功能磁共振評估宮內發育遲緩仔鼠腎臟微觀結構及灌注改變

梁燦 李瑩 賀曉日

（1.中南大學湘雅二醫院新生兒科；2.中南大學湘雅二醫院新生兒疾病研究室，湖南長沙 410011）

宮內發育遲緩（intrauterine growth restriction,IUGR）在中國大陸的發病率達8.77%［1］。其在發展中國家及亞洲發達國家常見的致病因素為孕期營養不良。在IUGR個體中，腎單位數量減少是高血壓和腎臟疾病發生的重要促成因素［2］。腎單位的減少可使剩余腎小球代償性肥大及高灌注［3］。同時，腎單位高灌注、高濾過的血流動力學改變還可以引起足細胞損傷、腎小球系膜細胞增生［4］以及腎小管損傷等［5］。流行病學相關研究顯示，IUGR 個體成年后出現高血壓、微量蛋白尿、慢性腎臟病（chronic kidney disease, CKD）甚至終末期腎臟疾病的概率較正常出生體重人群高［6-7］。IUGR腎小球數量減少多在出生時就已出現，但其后續腎臟改變多發生在成年后，腎功能損害一旦出現，很難防止病情的進展與惡化，從而導致不良臨床結局［8］，故對于IUGR個體的腎臟結構與功能需動態監測以期盡早干預，改善預后［4］。

目前常用于評估腎功能的方法如血肌酐、尿素氮、超聲、腎穿刺活檢等仍存在一定局限性。功能磁共振（functional magnetic resonance imaging,fMRI）具有敏感、定量、無創的特點，目前有多種技術已應用于腎臟損傷早期和持續損傷的評估。采用單指數模型方法的傳統擴散加權成像（diffusion weighted imaging, DWI）得到的表觀彌散系數（apparent diffusion coefficient, ADC）反映了組織微觀結構及組織微循環灌注信息［9］。雙指數模型可將組織微觀結構和微循環信息分開，精細量化水分子的真性擴散和毛細血管及腎小管內液體流動引起的假性擴散，得到真實擴散系數（Dt）、偽擴散系數（D*）以及灌注分數（f），即為體素內不相干運動（intravoxel incoherent motion, IVIM）技術［10-11］。Dt與細胞間水分子的擴散速率相關，反映組織的微細結構；D*主要反映微循環灌注情況；f值表示目標區域內包含腎小管液流動的微循環灌注在整體擴散信號中所占比例。IVIM 在移植腎模型、糖尿病腎病及兒童慢性腎疾病中可用于評估纖維化評分、腎功能受損、估算腎小球濾過率與纖維化面積等，但各參數敏感度仍未達成共識［12-15］。

縱向馳豫時間（T1）和橫向弛豫時間（T2）是形態磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）中組織對比的主要來源［16］，對組織的含水量較為敏感，且T1 的變化早于T2［17-18］。T1 mapping 及T2 mapping 技術通過定量化生成T1-map圖及T2-map 圖，得到對應部位的T1 值及T2值［17，19］。T1 mapping及T2 mapping已廣泛應用于大腦、心臟等部位。目前研究認為T1 值與腎纖維化存在一定的相關性［17］，T2 值對腎纖維化改變相對不敏感［7］，對足細胞水腫、炎癥等改變較敏感。T1及T2值在急性炎癥時期均出現升高，腎纖維化時僅T1值出現升高［20］，兩者聯合或能更好地識別腎臟纖維化改變。

本研究采用孕期低蛋白飲食建立IUGR仔鼠模型，利用IVIM、T1 mapping、T2 mapping MRI 掃描評估仔鼠腎臟微觀結構及灌注改變的動態變化，觀察各參數值的差異。同時將存在差異的MRI 參數與Scr、BUN 及腎臟病理檢測結果對比，探討通過fMRI評估IUGR仔鼠腎臟微觀結構及灌注改變的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和模型建立

本動物實驗方案獲中南大學湘雅二醫院實驗動物倫理委員會批準（編號2021030）。實驗動物購買于湖南省長沙市斯萊克景達實驗動物有限公司。將12只Sprague-Dawley（SD）孕鼠，隨機分為低蛋白組（雌鼠妊娠予蛋白質含量為10%的低蛋白飼料喂養）和對照組（正常喂養），仔鼠出生后均正常喂養。仔鼠出生后測量體重，當仔鼠的出生體重低于對照組仔鼠的平均體重2個標準差者認為其發生IUGR［21］。通過給予孕鼠孕期全程低蛋白飲食建立IUGR 模型［22］。低蛋白組仔鼠隨機分為IUGR 8周組、IUGR 12周組，對照組仔鼠隨機分為正常8周組、正常12周組，每組各8只。均母乳喂養至21 d 后斷乳分籠予以正常飲食，喂養至第8周、第12周時行MRI檢查后處死并留取標本。

1.2 MRI檢查

仔鼠檢查前6～8 h 禁食禁飲，掃描前15 min 予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）皮下注射麻醉，取俯臥位、頭先進體位。采用上海聯影uMR790 3.0T磁共振成像系統，專配12 通道實驗動物專用磁共振線圈。

1.3 MRI掃描序列

使用的MRI 掃描序列為：橫軸位和冠狀位快速自旋回波（T2WI） 序列，快速自旋回波（T1WI）序列，IVIM 序列，橫軸位T1 mapping 序列，快速自旋回波（T1WI） 序列，橫軸位T2 mapping序列，快速自旋回波（T2WI）序列。

1.4 MRI數據測量及分析

將IVIM 及T2 mapping 的MRI 掃描圖片上傳至聯影處理工作站，使用相應軟件包對圖像進行處理后可生成IVIM 圖像及T2 mapping 圖像，T1 mapping 圖像在MRI 掃描完成后自動生成。選取腎臟橫斷面面積最大的層面及其前后各2個層面，在腎臟對應解剖層（即腎皮質及腎髓質）內選擇至少5 個像素大小的感興趣區域（region of interest,ROI），避開腎竇及偽影區域。見圖1。各個層面獲得其對應MRI參數后將5個層面數據匯總，取其算術平均數為最終參數。

圖1 實時測量時ROI選區 A：IVIM MRI選區圖，可得到真實擴散系數（Dt）、偽擴散系數（D*）、表觀彌散系數（ADC）、灌注分數（f）值；B：T1 mapping MRI選區圖，可得到T1值；C：T2 mapping MRI選區圖，可得到T2值。

1.5 實驗室檢查

于各時間點MRI 掃描結束后，頸靜脈采血，迅速離心血液樣本取上層血清。使用全自動生化分析儀檢測血肌酐及血尿素氮水平。

1.6 病理檢測

每組隨機取2 只仔鼠，予2% 戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射后處死，沿腹中線剪開皮膚后使用實驗鑷鈍性分離腹膜，于腹膜后位分離腎臟取出，沿腎臟最大冠狀面切開，放入4%多聚甲醛中固定24 h，不同濃度乙醇脫水后置于石蠟中包埋切片。

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色：60℃烤石蠟切片12 h；逐層至水，予蘇木精進行染色，蒸餾水沖洗后PBS返藍；予伊紅進行染色，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，置于二甲苯中脫蠟，中性樹膠封片。

Masson 染色：60℃烤石蠟切片4 h；切片脫蠟至水（同HE染色）后甩去切片上水，予適量核染液滴上覆蓋切片組織，染色3～5 min；予自來水沖洗、蒸餾水浸泡、PBS浸泡切片5～10 min返藍；甩去切片上水，適量復染液滴上覆蓋切片組織，染色2 min，沖洗液沖洗；滴上分色液30 s，棄分色液；適量復染液滴上覆蓋切片組織，染色6～8 min，倒去，無水乙醇沖洗；吹干封片。

1.7 統計學分析

采用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計學分析。正態分布計量資料采用均值±標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；各組內腎臟皮質和髓質間計量資料的比較采用兩樣本t檢驗。非正態分布計量資料采用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Dunn's 檢驗；各組內腎臟皮質和髓質間計量資料的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IUGR動物模型

正常對照組平均出生體重為（6.8±0.6）g，低蛋白組平均出生體重為（5.0±0.6）g，兩組差異具有統計學意義（t=-15.914，P＜0.001）。IUGR 組仔鼠IUGR 發生率顯著高于正常組（0% vs 84%；P＜0.05）。以仔鼠死產或生后24 h內死亡定義為圍產期死亡，兩組仔鼠圍產期病死率差異無統計學意義（5% vs 8%；χ2=0.630，P=0.427）。

2.2 各組仔鼠腎臟組織病理檢查結果

HE 染色結果顯示，正常8 周組、正常12 周組仔鼠腎臟皮質腎小球及周圍間質結構清楚，細胞形態良好，腎小球周圍毛細血管呈小葉狀分布，未見炎性細胞浸潤；髓質可見腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞刷狀緣形態正常。IUGR 8 周組仔鼠腎臟皮質出現部分腎小球輕度擴張，間質可見炎性細胞浸潤；髓質偶可見腎小管上皮細胞損傷；IUGR 12周仔鼠腎臟皮質可見部分腎小球萎縮乃至壞死，囊腔消失，炎性細胞浸潤；髓質可見部分腎小管上皮細胞損傷，刷狀緣脫落，部分腎小管管腔擴張，管腔內可見管型及壞死脫落細胞，間質可見纖維化。見圖2。

圖2 各組仔鼠腎小球、腎小管HE、Masson染色圖（光鏡，×400） HE染色結果顯示，正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小球形狀完整，腎小囊清晰，IUGR 12周組可見腎小球萎縮，腎小囊消失，箭頭指示腎小球結構；正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小管結構正常，刷狀緣清晰，IUGR 12周組可見腎小管結構紊亂，刷狀緣脫落，部分可見腎小管上皮細胞脫落，箭頭指示腎小管刷狀緣。Masson染色結果顯示，正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小球形狀完整，腎小囊清晰；IUGR 12周組可見腎小球萎縮，腎小囊消失，藍染較其余3組明顯，提示纖維化改變，箭頭指示腎小球結構。正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小管結構正常，刷狀緣清晰，未見顯著纖維化改變；IUGR 12周組可見腎小管結構紊亂，刷狀緣脫落，部分可見管型，藍染較其余3組明顯，提示纖維化改變，箭頭指示腎小管刷狀緣。

Masson 染色結果顯示，正常8 周組、正常12周組及IUGR 8 周組仔鼠腎臟未見纖維化改變。IUGR 12周組仔鼠可見腎小球壞死、間質纖維化改變。見圖2。

2.3 各組腎臟fMRI結果

各組內腎臟皮質和髓質間ADC值及f值差異無統計學意義，各組間腎臟皮質和髓質間ADC值及f值差異無統計學意義（P＞0.05）。IUGR 12 周組腎臟髓質Dt值高于IUGR 8周組（P＜0.05），各組間腎臟皮質Dt值比較及各組內腎臟皮質和髓質間Dt值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。IUGR 12 周組腎臟髓質D*值低于正常12周組與IUGR 8周組（P＜0.05），各組間腎臟皮質D*值比較及各組內腎臟皮質和髓質間D*值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組腎臟fMRI結果比較 （n=8）

2.4 各組腎臟T1 mapping、T2 mapping結果

IUGR 8 周組腎臟髓質T1 值高于皮質，IUGR 12 周組腎臟髓質T1 值高于IUGR 8 周組與正常12周組，IUGR 12 周組腎臟皮質T1 值高于正常12 周組（P＜0.05）。各組內腎臟髓質T2 值均高于皮質（P＜0.05）；各組腎臟皮質和髓質間T2 值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組腎臟T1、T2值比較 （± s，n=8）

表2 各組腎臟T1、T2值比較 （± s，n=8）

注：a示與IUGR 8周組比較，P＜0.05；b示與正常12周組比較，P＜0.05。

組別正常8周組IUGR 8周組正常12周組IUGR 12周組F值P值T1值T2值皮質1 694±153 1 648±174 1 410±264 1 740±385b 2.988 0.047髓質1 880±254 1 847±94 1 561±340 1 928±313a,b 3.055 0.045 t值-1.272-2.836-0.992-1.075 P值0.224 0.013 0.338 0.301皮質67±4 68±5 66±5 67±2 0.399 0.755髓質81±6 82±8 85±7 85±4 0.888 0.459 t值-5.291-4.233-6.033-11.158 P值＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

2.5 各組血肌酐及血尿素氮含量比較

正常8 周組、IUGR 8 周組、正常12 周組及IUGR 12周組血肌酐及血尿素氮含量差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組血肌酐及血尿素氮含量比較 （± s，n=8）

表3 各組血肌酐及血尿素氮含量比較 （± s，n=8）

組別正常8周組IUGR 8周組正常12周組IUGR 12周組F值P值血肌酐 (μmol/L)28±8 31±7 33±4 35±11 1.237 0.319血尿素氮 (mmol/L)8.4±1.8 10.0±1.3 8.0±0.9 9.4±3.1 1.584 0.220

3 討論

本研究采用雌鼠孕期全程低蛋白飲食成功建立IUGR仔鼠模型。在腎臟病理檢測中IUGR 8周組腎小球僅出現肥大，而IUGR 12周組腎小球出現萎縮、硬化，腎小管出現損傷，腎間質出現炎性細胞浸潤乃至腎纖維化，其中纖維化改變在Masson染色中較為突出。此前研究認為在IUGR 生后早期，腎單位的減少使得剩余腎小球出現代償性肥大及高灌注，而在腎臟中灌注與能量消耗相關的特性使其氧耗增加，最終晚期可見剩余的腎小球出現硬化、壞死、纖維化［3］、，甚至腎小管損傷等病理改變［23］。本研究病理結果與上述研究一致，故認為本模型可應用于IUGR腎損傷的研究。而血肌酐與血尿素氮組間比較并無明顯差異，這可能是由于這兩個指標易受飲食、年齡、身高、肌肉含量等多種因素影響，可靠性欠佳并相對滯后［24］。

多數研究者認為ADC 值、f 值、D*值及Dt值在灌注豐富、水分子擴散活躍的皮質中更高，在部分病理情況下其皮、髓質間差異可消失［25］。本研究中，IUGR 8 周組與正常8 周組在IVIM 圖像上獲得的ADC 值、f 值、D*值及Dt值差異無統計學意義，提示IUGR仔鼠生后早期，腎臟病理改變可能僅為腎小球數目減少，而腎小球工作面積的增加便可維持正常腎功能［26］。IUGR 12 周組髓質D*值較正常12 周組降低，其病理檢查結果提示腎臟出現失代償性修復，其中細胞水腫、炎癥細胞浸潤及腎纖維化等均可導致D*值降低［27］。也有研究認為IUGR 模型中腎素-血管緊張素系統的改變導致D*值出現顯著降低［28］。腎臟髓質對缺氧等損害較為敏感，故D*值的改變主要發生在髓質。而ADC值與被認為較為敏感的Dt值未出現改變，可能是由于腎小球周圍小血管的收縮與腎小球的高灌注可導致其出現截然相反的變化，從而使得改變抵消。

比較IUGR 組第8 周與第12 周結果發現，IUGR 8 周組腎臟髓質D*值高于IUGR 12 周組，而Dt值低于IUGR 12周組。Dt值代表真實水分子擴散水平，在早期IUGR丟失的腎小球可通過剩余腎小球高灌注進行代償，而后期僅剩的腎小球進一步壞死丟失可導致剩余腎小球負荷繼續加重，血漿流量進一步增加，水分子擴散繼續增加，故Dt值隨時間發展升高而D*值下降［29］。

腎臟髓質擁有較豐富的含水量，正常腎臟其皮質T1 值應低于髓質［30］，本研究結果與之相符。各組內皮質、髓質間T1值差異僅在IUGR 8周組有統計學意義，而在IUGR 12周時其組內差異不再有統計學意義。腎小球長期高負荷導致細胞水腫、炎癥細胞浸潤、腎臟皮質腎小球已逐漸出現纖維化、膠原蛋白具有豐富的含水量等，均可導致IUGR 12周組腎臟皮質T1值升高［31］。IUGR 12周組髓質T1 值高于正常12 周組與IUGR 8 周組，提示IUGR仔鼠12周時其腎臟已出現可逆轉的炎癥反應或是不可逆的纖維化改變。既往研究認為處于低氧環境時髓質對于血液灌流及氧消耗的變化較敏感，故IUGR腎損傷首先發生在髓質［32］，這與本研究所觀察到T1 值改變發生在髓質相符，同時，在IVIM中也觀察到代表灌注的D*值在髓質出現改變，認為其可相互印證。以上提示T1 mapping MRI可用于評估IUGR仔鼠腎臟微觀結構及灌注損傷。

本研究顯示，IUGR仔鼠生后12周時其腎臟與正常12 周仔鼠的D*值及T1 值差異有統計學意義，而此時血肌酐及尿素氮無法反映此時腎臟的損傷。對于腎臟損傷的類型IVIM 及T1 mapping MRI 單獨使用時均無法分辨。在多數腎臟病理改變中T1 值及T2 值均可出現相似改變，但在腎臟纖維化中其改變則存在顯著差異［33］。在可逆性急性炎癥反應（即細胞及間質水腫、炎癥細胞浸潤）的情況下，T1值與T2值均出現升高，在腎纖維化時T2值無顯著改變但T1出現升高［11，18，33］。和T1值一樣，一般而言，腎臟髓質T2值高于皮質［34］。本研究觀察到IUGR 12 周組腎臟出現纖維化改變，同時其T1 值較正常12周組高，各組仔鼠腎臟髓質T2值均高于皮質，各組間T2 值比較差異無統計學意義，這與此前的研究相符。以上提示，T1 mapping 聯合T2 mapping MRI可辨別出IUGR仔鼠腎臟纖維化改變。

IVIM MRI是評估及動態觀察IUGR仔鼠腎臟微觀結構及灌注損傷敏感的方法。T1 mapping MRI可用于評估IUGR 仔鼠腎臟損傷；T1 mapping 聯合T2 mapping MRI 可進一步分辨IUGR 仔鼠的腎臟纖維化。

作者貢獻聲明：梁燦、李瑩負責研究設計、分析數據、論文撰寫；賀曉日負責項目主持及指導、研究設計、論文修改、經費支持。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。