基于FGF23/Klotho穩態觀察口服糖皮質激素致生長障礙的臨床研究

唐帥 楊揚 李湘 別炳陽 張建,2

（1.河南中醫藥大學兒科醫學院，河南鄭州 450000；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科醫院，河南鄭州 450000）

長期口服糖皮質激素（glucocorticosteroid, GC）是原發性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome,PNS）的一線治療方案，然而一些兒童長期使用GC可能導致終身高降低［1］。研究表明，在GC初始治療的前12 個月，平均潑尼松劑量每日增加10 mg/m2，兒童身高Z 評分降低0.26，尤其在治療開始的前6 個月，GC 對身高的影響最顯著［2］。Delucchi 等［3］的大鼠研究闡述了GC 抑制生長的新機制：GC通過刺激骨和血漿中成纖維細胞因子23（fibroblast growth factor 23, FGF23）過表達，過度激活FGF23/Klotho/成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor, FGFR）3 通路，進而抑制縱向骨生長。然而隨后Feger等［4］發現，無論在小鼠體內或體外，GC均顯著下調FGF23水平，這與Delucchi等［3］研究結論相悖。FGF23是在骨骼和腎臟中發揮重要調節作用的蛋白質激素，需依賴輔因子Klotho與FGFRs 結合［5］。Klotho與不同亞型的FGFRs 親和力存在差異［6］，同時不同亞型FGFRs 對生長的調控作用相反，其中FGFR1 和FGFR3 為生長板軟骨形成的負向調控因子，FGFR2和FGFR4則為正向調控因子［7-8］。然而，未有研究關注FGF23/Klotho 穩態在GC 抑制生長中的調控作用，并且當前研究關于GC 如何調控FGF23水平亦存在爭議［3-4］。本研究旨在觀察長期口服GC抑制PNS兒童生長與FGF23/Klotho比值變化的相關性，為后續研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取已停用GC 3 個月以上，于2022 年6—12月至河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科醫院復查的56 例激素敏感-非頻復發/未復發的PNS 兒童為研究對象，所有PNS 兒童按照《兒童激素敏感、 復發/依賴腎病綜合征診治循證指南（2016）》［9］（以下簡稱“指南”）中激素敏感型的GC 方案治療并規范完成療程，停用GC 中位時長為9.7個月。入院后所有研究對象均進行抗感染及抗凝治療，同時監測尿蛋白定性及定量。經抗感染及抗凝治療后，尿蛋白水平仍高于“指南”中復發標準者，按照“指南”中非頻復發PNS 的GC治療方案重新誘導緩解，為GC組；經抗感染及抗凝治療后，尿蛋白水平低于“指南”中復發標準者，不加用GC 治療，為無GC 組。納入標準：符合：“指南”［9］中激素敏感-非頻復發/未復發的PNS 診斷標準。排除標準：（1）入院時正在口服GC治療或近3個月內停用GC者；（2）年齡＜3歲或男性＞12歲或女性＞10歲者。

另選取同期于河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科醫院體檢的29 例3 歲至青春期前的健康兒童作為對照組。納入標準：（1） 尿蛋白陰性；（2） 血白蛋白（albumin, ALB） 在正常范圍內；（3）既往不曾口服GC。排除標準：（1）患心、肺、肝、腎等疾病；（2）生化檢查提示谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮或肌酐任意一項異常。

本研究經河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（2023HL-343）。

1.2 臨床資料收集

收集所有研究對象入組時的數據，包括年齡、性別、尿蛋白定性、ALB、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）、FGF23、Klotho、身高和骨齡等。另外收集無GC組和GC組治療1個月后的ALP、FGF23、Klotho 水平，以及半年后的身高和骨齡等數據，計算半年內的身高增長速度和骨齡增長速度。

1.3 檢測方法

尿蛋白定性、ALB、ALP的測定由我院檢驗科進行。

身高測量均由同一操作人員在固定時間段使用同一量具（TZG 型身高坐高計-江蘇蘇宏醫療器械有限公司制造） 進行，單位為cm，精確至0.1 cm。身高百分位數參照《中國0～18歲兒童、青少年身高、體重的標準化生長曲線》［10］，使用中國兒童生長曲線圖計算器計算。

骨齡判定方法：使用杭州滄瀾醫療科技有限公司提供的X射線骨齡儀（型號：YTJ-01）拍攝左手正位X線骨齡片并計算骨齡；該X射線骨齡儀的判定方法參照中華05 RUS-CHN法手腕骨等級得分表和骨成熟度評價圖［11］，依第50百分位數曲線計算骨成熟度得分和相應骨齡（單位：歲，保留1位小數），按照每年12 個月將骨齡（歲）換算為骨齡（月）。

eGFR 參考Tang 等［12］提出的中國兒童腎小球濾過率評估公式進行估算：eGFR ［mL/（min·1.73 m2）］ =89.674× ［身 高（m）/肌 酐（mg/dL）/2.7］0.579×1.007（男性，如為女性則無需×1.007）×［身高（m）/1.4］0.187。

FGF23、Klotho 濃度檢測：全血樣本采集當日離心分離血清，所有血清樣本均存儲于-80℃低溫凍存，避免反復凍融。采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法進行FGF23 及Klotho 測定，試劑盒購于Elabscience 公司，該試劑盒FGF23 測定范圍為15.63～1 000 pg/mL， Klotho 測 定 范 圍 為0.31～20 ng/mL。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行，結果由標準品的濃度和光密度值繪制的標準曲線圖及直線回歸方程得出。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0 統計軟件對數據進行統計學分析。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態分布的計量資料用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數資料以例數和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，組間兩兩比較采用卡方分割檢驗，采用Bonferroni 法校正檢驗水準。雙變量正態分布資料相關性分析采用Pearson 法，雙變量非正態分布資料相關性分析采用Spearman秩相關。Bonferroni法以P＜0.017為差異有統計學意義，余P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組兒童基線特征和臨床指標比較

GC組、無GC組和對照組三組兒童入組年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。GC 組、無GC 組男性比例差異無統計學意義（P＞0.017），無GC 組男性比例高于對照組（P＜0.017）。GC 組第2 次晨尿蛋白陽性率、24 h 尿蛋白定高于無GC 組（P＜0.05）。GC 組ALB 水平低于無GC 組（P＜0.05），GC組、無GC組ALB水平均低于對照組（P＜0.05）。GC 組、無GC 組eGFR 水平差異無統計學意義（P＞0.05），但均高于對照組（P＜0.05）。GC組、無GC組身高百分位數比較差異無統計學意義（P＞0.05），但均低于對照組（P＜0.05）。三組ALP、FGF23、Klotho 和FGF23/Klotho 比值比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組中FGF23/Klotho 比值的變異系數均小于FGF23和Klotho的變異系數。見表1。

表1 三組入組時資料比較

2.2 GC組和無GC組治療1個月和半年后的相關指標比較

治 療1 個 月 后，GC 組 的FGF23、Klotho 及FGF23/Klotho 比值均高于無GC 組（P＜0.05），血清ALP 低于無GC 組（P＜0.05）。隨訪半年，GC 組骨齡增長速度和身高增長速度低于無GC 組（P＜0.05），GC組半年后的身高百分位數明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表2 GC組和無GC組治療1個月和半年后的相關指標比較

2.3 PNS兒童治療1個月后的FGF23/Klotho比值與臨床指標的關系

Pearson相關分析顯示，PNS兒童治療1個月后的FGF23/Klotho比值與治療半年內的身高和骨齡增長速度均呈負相關（分別r=-0.356、-0.436，均P＜0.05），見圖1～2；而年齡與FGF23/Klotho 比值無相關性（r=0.045，P=0.743）。Spearman秩相關分析顯示，性別（rs=0.176，P=0.194）、尿蛋白（rs=-0.147，P=0.28）與FGF23/Klotho比值無相關性。

圖2 FGF23/Klotho與骨齡增長速度的相關性分析

3 討論

長期口服GC導致的生長障礙一直是臨床關注的重點，然而其作用機制尚待明確。FGF23、Klotho和FGFRs等因子在生長板中的存在已得到確認［13-14］。Klotho作為FGF23的共受體，輔助其與生長板軟骨細胞外結構中的FGFRs 結合。這一結合使得細胞內的FGFRs 結構域被磷酸化，進而激活細胞內的下游信號通路，調控生長板軟骨細胞的增殖、分化等生理活動［15］。然而長期口服GC是否通過擾亂兒童血清FGF23/Klotho穩態導致生長障礙尚不清楚。因此，本研究旨在觀察長期口服GC的PNS兒童的生長情況，并探究其血清FGF23/Klotho穩態的變化，以提供新的視角來理解GC對生長的抑制。

Delucchi 等［3］研究發現GC 導致青春期前大鼠生長障礙與FGF23表達增加相關。此外GC處理還增加了小鼠脛骨外植體中FGFR3 的表達，這表明GC 導致生長障礙的機制與FGF23/Klotho/FGFR3 信號通路相關。然而，Feger等［4］研究中，無論在小鼠體內還是體外，單次GC 治療均顯著降低FGF23的濃度。這兩項研究出現差異的原因可能是后者僅測量了單次應用GC 后12 h 內FGF23 水平的變化。本研究結果顯示，GC 組加用GC 1 個月后的FGF23 和Klotho 水平均顯著高于無GC 組，與Delucchi 等［3］的結論一致。然而，生長板中的FGF23 除了激活FGFR3 外，還可激活其他同類型受體，并表現出相反的生長調控作用［7-8］。作為輔因子的Klotho對不同類型的受體表現出不同的親和力，調控著FGF23 與不同受體的結合能力［6］。Delucchi 等［3］可能忽略了FGF23/Klotho 穩態才是GC 抑制生長的關鍵靶點，這比單一FGF23 水平更具有觀測價值。本研究中，GC組患兒再次加用GC后，其身高增長速度和骨齡增長速度較無GC組均顯著降低，同時其FGF23/Klotho 比值較無GC 組顯著升高。這些結果支持了FGF23/Klotho 穩態與GC抑制生長的關聯。相關性分析顯示，PNS兒童入組1 個月后的FGF23/Klotho 比值與其后半年內的身高增長速度、骨齡增長速度呈顯著負相關，表明FGF23/Klotho 穩態失衡是長期口服GC 導致生長障礙的機制之一。

關于FGF23/Klotho 穩態是否受GC 以外其他因素的影響而造成本研究的偏差，多項研究顯示FGF23 和Klotho 水平不受年齡、性別影響［16］。然而有研究顯示，FGF23和Klotho蛋白水平與慢性腎臟病嚴重程度具有一定相關性，隨著疾病進展，腎小球濾過率與Klotho水平逐漸降低，而FGF23水平逐漸升高［17］。另外，分子質量較小的FGF23 蛋白（32 kDa）理論上可能受尿蛋白的影響，但并無相關研究證明。本研究中無GC 組和GC 組的eGFR水平均顯著高于對照組，這可能是由于PNS 兒童的腎小球濾過膜通透性增加引起的［18］。關于為何不同尿蛋白程度的GC組、無GC組之間的eGFR水平不具有差異，可能是由于抽樣誤差導致的。盡管三組兒童的尿蛋白定性、定量及eGFR比較差異均有統計學意義，但其FGF23/Klotho比值差異無統計學意義，反向證明了FGF23/Klotho穩態不受以上因素影響。另外，本研究中FGF23/Klotho比值的變異系數在不同組中均遠小于FGF23及Klotho的變異系數，其良好的穩定性從另一角度亦支持著FGF23/Klotho穩態的觀測價值。

綜上所述，GC 至少部分通過擾亂FGF23/Klotho穩態這一機制導致PNS兒童生長障礙，并且其穩態是一個穩定指標，不受GC外其他已知因素的影響。因此，無論是尋找新的治療靶點或是預測GC 抑制生長的強度，FGF23/Klotho 穩態均為一個新的有效指標。然而，本研究也存在一些局限性：（1）目前國內外尚未就FGF23和Klotho的正常濃度范圍達成一致，而且測量試劑盒的種類繁多，本研究使用的是Elabscience 公司的ELISA 試劑盒，未能評估不同檢測方法的差異；（2）影響FGF23、Klotho因素眾多，未來可行多重線性回歸分析，減少其他混雜因素帶來的偏倚。鑒于這些局限性，需要在更大的樣本中進行前瞻性、多中心研究。

作者貢獻聲明：唐帥參與選題與設計，負責數據統計分析及論文撰寫；楊揚負責FGF23、Klotho濃度檢測；李湘負責測量骨齡及身高；別炳陽負責收集臨床數據；張建負責論文選題與設計，以及論文審閱與修改。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。