牛奶蛋白過敏嬰兒腸道菌群特異性變化及短鏈脂肪酸水平分析

于志丹 岳玲玲 王梓潓 王睿孜 李利鋒 張萬存 李小芹

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院鄭州兒童醫(yī)院消化內(nèi)科/鄭州市兒童消化疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450018）

近年來，食物過敏在嬰幼兒和兒童人群中的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其中牛奶蛋白過敏（cow's milk protein allergy, CMPA）最為常見，其患病率報(bào)道不一，在1.3%～2.9%之間；癥狀可累及多個(gè)器官系統(tǒng)，如皮膚、消化道、呼吸道等，可出現(xiàn)皮疹、腸道炎癥和哮喘等表現(xiàn)［1］。食物蛋白等過敏原經(jīng)消化道致敏是誘發(fā)食物過敏的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因而闡明腸道環(huán)節(jié)食物致敏蛋白與腸道免疫之間的關(guān)系及其影響因素，減輕或阻斷腸道異常反應(yīng)或致敏，對(duì)于食物過敏疾病的預(yù)防和治療至關(guān)重要。腸道菌群作為人體新陳代謝的“器官”，在腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能發(fā)揮方面亦起著重要作用，在出生后的早期階段，腸道菌群的建立與免疫系統(tǒng)的成熟是平行發(fā)展的［2］。因此，腸道菌群發(fā)育異常和穩(wěn)態(tài)失調(diào)可損害腸道免疫，進(jìn)而引發(fā)健康問題和疾病發(fā)生。近期的研究顯示，腸道菌群紊亂與食物過敏發(fā)生密切相關(guān)［3-5］。菌群代謝產(chǎn)物是菌群與宿主間的重要介質(zhì)，其中乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid, SCFA）作為一類重要的產(chǎn)物除了可為腸上皮細(xì)胞提供能量以外，在維持腸上皮細(xì)胞屏障的完整性、增加抗炎產(chǎn)物的合成或調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞功能方面起著重要作用［6-8］。本研究采用16S rDNA高通量檢測(cè)技術(shù)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS）檢測(cè)CMPA 患兒腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFA 水平變化，以期揭示CMPA 患兒腸道菌群特征及SCFA 的變化，為CMPA 的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年8月—2020年8月在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診就診的CMPA患兒及兒童保健門診體檢正常嬰兒各25例，分別設(shè)為CMPA組和對(duì)照組。所有研究對(duì)象的生活區(qū)域均在鄭州市及周邊縣市，生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)基本相同。收集兩組嬰兒一般資料及CMPA患兒臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）母乳喂養(yǎng)，年齡＜6 個(gè)月；（2）根據(jù)《中國(guó)嬰幼兒牛奶蛋白過敏診治循證建議》［9］確診為CMPA。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有腸道感染性疾病（結(jié)核病及乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等病毒感染）、消化道畸形、內(nèi)分泌代謝障礙、先天性疾病、自身免疫性疾病；（2）1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、微生態(tài)制劑（如益生菌）等影響消化道菌群的藥物；（3）入選前1個(gè)月內(nèi)口服或靜脈應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑。

本研究已通過我院倫理委員會(huì)審議（2021-HK16），且獲得患兒家屬知情同意書。

1.2 樣本采集

采集研究對(duì)象新鮮糞便樣本200 mg，并置于無菌凍存管內(nèi)，2 h 內(nèi)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃冰箱。每個(gè)研究對(duì)象收集3份樣本備用。

1.3 腸道微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

采用CTAB 法提取糞便中微生物基因組DNA，檢測(cè)DNA 的純度和濃度，合格的樣品用無菌水稀釋至1 ng/μL。設(shè)計(jì)鑒定通用引物（V3～V4 前端引物：343F-5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'，后端引物：798R-5'-AGGGTATCTAATCCT-3'），通過PCR 擴(kuò)增對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定。基于IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)，采用雙末端測(cè)序（Paired-End）方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)。以稀釋的基因組DNA 為模板，利用帶Barcode 特異性引物、PCR Master Mix（含有GC buffer）以及高保真酶配制成PCR 反應(yīng)體系。檢測(cè)合格的PCR 產(chǎn)物根據(jù)濃度進(jìn)行等體積混合，并用瓊脂糖凝膠電泳（2%）分離PCR產(chǎn)物，回收純化目的條帶。利用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，然后將構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量，利用HiSeq2500 PE250 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。經(jīng)過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，排除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)，并進(jìn)行基于序列間相似度的分類單元（operational taxonomic unit, OTU）聚類分析，將獲得的信息通過Qiime 軟件計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson 等指數(shù)， 并 在 界（kingdom）、 門（phylum）、 綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）、種（species）7 個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。Venn 圖和主成分分析（principal component analysis, PCA）圖采用R 軟件繪制。α-多樣性（包括Chao1、Shannon、observed species 指數(shù)等指標(biāo)）和β-多樣性采用QIIME2 計(jì)算。采用nsegata-LEfSe軟件對(duì)差異性菌群進(jìn)行LEfSe分析。

1.4 腸道微生物代謝組學(xué)分析

糞便樣本經(jīng)緩沖液充分溶解，加入內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸（0.3 mg/mL）和LysoPC 17∶0（0.01 mg/mL）各20 μL （甲醇配置） 及400 μL 的甲醇-乙腈（V∶V=2∶1），并用超聲提取10 min 后，-20℃靜置30 min；離心得150 μL 上清，用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾，并轉(zhuǎn)移至液相色譜進(jìn)樣瓶，進(jìn)行LC-MS 分析。質(zhì)量控制由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個(gè)質(zhì)量控制的體積與樣本體積相同。所有提取試劑使用前均在-20℃進(jìn)行預(yù)冷。

本次實(shí)驗(yàn)的分析儀器為AB ExionLC 超高效液相串聯(lián)AB TripleTOF 6600 高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫45℃，流 速0.4 mL/min。質(zhì)譜條件為ESI 離子源，樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。

1.5 微生物多樣性與代謝組聯(lián)合分析

根據(jù)樣本一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算微生物（OTU/門/綱/目/科/屬/種）的相對(duì)豐度與對(duì)應(yīng)代謝物的響應(yīng)強(qiáng)度數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)性。二者之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用RStudio軟件語言完成微生物群數(shù)據(jù)分析。腸道菌群的異同性采用聚類分析，其值的計(jì)算采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，并經(jīng)過FDR 校正。采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMPA組與對(duì)照組一般資料的比較

CMPA組和對(duì)照組年齡、身高、體重、出生體重、出生方式的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CMPA 組每日大便次數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。CMPA 組患兒大便均含有奶瓣，且18 例出現(xiàn)便血。見表1。

表1 CMPA組和對(duì)照組一般資料的比較

2.2 CMPA患兒腸道菌群多樣性分析

50個(gè)樣本共獲得3 555 452條可用高質(zhì)量序列，基于有效數(shù)據(jù)已超過97%相似性進(jìn)行OTU 聚類分析，共注釋到6 644個(gè)OTU中。基于統(tǒng)一深度下計(jì)算不同樣本的α-多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon 和observed species指數(shù)），分析表明，與對(duì)照組相比，CMPA組α-多樣性顯著增加（兩組Chao1、Shannon和observed species 指數(shù)比較，均P＜0.001）（圖1A～C）。基于多種距離矩陣的分析結(jié)果，通過主坐標(biāo)分析和非度量多維排列 （non-metric multidimensional scaling， NMDS）分析可以觀察個(gè)體或群體間的差異，結(jié)果表明CMPA組和對(duì)照組間微生物群落β-多樣性具有差異，且組內(nèi)生物重復(fù)性好（圖1D～E）。Venn圖分析顯示，CMPA組和對(duì)照組嬰兒糞便中OTU 的組成有很大不同：只有1 769 個(gè)OTU 是兩組共同所有，而4 335 個(gè)OTU 是CMPA組所特有（圖1F）。

圖1 CMPA糞便群落多樣性分析 A、B、C：基于統(tǒng)一深度下不同樣本的α-多樣性指數(shù)分析；a表示與對(duì)照組相比，P＜0.05。D、E 分別為NMDS 分析（stress=0.048）和主坐標(biāo)分析，顯示CMPA 組和對(duì)照組間微生物菌落β-多樣性有差異。F：Venn圖，顯示CMPA組和對(duì)照組兒童糞便中OTU的組成有很大的不同，只有1 769個(gè)OTU是兩組共同所有。

2.3 CMPA患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

為了明確CMPA 對(duì)嬰兒腸道菌群組成的影響，將OTU 進(jìn)行聚類分析，得到不同水平物種相對(duì)豐度。從科水平上看（圖2），CMPA患兒腸道內(nèi)腸桿菌 科 （Enterobacteriaceae, 14%）、 毛 羅 菌 科（Lachnospiraceae, 6%）、擬桿菌科（Bacteroidaceae,4%）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae, 1%）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae, 3%）豐度較對(duì)照組（豐度分別為16%、20%、21%、4%和16%）均顯著下降。Muribaculaceae、Arcobacteracea、 梭 菌 科（Clostridiaceae_1） 、 鞘 脂 單 胞 菌 科（Sphingomonadaceae）、支原體科（Mycoplasmataceae）等在CMPA患兒腸道內(nèi)富集。

圖2 CMPA患兒腸道菌群群落結(jié)構(gòu)分析 單個(gè)樣本科水平群落結(jié)構(gòu)（柱子表示樣本，不同顏色表示不同注釋信息，others表示除前30之外的所有物種）。

2.4 CMPA患兒腸道菌群差異物種分析

為了進(jìn)一步探討CMPA 患兒腸道菌群的變化，本研究利用LEfSe方法分析了組間具有顯著性差異的 物 種（biomarker），篩 選LDA score 前15 的biomarker（圖3A）。結(jié)果顯示，對(duì)照組中厚壁菌門（Firmicutes）、梭狀芽孢桿菌目（Clostridiales）、擬桿菌（Bacteroides）豐度較高，而CMPA 組患兒腸道 菌 群 變 形 菌 （Proteobacteria）、 彎 曲 菌（Campylobacteria）豐度顯著升高。對(duì)差異物種進(jìn)行相對(duì)豐度log 轉(zhuǎn)換，種水平上差異物種相對(duì)豐度前10 的boxplot 分析顯示，CMPA 組腸道中嗜熱鏈球菌（Streptococcus_salivarius_subsp._thermophilus）（P=0.014）、脆弱擬桿菌（Bacteroides_fragilis）（P=0.004）、 脆 弱 類 桿 菌 多 形 種（Bacteroides_thetaiotaomicron） （P=0.005） 、 丁 酸 梭 菌（Clostridium_butyricum）（P＜0.001）顯著下調(diào)，而乳桿菌屬（Lactobacillus_murinus、Lactobacillus_gasseri、Lactobacillus_reuteri）（P＜0.001）和肺炎鏈球菌（Streptococcus_pneumoniae）（P＜0.001）顯著升高（圖3B）。

圖3 CMPA 患兒腸道菌群物種豐度分析 A：差異物種score 圖，不同顏色表示不同組別，紅色條形表示在CMPA 組別中豐度相對(duì)較高的物種，綠色條形表示在對(duì)照組別中相對(duì)豐度較高的物種；B：種水平差異物種相對(duì)豐度前10 的boxplot分析，縱坐標(biāo)表示物種的相對(duì)豐度log轉(zhuǎn)換值。

2.5 CMPA患兒腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFA含量

為了確定微生物群落結(jié)構(gòu)的變化是否會(huì)轉(zhuǎn)化為微生物代謝的改變，本研究同時(shí)檢測(cè)了對(duì)照組和CMPA組腸道內(nèi)微生物代謝產(chǎn)物，根據(jù)變量權(quán)重值對(duì)脂肪酸差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行可視化分析，結(jié)果顯示，CMPA組腸道內(nèi)脂肪酸代謝產(chǎn)物含量較對(duì)照組顯著下降（表2），包括乙酸、丁酸、異戊酸（圖4）。

圖4 CMPA患兒腸道代謝產(chǎn)物SCFA變化分析 圖A、B、C分別為乙酸、丁酸和異戊酸相對(duì)含量。a表示與對(duì)照組相比，P＜0.05。

表2 CMPA組與對(duì)照組相比腸道脂肪酸代謝產(chǎn)物的變化

2.6 腸道菌群與其代謝產(chǎn)物SCFA的關(guān)聯(lián)分析

將SCFA產(chǎn)生菌豐度與乙酸、丁酸、異戊酸含量進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示：乙酸含量與糞桿菌屬（Faecalibacterium）和糞球菌屬（Coprococcus_3）等的豐度呈正相關(guān)（P＜0.05）；丁酸含量與糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅氏菌屬（Roseburia）、細(xì)毛螺菌屬 （Eubacterium_eligens_group）、 糞 球 菌 屬（Coprococcus_1）等的豐度呈正相關(guān)（P＜0.05）；異戊酸含量與糞桿菌屬（Faecalibacterium）、毛螺菌屬（Lachnoclostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae_UCG-003）、霍氏真菌屬（Eubacterium_hallii_group）等的豐度呈正相關(guān)（P＜0.05）。見圖5。

圖5 腸道菌群與代謝產(chǎn)物SCFA關(guān)聯(lián)分析 橘紅色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān)，顏色越深相關(guān)性越大。***示P＜0.001，**示P＜0.01，*示P＜0.05。

3 討論

生活方式和環(huán)境的改變影響人體腸道菌群的組成，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抗生素的濫用、較高比例的配方奶喂養(yǎng)、飲食結(jié)構(gòu)改變等打亂了機(jī)體腸道菌群平衡，增加過敏性疾病的發(fā)生率，其中CMPA 是嬰幼兒最常見的過敏性疾病。嬰兒時(shí)期是腸道菌群建立的關(guān)鍵窗口，在塑造宿主免疫力方面起著重要作用［10］。生命早期腸道菌群組成的改變（如生態(tài)失調(diào)）是影響食物過敏發(fā)展的關(guān)鍵因素［11］。胃腸道內(nèi)膜是機(jī)體最大的免疫位點(diǎn)，在生命過程中不斷接觸大量的微生物和食物蛋白，具有吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抵御潛在致病微生物的功能。通常情況下，腸道微生物通過飲食獲得的生物大分子可誘導(dǎo)腸道固有層調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell, Treg）的發(fā)育，以抑制食物過敏引發(fā)的過強(qiáng)免疫反應(yīng)［12］。因此，早期腸道微生物的定植及組成在兒童食物過敏中發(fā)揮重要作用。

Nakayama等［13］分析了過敏和非過敏嬰兒的糞便細(xì)菌組成，表明腸道微生物組成的變化增加后期過敏的風(fēng)險(xiǎn)。為了更好地了解共生細(xì)菌與嬰兒CMPA的關(guān)系，本研究收集了CMPA患兒及正常嬰兒糞便進(jìn)行微生物組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CMPA患兒較正常嬰兒腸道微生物α-多樣性顯著增加。早期腸道菌群失調(diào)直接影響機(jī)體功能，增加兒童食物過敏的風(fēng)險(xiǎn)。近年來研究表明，西方CMPA嬰幼兒腸道菌群組成與正常嬰幼兒不同，含有更高的細(xì)菌數(shù)和厭氧菌，并伴隨擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度減少，厚壁菌門和梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）豐度增加［14］。然而，另有研究報(bào)道，過敏患兒腸道內(nèi)梭狀芽孢桿菌目豐度減少，而擬桿菌目豐度增加［15］。本研究發(fā)現(xiàn)CMPA 患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，含有較高豐度的梭菌科、鞘脂單胞菌科、支原體科，而擬桿菌科、腸桿菌科和普雷沃氏菌科豐度下降。另有LEfSe分析表明厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌目、擬桿菌在CMPA 患兒腸道內(nèi)豐度降低。由于地域結(jié)構(gòu)及飲食文化的差異導(dǎo)致我國(guó)CMPA 患兒腸道菌群的變化與西方國(guó)家有所不同，但患兒腸道內(nèi)梭狀芽孢桿菌、擬桿菌豐度均降低。有研究表明腸道內(nèi)梭狀芽孢桿菌的定植可促進(jìn)腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor beta, TGF-β）的表達(dá)，從而影響表達(dá)Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)腸調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Foxp3+Treg）的累積和功能，而Foxp3+Treg 在口服耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16-17］。因此，CMPA患兒腸道菌群的變化可能直接影響腸道免疫細(xì)胞的分化、累積及功能，從而調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)。

腸道菌群代謝物是宿主免疫系統(tǒng)和共生微生物群之間交流的重要信號(hào)分子，為互利共生奠定了廣泛的基礎(chǔ)［7］。其中，SCFA 是腸道內(nèi)含量最多的代謝產(chǎn)物之一，在維持腸黏膜完整性、局部和全身代謝功能中發(fā)揮重要作用，且可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答［6，8，18］。SCFA 可誘導(dǎo)Treg 產(chǎn)生與分化，降低Th2 型細(xì)胞因子和抗原特異性IgE，抑制過敏免疫應(yīng)答［19］；或與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，誘導(dǎo)IL-18產(chǎn)生，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，維持腸道屏障完整性［20］。近年來研究表明，與健康受試者相比，食物過敏兒童糞便中SCFA水平顯著降低［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)CMPA 患兒腸道內(nèi)丁酸梭菌豐度顯著降低，菌群代謝產(chǎn)物脂肪酸含量顯著下降，尤其是丁酸、乙酸和異戊酸。因此，在過敏的機(jī)體中，腸道菌群組成改變尤其是SCFA 相關(guān)菌群（丁酸梭菌等）的豐度降低，導(dǎo)致SCFA濃度降低，破壞腸道屏障完整性，進(jìn)而導(dǎo)致食物抗原通過上皮屏障誘發(fā)炎癥反應(yīng)。此外，為了明確腸道菌群與SCFA 在CMPA過程中的關(guān)系，對(duì)兩者進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)乙酸含量與糞桿菌屬、糞球菌屬等的豐度呈正相關(guān)，丁酸含量與糞桿菌屬、羅氏菌屬等的豐度呈正相關(guān)，異戊酸含量與糞桿菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬等的豐度呈正相關(guān)。腸道微生物紊亂與CMPA 的發(fā)病機(jī)制存在一定聯(lián)系，而這種聯(lián)系可能是通過SCFA水平變化而介導(dǎo)［23］，尤其是丁酸總量的減少。腸道菌群組成不同類型的變化可能導(dǎo)致代謝產(chǎn)物具有相似的變化特征，從而引起或促進(jìn)食物過敏的發(fā)生。腸道微生物可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、腸道蠕動(dòng)、降解未消化食物等多種生理過程。有研究表明，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、黏膜屏障完整性對(duì)嬰幼兒消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要影響［24］。但有關(guān)腸道微生物來源性SCFA在過敏性疾病中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，嬰兒CMPA普遍存在腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，其中SCFA產(chǎn)生菌豐度降低，導(dǎo)致腸道內(nèi)SCFA 水平降低，抑制了腸道黏膜屏障的恢復(fù)，進(jìn)一步誘導(dǎo)腸道炎癥的加重。但有關(guān)SCFA 在CMPA腸道炎癥中的作用與機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。在CMPA的治療中，或許通過微生物制劑或飲食調(diào)節(jié)腸道微生物組成，平衡腸道內(nèi)SCFA的水平，對(duì)恢復(fù)過敏患兒健康具有重要的臨床意義。

作者貢獻(xiàn)聲明：于志丹負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)與論文撰寫；岳玲玲負(fù)責(zé)樣本收集；王梓潓負(fù)責(zé)樣本處理；王睿孜負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；李利鋒負(fù)責(zé)檢測(cè)數(shù)據(jù)初步篩選；張萬存負(fù)責(zé)生物信息學(xué)分析；李小芹負(fù)責(zé)研究監(jiān)督與質(zhì)量把控。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。