性大鼠骨密度有促進作用。但本次實驗中起效物質是大豆分離蛋白,還是大豆異黃酮,有待后續進一步的研究。

絕經后婦女體內多種因子水平發生改變,骨質疏松患者骨橋蛋白水平升高,甲狀腺激素降低,I 型前膠原氨基端前肽升高。目前改善骨密度的產品及藥物研發逐漸趨向天然活性成分及藥物。例如中藥骨碎補可通過PI3K-Akt、HIF-1 等信號通路改善絕經后骨質疏松。中成藥當歸補血湯則通過調節Wnt/β-catenin 信號通路調節骨密度水平。乳鐵蛋白可提高胰島素樣生長因子結合蛋白5 水平,降低胰島素樣生長因子結合蛋白3 水平,起到改善骨密度作用。本次實驗所選擇樣品原料主要為乳清蛋白與大豆蛋白,二者均源于日常的食物之中,不僅是日常所需的營養物質同時也是天然的活性成分。目前雙蛋白改善骨密度的機制尚不明確,進一步研究空間較大,而且雙蛋白作為天然產物制備提取而來,安全穩定,具有廣泛的應用前景。