植物乳桿菌發酵核桃粕制備多肽及其抗氧化活性分析

何彩玲，顏玲，劉長虹*，馬愛進，鄭磊

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院,安徽合肥 230031；2.北京工商大學食品與健康學院,北京 100048）

核桃又名胡桃,是胡桃科胡桃屬的落葉喬木植物,世界四大堅果之一[1]。核桃仁含有豐富的油脂、蛋白質、維生素等營養成分,具有健腦益智、抗氧化、潤腸通便等功效[2]。核桃粕是核桃仁脫脂后的副產物,優質蛋白含量達到50%以上[3]。目前對核桃粕的利用大多停留在加工動物飼料和肥料上[4],只有少量的核桃粕用于生產核桃蛋白粉、蛋白乳[5]等初級產品,對于核桃粕中的優質蛋白利用尚不夠充分。

通過酶解[6]或微生物發酵[7]核桃粕制備出的生物活性肽具有抗炎[8-9]、改善記憶損傷[10]、抗疲勞[11]等多種生理功能,可實現對核桃粕優質蛋白資源的充分利用。與單一的酶水解相比,微生物產生的蛋白酶多種多樣,在多種酶的共同作用下,效率更高[12],發酵法制備的多肽種類更多,生物活性潛力也更大。目前的研究中對于核桃活性多肽的制備大多利用酶解法,微生物發酵法制備核桃活性肽的研究相對較少。因此,本文以核桃仁低溫榨油脫脂后的核桃粕為原料,以植物乳桿菌為發酵菌株,利用單因素試驗和正交試驗優化植物乳桿菌發酵核桃粕制備核桃多肽的工藝條件,并通過超濾法將核桃多肽分為不同分子量多肽,對核桃多肽進行體外抗氧化活性和氨基酸組成測定,以期為微生物發酵制備核桃多肽及其功能性開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌CICC20242:中國工業微生物菌種保藏管理中心。

生核桃仁（蛋白質含量20.40%）:市售,原產地新疆阿克蘇地區；MRS 培養基:合肥工業大學食品與生物工程學院實驗室自制；無水三氯化鐵:上海麥克林生化科技有限公司；過二硫酸鉀、鐵氰化鉀:國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯三酚:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；還原型谷胱甘肽:生工生物工程（上海）股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）:梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）,ABTS]:上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷:北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。

BSC-400 培養箱:上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；HGZF-11 數顯鼓風干燥箱:上海躍進醫療器械有限公司；GENESYS 10S 紫外可見分光光度計、VarioSkan Flash 酶標儀:美國賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-12N 真空冷凍干燥機:寧波新芝生物科技股份有限公司；URT210-C 氨基酸自動分析儀:上海紫越網絡科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 核桃粕制備

1.2.2.1 核桃仁榨油制備核桃粕核桃仁低溫（65 ℃）榨取油脂,再用正己烷浸泡脫脂后烘干。脫脂核桃粕粉碎過60 目篩[13]備用。

1.2.2.2 發酵菌懸液制備

植物乳桿菌活化三代,菌懸液在8 000×g、25 ℃離心10 min 后棄去上清液,使用無菌生理鹽水稀釋菌液至1×109CFU/mL。

1.2.2.3 核桃粕接菌液態發酵

將核桃粕與超純水混勻,滅菌冷卻后,取發酵菌種接入核桃粕溶液中,混勻后置于培養箱中30 ℃培養。

1.2.3 多肽得率測定

參考王魯黔[14]的方法并稍作修改,以還原型谷胱甘肽為標準品,采用雙縮脲法進行多肽得率的測定。

1.2.3.1 標準曲線的繪制

用5%三氯乙酸配制質量濃度為1 mg/mL 的還原型谷胱甘肽標準品。配制為不同濃度（0.05、0.10、0.30、0.50、0.70 mg/mL）標品溶液,與雙縮脲反應30 min 后,在540 nm 波長下測定吸光度,以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為y=0.084x+0.008 1,相關系數R2=0.996 9,標準曲線的線性關系良好。

1.2.3.2 多肽得率計算

取發酵后的核桃粕溶液,6 000×g、25 ℃離心5 min取上清液,加入等體積10% 的三氯乙酸,混勻后靜置10 min。8 000×g、25 ℃離心5 min 后取1 mL 上清液,加入1 mL 5% 的三氯乙酸混勻,取1 mL 混合液于10 mL 容量瓶中,用5% 三氯乙酸稀釋定容。取上述稀釋定容后的發酵液6 mL 與4 mL 雙縮脲試劑暗處反應30 min,在540 nm 條件下測定吸光度。多肽得率（R,g/g）計算公式如下。

式中:C為根據標準曲線計算得到的多肽濃度,mg/mL；V為核桃粕發酵液總體積,mL；N為稀釋倍數；M為發酵所用核桃粕的質量,g。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 發酵時間對核桃多肽得率的影響

在底物濃度5%、接種量8% 的條件下,分別考察不同發酵時間（24、48、72、96、120 h）對植物乳桿菌發酵制備核桃粕多肽得率的影響。

1.2.4.2 接種量對核桃多肽得率的影響

在底物濃度5%、發酵時間72 h 的條件下,分別考察不同接種量（2%、5%、8%、11%、14%）對植物乳桿菌發酵制備核桃粕多肽得率的影響。

1.2.4.3 底物濃度對核桃多肽得率的影響

在接種量8%、發酵時間72 h 的條件下,分別考察不同底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%）對植物乳桿菌發酵制備核桃粕多肽得率的影響。

以上發酵過程中發酵溫度根據菌種培養說明書選擇植物乳桿菌最適生長溫度為30 ℃。

1.2.4.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上,以發酵時間、接種量、底物濃度為試驗因素,以多肽得率為評價指標進行核桃肽制備工藝的優化,正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 發酵核桃多肽及其低分子量多肽的制備

取發酵核桃粕8 000×g、25 ℃離心10 min 后的上清液,依次通過截留分子質量為3 kDa 和10 kDa 的超濾管進行分級分離得到分子質量分別為<3 kDa、3～10 kDa 和>10 kDa 的發酵多肽液。發酵多肽液用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥[15],于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.6 核桃多肽體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力測定

參考羌宇等[16]的方法并稍作修改,準確稱取未超濾的全組分、分子量<3 kDa、3～10 kDa 和>10 kDa 的多肽凍干粉,分別配制成不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）的多肽溶液,對其進行抗氧化活性測定。

取不同濃度的多肽溶液100 μL,加入100 μL DPPH 溶液,暗處靜置反應30 min,使用酶標儀在517 nm 處測定吸光度。DPPH 自由基清除率（H,%）計算公式如下。

式中:A1為樣品吸光度；A2為95% 乙醇溶液代替DPPH 溶液的吸光度；A0為超純水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測定

取180μL ABTS 工作液,加入20μL 多肽溶液,暗處反應6 min,734 nm 波長處測定吸光度。ABTS+自由基清除率（B,%）計算公式如下。

式中:A1為樣品組吸光度；A2為超純水代替ABTS工作液的吸光度；A0為超純水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

參考倪慶圓[17]的方法,稍作修改。取0.05 mol/mL的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride,Tris-HCl]溶液225μL 于25 ℃預熱20 min,再加入50 μL 多肽溶液和20 μL 25 mmol/mL 的鄰苯三酚,25 ℃反應5 min,迅速加入20 μL 濃鹽酸終止反應,在320 nm 波長處測定吸光度。超氧陰離子自由基清除率（O,%）計算公式如下。

式中:A1為樣品溶液的吸光度；A2為超純水代替鄰苯三酚的吸光度；A0為超純水代替多肽溶液的吸光度。

1.2.6.4 總還原能力測定

參考張會翠等[18]的方法,稍加改進。向試管中加入2.5 mL pH6.8 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline,PBS）、1 mL 多肽溶液和2.5 mL 1% 的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min,冷卻后加入2 mL 10%的三氯乙酸終止反應,8 000×g、25 ℃離心10 min 后取50μL 上清液,加入50 μL 超純水和50 μL 0.1% 的氯化鐵溶液,靜置反應10 min,在700 nm 波長處測定吸光度。總還原能力（F,%）計算公式如下。

F=（A1-A0）× 100

式中:A1為樣品組的吸光度；A0為超純水代替上清液的吸光度。

1.2.7 氨基酸含量測定

氨基酸含量測定參考GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[19],稍作修改。準確稱取0.100 0 g 多肽粉末于蛋白水解管中,加入1.5 mL 6 mol/mL 鹽酸,反復抽真空、充高純氮氣后密封,置于110 ℃數顯鼓風干燥箱中水解22 h。水解結束后過濾至5 mL 水解管中,用超純水定容至刻度線。吸取濾液于旋蒸燒瓶中旋轉蒸發,再加超純水旋轉蒸發干燥,最后用pH2.2 的檸檬酸鈉緩沖溶液溶解,過0.22μm 水相濾膜過濾,稀釋15 倍后用氨基酸自動分析儀進行測定。

1.3 數據處理

所得數據用Excel 2019 和SPSS 軟件進行處理分析,用Origin 2022 作圖。每組樣品做3 次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

發酵時間對多肽得率的影響如圖1 所示。

圖1 發酵時間對多肽得率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the yield of polypeptides

由圖1 可知,在底物濃度為5%、接種量8%、發酵溫度30 ℃的條件下,多肽得率在發酵的前48 h 明顯升高,超過48 h 后,多肽得率隨發酵時間的延長逐漸下降,造成這種現象的原因可能是產生的多肽被植物乳桿菌產生的酶分解為更小片段的肽或者氨基酸[20]。因此,選取發酵時間24、48、72 h 進行正交試驗。

接種量對多肽得率的影響如圖2 所示。

圖2 接種量對多肽得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of polypeptides

由圖2 可知,在底物濃度5%、發酵時間72 h、發酵溫度30 ℃的條件下,多肽得率隨接種量的增加而逐漸增加,接種量為8% 時多肽得率最高,接種量大于8%時多肽得率開始下降。接種量過小會造成菌種生長緩慢,不能充分利用核桃蛋白產生多肽,延長發酵時間導致發酵效率較低；較高的接種量雖可以縮短發酵時間,但菌體的大量增加會引起供氧不足,影響發酵菌種產生蛋白酶,而且會產生過多代謝物不利于發酵過程。因此,選取接種量為5%、8%、11%進行正交試驗。

底物濃度對多肽得率的影響如圖3 所示。

圖3 底物濃度對多肽得率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of polypeptides

由圖3 可知,在接種量8%、發酵時間72 h、發酵溫度30 ℃的條件下,多肽得率隨著底物濃度的升高整體呈升高趨勢,底物濃度增加表明植物乳桿菌可利用的原料更多,因此多肽得率也隨之上升。當底物濃度達到5%以上時,隨著底物濃度的升高,多肽得率增加緩慢,考慮到底物濃度為9% 時,離心工作難度較大,也從節約原料的角度出發,選取底物濃度3%、5%、7%進行正交試驗。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上,以發酵時間（A）、接種量（B）、底物濃度（C）為試驗因素,以多肽得率為指標,采用L9（34）正交試驗探討不同因素對核桃肽發酵制備工藝的影響。正交試驗結果如表2 所示,方差分析結果如表3 所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance results

由表2 和表3 可知,核桃肽發酵制備工藝中對多肽得率產生影響的各因素順序為A>C>B,發酵時間為極顯著性影響因素（P<0.01）。核桃肽發酵制備的最佳工藝為A2B3C3,即發酵制備核桃肽的最佳工藝條件為發酵時間48 h、植物乳桿菌接種量11%、底物濃度7%。進行4 次驗證試驗,平均多肽得率為0.263 0 g/g,略高于正交試驗表中最高得率（0.252 3 g/g）。因此,在發酵溫度為30 ℃時,最佳的發酵條件為發酵時間48 h、植物乳桿菌接種量11%和底物濃度7%。

2.3 體外抗氧化活性結果

不同分子量核桃多肽的抗氧化活性見圖4。

圖4 不同分子量核桃多肽的抗氧化活性比較Fig.4 Comparison of antioxidant activities of walnut polypeptides with different molecular weights

由圖4 可知,在核桃多肽濃度大于0.5 mg/mL 時,多肽的抗氧化活性均隨著分子量的降低而逐漸增強。當質量濃度達到3.0 mg/mL 時,4 種分子量多肽的DPPH 自由基清除能力都很強,分子量<3 kDa、3～10 kDa 和全組分多肽的DPPH 自由基清除率分別達到了94.79%、91.90% 和91.25%。分子量<3 kDa 的多肽的ABTS+自由基清除能力在不同濃度下均顯著高于其他3 種分子量的多肽（P<0.05）,在濃度為2.0、3.0 mg/mL 時,ABTS+自由基清除率分別達到94.75%和97.42%。在濃度為0.5 mg/mL 時,4 種分子量多肽的超氧陰離子自由基清除能力無顯著性差異,全組分與分子量<3 kDa 多肽的總還原能力差異不顯著,但是它們與3～10 kDa、>10 kDa 多肽的總還原能力存在顯著性差異（P<0.05）。當多肽濃度>1.0 mg/mL 時,分子量<3 kDa 多肽的超氧陰離子自由基清除能力和總還原能力顯著升高,遠超其他3 種分子量的多肽,在核桃多肽濃度為3.0 mg/mL 時,總還原能力和超氧陰離子自由基清除率分別為23.45% 和20.74%。結果表明,低分子量多肽具備更強的抗氧化活性。

2.4 多肽氨基酸組成及含量

不同分子量多肽的氨基酸組成和含量結果見表4。

表4 不同分子量多肽的氨基酸組成和含量Table 4 Amino acid composition and content of polypeptides with different molecular weights mg/g

由表4 可知,經過超濾分離的3 種不同分子量多肽和全組分多肽氨基酸種類齊全,氨基酸的組成、序列和結構與多肽的抗氧化活性密切相關[21],疏水性氨基酸可能通過增加肽在脂質中的溶解度而在脂質氧化抑制中發揮重要作用[22]。芳香族氨基酸如苯丙氨酸的存在允許電子直接轉移至活性氧（reactive oxygen species,ROS）,進而體現出強抗氧化活性[23]。酸性氨基酸能夠螯合金屬離子,組氨酸的供氫能力、誘捕超氧化物自由基及其咪唑基團的金屬離子螯合能力對多肽抗氧化活性有很大貢獻。<3 kDa 的多肽的抗氧化活性明顯高于其他3 種分子量的多肽,一方面可能是<3 kDa的多肽含有的抗氧化氨基酸在4 種多肽組分中含量相對較高,另一方面可能是低分子量多肽的三級或四級結構較少,其中的抗氧化氨基酸基團充分暴露出來,從而增強其抗氧化活性[24]。

3 結論

以核桃粕為原料,植物乳桿菌為發酵菌種,采用液態發酵方式,以多肽得率為指標,通過單因素和正交試驗,確定植物乳桿菌發酵核桃粕制備多肽的最佳發酵條件為發酵時間48 h、接種量11%和底物濃度7%,在此條件下多肽得率為0.263 0 g/g。抗氧化活性測定結果表明,隨著多肽分子量的降低其抗氧化活性逐漸增強。在核桃多肽濃度大于0.5 mg/mL 時,分子量<3 kDa 的多肽的DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基清除率和總還原能力均顯著高于其他3 種。氨基酸分析結果表明,4 種多肽組分的氨基酸種類齊全,<3 kDa 多肽的疏水性、酸性和堿性氨基酸含量均最高。植物乳桿菌發酵核桃粕制備抗氧化多肽具有很大的潛力。本研究可為核桃粕的充分利用和深入研究提供一定的參考,也為微生物發酵制備其他功能性多肽提供參考。