同時快速檢測蔬菜中百菌清和多菌靈的膠體金免疫層析法

許奐源，梁植雯，許景皓，黃葦，尹青春，李斌，江林峰，郭美媛，徐振林*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室,廣東廣州 510642；2.海南省食品檢驗檢測中心,國家市場監(jiān)管重點實驗室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全）,海南海口 570314；3.廣州萬聯(lián)生物科技有限公司,廣東廣州 510670；4.廣東康輝集團有限公司,廣東潮州 515638）

百菌清（chlorothalonil,CTN）是一種高效、低毒、廣譜的非內(nèi)吸性有機氯殺菌劑,是全球第二大常用殺菌劑,也是我國常用的殺菌劑之一[1-2],由于其在植物表面有良好的黏著性,具有較長的藥效期,被廣泛應(yīng)用于果蔬病害的防治。研究表明,百菌清具有蓄積毒性,人體長期暴露并接觸百菌清會引起職業(yè)性哮喘、皮膚病等疾病,百菌清對魚類及水生脊椎動物也存在毒害作用,此外,百菌清的高毒性和持久性也會對環(huán)境和食品安全造成嚴重的影響[3-4]。多菌靈（carbendazim,CBZ）是一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑,能夠?qū)σ呀?jīng)受到真菌病害的植物進行內(nèi)吸治療[5]。除此之外,多菌靈還被廣泛用于造林、園藝等行業(yè)。研究表明,多菌靈對水生動物及哺乳動物具有生殖毒性、致突變性、致癌性,還會引起人體的肝病和染色體畸變[6]。在殺菌劑的使用方面,因為單一制劑的長期連續(xù)使用,會使病原菌產(chǎn)生抗藥性,因此,一般會采用百菌清對植物進行病害防治、采用多菌靈進行病害治療,交替使用,以達到最佳的防治效果,導(dǎo)致存在百菌清、多菌靈含量超標現(xiàn)象[7-9]。

由于百菌清和多菌靈存在毒性,世界衛(wèi)生組織在2017 年已將百菌清列為2B 類致癌物。歐盟禁止百菌清和多菌靈使用,GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定大部分蔬菜中百菌清和多菌靈的最大殘留限量分別為0.2～5.0 mg/kg 和0.5～5.0 mg/kg。GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中規(guī)定百菌清為水源水和飲用水的必檢項。許多國家均制定了相應(yīng)的最大殘留限量標準。百菌清、多菌靈毒性雖低,短時間內(nèi)無不良反應(yīng),但是長時間的蓄積以及其毒性的協(xié)同作用,會對人體造成加倍的傷害。因此在蔬菜和其他食品的安全監(jiān)測中,同時針對百菌清和多菌靈的殘留檢測非常重要。

目前,百菌清、多菌靈殘留的檢測方法主要為儀器分析法,包括氣相色譜（gas chromatography,GC）法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法[12-13]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）法[14-15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）法[16-17]等。這些方法均具有較高的靈敏度和準確性,但由于昂貴的使用成本、復(fù)雜的操作等局限了其應(yīng)用。對于現(xiàn)場檢測而言,基于抗原-抗體特異性結(jié)合的膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immuno-chromatography assay,GICA）因其具有靈敏、易操作、高通量等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[18]。目前,針對百菌清、多菌靈的快速檢測方法均為單一對象的檢測方法,例如郭乃菲等[19]利用兔多抗建立了百菌清間接競爭酶聯(lián)免疫吸附（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA）法,萬積成等[20]建立了百菌清膠體金免疫層析檢測法,蔣文慧等[21]通過制備的單克隆抗體建立的多菌靈酶聯(lián)免疫吸附法,陳美蓮等[22]建立了多菌靈膠體金免疫層析檢測法,同時檢測的研究鮮見報道。

本研究制備識別百菌清和多菌靈的特異性單克隆抗體,并建立一種快速同時檢測百菌清和多菌靈的雙信號膠體金免疫層析方法,系統(tǒng)優(yōu)化影響性能與穩(wěn)定性的各種檢測條件,最后用于番茄、黃瓜、包菜等蔬菜樣品的實際檢測,以期滿足快速檢測蔬菜中百菌清、多菌靈殘留的現(xiàn)場大批量篩查的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本墊、硝酸纖維（nitrocellulose filter,NC）膜、吸水墊和聚氯乙烯底板:上海金標生物技術(shù)有限公司；氯金酸、檸檬酸三鈉、多菌靈標準品（純度99.9%）、百菌清標準品（純度99.9%）:國藥集團化學(xué)試劑有限公司；金標復(fù)溶液:廣州萬聯(lián)生物科技有限公司；羊抗鼠二抗:北京全式金生物技術(shù)有限公司；6-氨基己酸、氫氧化鈉、N,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF）:上海麥克林生化科技有限公司；鑰孔血藍蛋白、乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、蔗糖、吐溫-20:默克化工技術(shù)（上海）有限公司；Balb/c 小鼠:珠海百事通生物技術(shù)有限公司；黃瓜、番茄、包菜:市售；以上試劑均為分析純,實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

劃膜儀（HGS510）、裁條機（HGS201）、金標讀數(shù)儀（GIC-Q）:杭州峰航科技有限公司；烘箱（SKFG-01）:湖北恒豐醫(yī)療制藥設(shè)備有限公司；低溫高速離心機（CR22N）:德國Eppendorf 公司；MS 漩渦振蕩器（MS3 basic）:德國IKA 公司；高效液相色譜儀（2695）:美國Waters 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 百菌清、多菌靈半抗原的合成

百菌清半抗原H1 合成路線如圖1（a）所示。稱取2.65 g 百菌清固體、0.3 g 6-氨基己酸、0.3 g 氫氧化鈉溶于40 mL DMF,80 ℃加熱攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后,用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至8 左右,用二氯甲烷萃取除去未反應(yīng)完全的原料和雜質(zhì)后,用正丁醇萃取水相后,有機層減壓蒸發(fā),干燥后得到百菌清半抗原H1。

圖1 百菌清、多菌靈半抗原合成路線Fig.1 Synthetic routes of chlorothalonil and carbendazim hapten

百菌清半抗原H2合成路線如圖1（b）所示。稱取2.65 g百菌清固體、0.25 g 甘氨酸和0.23 g 氫氧化鈉溶于40 mL DMF,合成方法與上述流程一致,得到百菌清半抗原H2。

多菌靈半抗原H1 合成路線如圖1（c）所示。在低溫下,將1.92 g 多菌靈固體緩慢加入到5 mL 的氯磺酸中,升溫至40 ℃反應(yīng)2.5 h,制得多菌靈-氯磺酸溶液。冰浴攪拌下,將上述制得的多菌靈-氯磺酸溶液滴入50 mL 95% 乙醇中,形成乳白色懸濁液,將反應(yīng)液過濾,濾液用冷乙醇洗滌后,干燥,得到白色中間產(chǎn)物1。

在室溫下,將8 mL 甲酸、12 mL 蒸餾水和5 mL 48% 氫溴酸加進100 mL 圓底燒瓶中,再依次加入3 g白色中間產(chǎn)物1 和1 g 鋁粉,升溫至65 ℃反應(yīng)1.5 h,反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液過濾,用50%氫氧化鈉溶液將濾液pH 值調(diào)節(jié)至3 左右,室溫反應(yīng)12 h。將反應(yīng)液過濾,濾渣依次用蒸餾水和甲醇洗滌,抽干后于室溫晾干,得到中間產(chǎn)物2。

在室溫下,將0.5 g 氫氧化鈉、10 mL 蒸餾水,0.56 g 中間產(chǎn)物2 和0.46 g 溴丁酸依次加入100 mL干凈圓底燒瓶中,40 ℃攪拌反應(yīng)1.5 h 后將反應(yīng)液過濾,濾液用6 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7 左右,生成白色固體,持續(xù)室溫攪拌12 h 后將反應(yīng)液過濾,濾渣用蒸餾水洗滌,抽干并干燥,得到多菌靈半抗原H1。

多菌靈半抗原H2 合成路線如圖1（d）所示。將1.0 g 多菌靈固體溶解于5 mL 濃硫酸中,在冰浴攪拌下滴加5 mL 濃硝酸,低溫下持續(xù)攪拌30 min,升溫至室溫,繼續(xù)反應(yīng)2 h。在冰浴下用20% 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至8 左右,有黃色固體生成,65 ℃下減壓濃縮部分溶劑,繼續(xù)低溫攪拌30 min,過濾,濾渣用蒸餾水洗滌,抽干并干燥,得到棕黃色中間產(chǎn)物1。

將棕黃色中間產(chǎn)物1、鋅粉和濃鹽酸按照摩爾比為1∶1.2∶1 依次加入30 mL 甲醇溶液中。在70 ℃下回流4 h,反應(yīng)完成后將反應(yīng)液減壓蒸發(fā)除去甲醇溶液后,用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值調(diào)節(jié)至8 左右,用二氯甲烷萃取,有機層減壓蒸發(fā),干燥后得到多菌靈半抗原H2。

1.3.2 百菌清、多菌靈單克隆抗體的制備

將百菌清半抗原H1、多菌靈半抗原H1 作為免疫半抗原,分別采用活潑酯法偶聯(lián)鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）和乳鐵蛋白（lactoferrin,LF）形成免疫原CTN-H1-KLH 和CBZ-H1-LF,百菌清半抗原H2、多菌靈半抗原H2 作為包被半抗原,分別采用活潑酯法和戊二醛法偶聯(lián)牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和形成包被原CTN-H2-BSA 和CBZ-H2-BSA。

用CTN-H1-KLH 和CBZ-H1-LF 免疫Balb/c 小鼠,通過采用ic-ELISA 法測定小鼠血清的效價以及對目標分析物的抑制率,根據(jù)結(jié)果選擇免疫效果最好的小鼠進行聚乙二醇介導(dǎo)的細胞融合實驗,將其脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞按5∶1 的比例融合形成雜交瘤細胞,采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng),選擇能夠穩(wěn)定分泌特異性抗體的細胞株擴大培養(yǎng)并制備抗體。通過ic-ELISA 的方法分析比較抗體對百菌清、多菌靈及其結(jié)構(gòu)類似物的特異性。交叉反應(yīng)率（Y,%）按下式計算。

式中:X0為目標待測物ic-ELISA 方法IC50值；Z0為結(jié)構(gòu)類似物ic-ELISA 方法IC50值。

1.3.3 GICA 方法的建立

1.3.3.1 膠體金探針的制備

采用檸檬酸三鈉還原法合成膠體金探針[23-24],準確量取100 mL 超純水?dāng)嚢杓訜嶂练序v后加入4 mL 的10.0 g/L氯金酸溶液,待再次沸騰時加入4 mL 的10.0 g/L 檸檬酸三鈉溶液,保持溶液在沸騰溫度下加熱10 min 直至顏色變成酒紅色后停止加熱,繼續(xù)攪拌到其冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移到潔凈的玻璃瓶中置于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 金標抗體的制備

分別用方法1.3.2 所制備的抗百菌清單克隆抗體、抗多菌靈單克隆抗體對方法1.3.3.1 所制備的膠體金探針進行標記,具體標記方法:用0.1 mol/L K2CO3溶液將膠體金溶液調(diào)節(jié)至合適的pH 值,加入一定量的抗體振蕩混勻后,室溫反應(yīng)10 min。加入40μL 100.0 g/L BSA 溶液振蕩混勻后,室溫反應(yīng)30 min 封閉未結(jié)合抗體的位點。在4 ℃、9 500 r/min 的條件下離心10 min,棄上清液,加入金標復(fù)溶液復(fù)溶,分別獲得金標百菌清抗體以及金標多菌靈抗體。將制備好的兩種金標抗體按照1∶1（體積比）混勻后,分裝包被在96 孔酶標板中,37 ℃過夜烘干,于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 試紙條的組裝

將不同質(zhì)量濃度的CTN-H2-BSA、CBZ-H2-BSA 和羊抗鼠IgG 固定于NC 膜上,形成兩條檢測T 線和一條質(zhì)控C 線,并于37 ℃干燥箱中干燥12 h。樣品墊經(jīng)樣品墊處理液均勻浸泡處理后于37 ℃干燥箱中干燥12 h。免疫層析試紙條由聚氯乙烯底板、吸水墊、NC膜和樣品墊組成。將其從上往下依次將吸水墊、NC膜、樣品墊組裝于聚氯乙烯底板上,用切條機切成4 mm 寬的試紙條,于干燥環(huán)境下避光儲藏。

1.3.3.4 檢測步驟及結(jié)果判定

取80μL 待測溶液加至含有金標抗體的酶標微孔中吹打復(fù)溶金標抗體,室溫反應(yīng)3 min 后滴加至試紙條樣品墊孔中,室溫反應(yīng)5 min,金標讀數(shù)儀測定并進行定量計算。如圖2 所示,對于無待測物的陰性樣本,檢測線T1、T2上的CTN-H2-BSA、CBZ-H2-BSA 會捕獲金標抗體,形成兩條紅色的檢測T 線,C 線的羊抗鼠IgG 會捕獲剩余的金標抗體,形成紅色的C 線。對于含有待測物的陽性樣本,金標抗體會優(yōu)先與待測物結(jié)合,導(dǎo)致T 線的顯色強度隨著待測物濃度的增加而變淺。當(dāng)試紙條的C 線無色,結(jié)果無效。

圖2 GICA 檢測示意圖Fig.2 Schematic diagram of GICA

1.3.4 GICA 檢測條件的優(yōu)化

為了實現(xiàn)最佳的檢測靈敏度、穩(wěn)定性與顯色效果,分別優(yōu)化標記體系pH 值、抗體添加量、金標抗體用量、T 線抗原包被濃度、樣品墊處理液中離子濃度、BSA濃度、吐溫-20 濃度、蔗糖濃度及樣品前處理條件。在優(yōu)化過程中,采用金標讀數(shù)儀讀取試紙條T 線和C 線的信號值并進行計算,對比試紙條的T/C 值以及抑制率進行優(yōu)化選擇。抑制率（Y,%）按下式計算。

式中:B0為陰性樣品T 線和C 線信號強度比值；BX為陽性樣品T 線和C 線信號強度比值。

1.3.5 試紙條的性能評價

1.3.5.1 靈敏度

用上述GICA 檢測條件優(yōu)化所得的藥物稀釋液配制一系列不同濃度的百菌清（0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/kg）和多菌靈（0、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250μg/kg）標準品溶液,分別取80 μL 用于試紙條檢測,根據(jù)金標讀數(shù)儀讀取試紙條的T/C 值,以縱坐標為B/B0,橫坐標為藥物濃度作標準曲線。

1.3.5.2 準確性

選擇黃瓜、番茄、包菜3 種蔬菜樣品,分別添加百菌清和多菌靈（0、125、250、500 ng/mL）標準品溶液,依照優(yōu)化的樣品前處理方法和GICA 方法進行提取檢測,通過藥物加標回收率以及變異系數(shù)對該法的準確性進行評價。加標回收率（Y,%）和變異系數(shù)（CV,%）計算公式如下。

式中:CX為藥物實測濃度,μg/kg；C0為藥物添加濃度,μg/kg；σ為加標回收率的標準差；μ為加標回收率的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2021 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理與分析,使用Origin 2022 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗百菌清、抗多菌靈單克隆抗體性能鑒定

選擇保留百菌清的兩個氰基,從氰基鄰位的鹵素原子氯引入含羧基的間隔臂,合成免疫半抗原,采用縮短間隔臂長度的策略合成了異源包被原。選擇保留多菌靈的苯并咪唑環(huán)和氨基甲酸酯基團的完整性,從苯環(huán)的另一端引入含羧基的間隔臂,合成免疫半抗原,同樣地,引入氨基基團合成了異源包被原。通過細胞融合、篩選、腹水制備純化抗體,所得到的兩株單克隆抗體性能見圖3。

圖3 ic-ELISA 曲線Fig.3 ic-ELISA curve

由圖3a 可知,抗百菌清抗體ic-ELISA 的IC50為0.12 ng/mL,檢測限（IC10）為0.02 ng/mL,檢測線性范圍（IC20～IC80）為0.04～0.35 ng/mL。由圖3b 可知,抗多菌靈抗體ic-ELISA 的IC50為1.93 ng/mL,檢測限（IC10）為0.29 ng/mL,檢測線性范圍（IC20～IC80）為0.58～6.44 ng/mL。

所得到的兩株單克隆抗體的亞型見圖4。

圖4 單克隆抗體亞型Fig.4 Monoclonal antibody subtype

由圖4 可知兩株單克隆抗體亞型均為IgG1。

單克隆抗體特異性見圖5。

圖5 單克隆抗體特異性Fig.5 Monoclonal antibody specificity

由圖5 可知,抗多菌靈單克隆抗體特異性對比其他選擇從氨基甲酸酯基團端引入間隔臂的策略所制備的單克隆抗體,Yan 等[25]制備的單克隆抗體IC50值為0.45 ng/mL,本研究所得到的抗體特異性方面優(yōu)于其他抗體。抗百菌清單克隆抗體識別的關(guān)鍵表位為氰基部分。Liu 等[26]所制備的單克隆抗體IC50值為0.36 ng/mL,其半抗原合成策略與本文相似,但本研究采用了異源包被原提升了檢測的靈敏度。而Okazaki 等[27]采用從無氰基的五氯苯酚引入間隔臂制得的單克隆抗體IC50值為0.4 ng/mL,但其對取代苯類結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率很高。這些數(shù)據(jù)提供了針對取代苯類殺菌劑的半抗原設(shè)計思路,廣譜性抗體可從無氰基、保留鹵素原子氯的原料去進行間隔臂的引入,單特異性抗體可從保留氰基的原料去進行間隔臂的引入。

2.2 試紙條檢測條件優(yōu)化

2.2.1 標記pH 值與抗體添加量

膠體金標記抗體是通過靜電吸附作用將抗體結(jié)合包裹在膠體金顆粒表面,標記體系的pH 值會影響抗體與膠體金顆粒的吸附效率以及抗體的生物活性[28]。因此通過添加不同量的0.1 mol/L K2CO3溶液來調(diào)節(jié)標記體系的pH 值,結(jié)果見圖6。

圖6 不同0.1 mol/L K2CO3 溶液添加量的試紙條效果及探針顏色Fig.6 Effects of test strips and probe color with different 0.1 mol/L K2CO3 solution addition amount

由圖6 可知,當(dāng)標記抗體為百菌清單克隆抗體時,隨著K2CO3溶液添加量從10 μL 增加為14 μL,試紙條的T/C 值逐漸上升,而隨著K2CO3溶液添加量大于14 μL 時,試紙條T/C 值驟降且靈敏度無明顯變化。當(dāng)標記抗體為多菌靈單克隆抗體時,隨著K2CO3溶液添加量從10 μL 增加到18 μL,試紙條的T/C 值逐漸下降,在K2CO3溶液添加量為10μL 時,膠體金溶液發(fā)生了明顯的聚沉現(xiàn)象,而試紙條靈敏度在K2CO3溶液添加量為14μL 時表現(xiàn)為最佳。因此,在K2CO3溶液添加量為14μL 時,兩個抗體都表現(xiàn)出了最佳的標記效率。

在最適的pH 值條件下,不同抗體添加量對試紙條檢測性能的影響見圖7。

圖7 不同抗體添加量的試紙條效果Fig.7 Effects of test strips with different antibody addition amount

由圖7a 可知,當(dāng)標記抗體為百菌清單克隆抗體時,隨著抗體添加量從4μL 增加到6μL,試紙條的靈敏度逐漸上升,而抗體添加量大于6μL 時試紙條靈敏度驟降。抗體添加量為4～8μL 時,T/C 值上升,因此,選擇靈敏度最佳時的抗體添加量6μL 為最佳抗體添加量。由圖7b 可知,當(dāng)標記抗體為多菌靈單克隆抗體時,隨著抗體添加量的增加,試紙條的靈敏度呈現(xiàn)上升的趨勢,試紙條的T/C 值整體平穩(wěn),當(dāng)抗體添加量分別為7 μL 和8 μL,試紙條的靈敏度與T/C 值均滿足要求且無明顯變化,考慮到加入太多抗體容易造成探針聚沉的影響[29-30],因此,選擇7μL 為最佳抗體添加量。

2.2.2 金標抗體用量與T 線抗原包被濃度

對于試紙條的顯色效果及靈敏度,T 線抗原包被濃度以及金標抗體用量也是兩個重要的影響因素。固定試紙條質(zhì)控C 線包被濃度為0.08 mg/mL,結(jié)果見表1。

表1 金標抗體用量與T 線抗原包被濃度優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimization of gold-labeled antibody dosage and T-line antigen coating concentration

由表1 中T/C 值與抑制率可知,最佳組合為金標抗體用量為15 μL/微孔、百菌清抗原包被濃度0.21 mg/mL、多菌靈抗原包被濃度1.50 mg/mL。在優(yōu)化的最佳參數(shù)下,試紙條整體的陰性顯色效果最佳,同時靈敏度最高,20 ng/mL 百菌清陽性樣品抑制率為82.3%,125 ng/mL 多菌靈的陽性樣品抑制率為69.3%。

2.2.3 試紙條樣品墊處理液優(yōu)化

在試紙條中樣品墊的主要作用為平衡待測樣品液的pH 值、鹽離子強度及保持層析的均一性和可控性,對試紙條的顯色效果、靈敏度有一定的影響[31-32]。

樣品墊緩沖液對試紙條檢測的影響見圖8。

圖8 樣品墊處理液對試紙條效果的影響Fig.8 Effect of sample pad treatment solution on the GICA performance

由圖8 可知,在離子濃度為0～0.2 mol/L 范圍內(nèi),試紙條T/C 值無明顯變化,但當(dāng)離子濃度為0.4 mol/L 時,百菌清的靈敏度驟降,表明較高的離子濃度破壞了金標抗體的穩(wěn)定性。隨著BSA 濃度的增加,試紙條T/C 值無明顯變化,BSA 濃度為0.5%時試紙條抑制率最佳。隨著吐溫-20 濃度的增加,試紙條的T/C 值與靈敏度呈現(xiàn)下降的趨勢,不含吐溫-20 時效果最佳。隨著蔗糖濃度的增加,試紙條T/C 值變深后無明顯變化,當(dāng)蔗糖濃度為0.5%時,相比更高添加濃度,試紙條抑制率已達到最高。綜合試紙條顯色強度與靈敏度,樣品墊處理液最適配方為含有0.5%BSA 和0.5%蔗糖的0.1 mol/L 磷酸緩沖液。

2.3 樣品前處理優(yōu)化

不同的樣品前處理條件將決定藥物的提取效率以及樣品基質(zhì)干擾的去除,對試紙條的靈敏度、前處理方法的可行性有著一定的影響,不同樣品前處理條件的影響見圖9。

圖9 不同前處理條件對試紙條效果的影響Fig.9 Effect of preprocessing conditions on GICA performance

2.3.1 提取溶劑選擇

為了達到較高的樣品中的藥物提取效率及降低樣品基質(zhì)所帶來的影響,探究了不同的樣品提取溶劑所帶來的影響。由圖9a 可知,當(dāng)選用正己烷、1% 乙酸-乙腈為提取溶劑時,多菌靈的加標回收率低于40%,百菌清的加標回收率高于160%。選用乙腈和丙酮為提取溶劑時,百菌清和多菌靈的加標回收率為60%～120%,相比之下,丙酮為提取劑時的加標回收率較高于乙腈為提取劑時的加標回收率,因此,選擇丙酮為最佳樣品提取溶劑。

2.3.2 吸附劑的影響

在樣品前處理的過程中,有機溶劑在提取過程中會提取出除目標藥物外的其他雜質(zhì),需要在后續(xù)處理中利用吸附劑吸附和消除樣品基質(zhì)中的糖類、色素以及脂肪酸,以減少雜質(zhì)對檢測的影響。由圖9b 可知,樣品提取液經(jīng)過N-丙基乙二胺（primary secondary amine,PSA）和石墨化碳黑（graphitized carbon black,GCB）處理后,百菌清的加標回收率低于10%,多菌靈的加標回收率也略有下降。說明PSA 和GCB 對百菌清和多菌靈都有不同程度的吸附作用,未經(jīng)吸附劑處理的樣品提取液所測得的加標回收率為60%～100%,因此,選擇不使用吸附劑對樣品提取液進行處理。

2.3.3 氮吹溫度的影響

在樣品前處理的過程中,氮吹溫度會對藥物提取效率有明顯的影響。由圖9c 可知,30 ℃的氮吹溫度下加標回收率為80%～100%,而40 ℃和50 ℃的氮吹溫度下,百菌清的加標回收率明顯下降,多菌靈的加標回收率則幾乎沒有變化,因此,選擇氮吹最佳溫度條件為30 ℃。

2.4 試紙條性能評價

2.4.1 靈敏度

按照上述所優(yōu)化的最優(yōu)條件下,試紙條的標準曲線見圖10。

圖10 GICA 的標準曲線及試紙條效果圖Fig.10 Standard curve and test strip effect diagram of GICA

由圖10 可知,本研究所建立的方法百菌清的檢測限為0.08 ng/mL,檢測范圍為0.08～10.00 ng/mL；多菌靈的檢測限為1.95 ng/mL,檢測范圍為1.95～250.00 ng/mL。

2.4.2 實際樣品檢測

選擇黃瓜、番茄和包菜3 種樣品進行添加回收試驗,百菌清、多菌靈的添加濃度分別為125、250、500μg/kg,采用上述所優(yōu)化的最佳條件進行試驗,結(jié)果見表2。

表2 樣品添加回收結(jié)果（n=3）Table 2 Recoveries of spiked samples（n=3）

由表2 可知,3 種樣品中百菌清的加標回收率為79.2%～112.1%,變異系數(shù)為2.5%～18.9%；多菌靈的加標回收率為63.3%～97.5%,變異系數(shù)為1.7%～17.5%。

3 結(jié)論

本文基于所制備得到的兩種能夠特異性識別百菌清、多菌靈的單克隆抗體,成功建立了可以同時快速、簡便、靈敏檢測蔬菜中百菌清、多菌靈殘留的雙信號膠體免疫層析法。該法對百菌清、多菌靈的檢測限分別為0.08 ng/mL 和1.95 ng/mL,線性范圍分別為0.08～10.00 ng/mL 和1.95～250.00 ng/mL。在黃瓜、番茄、包菜3 種樣品添加回收試驗中百菌清的加標回收率為79.2%～112.1%,多菌靈的加標回收率為63.3%～97.5%,變異系數(shù)均低于18.9%,所需總檢測時間為20 min,表明本研究建立的膠體金免疫層析法具有靈敏、簡便、快速等優(yōu)點,可應(yīng)用于蔬菜中百菌清、多菌靈殘留的現(xiàn)場快速篩查中。