中美歐食品中沙門氏菌檢驗標準的比較分析

丁衛平 張士財 伊廷存

摘 要：沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌，與食品安全及人類健康息息相關。檢驗標準是沙門氏菌鑒定的基礎與依 據。為給我國現行食品沙門氏菌檢驗標準的修訂提供參考依據，使我國食品中沙門氏菌的檢測更加科學準確，本文收集了中 國、美國及歐洲的食品沙門氏菌檢驗標準，從適用范圍、預增菌、選擇性增菌、平板分離、鑒定等方面進行了系統比較分析。 結果表明，我國沙門氏菌檢驗標準與歐洲所使用標準較為相似，與美國所使用標準差別較大，建議在我國食品沙門氏菌檢 驗標準的制修訂過程中，借鑒國外同類型標準先進經驗，完善改進我國沙門氏菌檢驗標準，滿足實驗室檢測需要。

關鍵詞：食品，沙門氏菌，檢驗，方法，比較

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.03.034

0 引 言

沙門氏菌為革蘭氏陰性桿菌，是一種重要的食 源性致病菌[1]，廣泛分布于奶和奶制品、肉與肉制 品、蛋及蛋制品等食物中[2-4]。感染沙門氏菌的食品 被人類食用后，可導致腸胃炎、傷寒、副傷寒[5]，呈現 發熱、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[6-7]，癥狀嚴重的甚至 會使患者死亡。據統計，在世界各國的細菌性食物中毒中，由沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，其中 就包括中國[8]。因此，對食品中是否存在沙門氏菌進 行準確鑒定具有十分重要的意義。對于沙門氏菌的 鑒定，中美歐分別采用了不同的檢驗標準。中國所采 用的檢驗標準為GB 4789.4—2016《食品安全國家標 準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[9]。美國所采 用的的檢驗標準為美國食品藥品監督管理局（FDA） 所制定的細菌分析學手冊（Bacteriological Analytical Manual，簡稱BAM）第八版[10]，其最新版本為2023年 4月份修訂版本。歐盟所采取的檢驗標準為國際標準 化組織（International Organization for Standardization， 簡稱ISO）制定的ISO 6579-1：2017《食物鏈微生物 學沙門氏菌檢測、計數和血清分型的水平方法第 1部分：沙門氏菌的檢測》（Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection， enumeration and serotyping of Salmonella - Part 1： Detection of Salmonella spp.）[11]，ISO 6579-1：2017現行版本為2020 年修訂版本，用ISO 6579-1：2017+A1：2020表示。 GB 4789.4—2016從正式實施至今已有7年多的 時間，當前正在開展標準修訂前的各項準備工作。 美歐作為發達國家的代表，深入分析沙門氏菌檢驗 標準，對我國沙門氏菌檢驗標準的修訂具有重要的 意義。本研究針對此問題，對中美歐所使用沙門氏 菌檢驗標準的相同點與不同點進行了深入比較與分 析，并提出了有針對性的意見建議。

1 三種檢驗標準的相同之處

中美歐三種檢驗標準的鑒定步驟都可以分為 四步，即前增菌或稱預增菌、選擇性增菌、平板分 離、鑒定，雖然三種標準每一步的具體操作有所不 同，但大致都可以分為這四個步驟。

2 三種檢驗標準的不同之處

對于三種檢驗標準的不同之處，從以下6個方 面進行逐項分析。

2.1 適用范圍

GB 4789.4—2016第一部分范圍中規定該標準 適用于食品中沙門氏菌的檢驗，但由于我國僅對預 包裝食品及散裝即食食品中的沙門氏菌規定了限 量[12-13]，因此在實際檢驗中，此標準主要用于預包 裝食品及散裝即食食品的檢驗。

ISO 6579-1：2017中規定了該標準的適用范圍， 主要包括供人類食用或動物飼養的產品、在食品生 產和處理范圍內的環境樣品、初級生產階段的樣品 如動物糞便、灰塵和棉簽。

FDA細菌分析學手冊第8版未明確規定標準的 適用范圍，但從該標準的第C部分內容中可以知道 該標準的適用范圍不僅包括27類食品及食品添加 劑，還包括食品周邊環境及苜蓿、綠豆和西蘭花等 作物的發芽灌溉用水。

2.2 預增菌

GB 4789.4—2016預增菌過程為無菌操作稱取 25 g或25 mL樣品，置入盛有225 mL緩沖蛋白胨水 （BPW）的無菌均質杯或合適容器內均質后，再于 36℃±1℃培養8 h～18 h。

ISO 6579-1：2017規定，最常用的預增菌過程 為稱取25 g樣品，加入225 mL BPW 10倍稀釋均質 后進行培養，培養條件為34℃～38℃培養18 h±2 h。 低于25 g的樣品進行檢測時按比例加入BPW達10 倍稀釋即可，超過25 g的樣品及混合樣品根據此方 法進行檢測時需要分別按照ISO 16140及ISO 6887- 1：2017附錄D的規定進行方法驗證。靴襪及灰塵的 稀釋比例不是10倍，具體要求參照ISO 6887。樣品 量大BPW使用量超過1 L時，在與樣品混合前，需預 先將BPW加熱至34℃～38℃。ISO 6579-1：2017還規 定，預增菌液可在5℃最多保存72 h。

FDA細菌分析學手冊第8版中沙門氏菌檢測的 預增菌方法是這3種標準中最為復雜的，其應用范 圍內的29類產品預增菌方法都不相同，用到的預 增菌液類型多達10種，在預增菌正式培養之前還需要進行各種各樣的預處理，伴隨著各種添加劑 的適用。進行預增菌時，樣品稀釋比例通常為25 g （或mL）樣品中加入225 mL液體培養基。樣品量 低于或高于25 g（或mL）時，根據樣品量調整液體 培養基的量，使樣品達到10倍稀釋。部分樣品的 稀釋比例非10倍，如香料中的多香果、肉桂和牛至 稀釋比例為1：100；丁香稀釋比例為1：1000。雖然 不同產品的預增菌方法有所不同，但預增菌的培 養條件基本保持一致，大多要求35℃培養24 h±2 h，少量產品要求35±2℃培養24 h±2 h。值得注 意的是，該方法中還規定，動物性食品預增菌后， 可以直接用環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）進行篩查， 僅LAMP篩查結果為陽性的需要對其預增菌液進 行進一步檢測。

2.3 選擇性增菌

GB 4789.4—2016規定的選擇性增菌過程為 移取1 mL預增菌液，轉種于10 mL 四硫磺酸鈉煌綠 （TTB）內，于42℃±1℃培養18 h～24 h。同時，另取 1 mL，轉種于10 mL 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）內，于 36℃±1℃培養18 h～24 h。

ISO 6579—1：2017規定，對于食品、動物飼料 樣品、食品生產區域環境樣品，其選擇性增菌過 程為取預增菌液0.1mL轉種到含10mL Rappaport[1]Vassiliadis Enrichment Broth（RVS）肉湯的試管中或 Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis（MSRV） 瓊脂平板表面（等距接種1至3個點），于41.5℃培 養24h±3h。同時取預增菌液1mL轉移到Muller[1]Kauffmann Tetrathionate- novobiocin（MKTTn）肉湯 中，于34℃～38℃之間培養24 h±3 h。在干奶制品或 奶酪中，沙門氏菌可能會受到致命的傷害，檢測這些 產品時，選擇性培養基需要額外培養24 h±3 h。還 有一點需要注意的是，MSRV瓊脂用于檢測具有動力 的沙門氏菌，不適用于無動力沙門氏菌株。初級生 產階段樣品的選擇性增菌需要取0.1 mL預增菌液轉 移到MRSV瓊脂平板進行培養，培養條件為41.5℃培 養24 h±3 h，標準中還說明如果使用第2種選擇性培 養基比如MKTTn培養24 h檢測靈敏度能得以改善。

FDA細菌分析學手冊第8版中規定，對于瓜爾 豆膠和懷疑受鼠傷寒沙門氏菌污染的食品，其選擇 性增菌過程為分別取1毫升預增菌液轉種至10 mL SC和10 mL TTB培養基，并在35℃培養24 h±2 h。 其他所有食品的預增菌過程則為，將0.1 mL預增菌 液轉種至10 mL Rappaport-Vassiliadis（RV）培養基， 于42℃±0.2℃條件下培養24 h±2 h；同時另取1 mL 預增菌液轉種至10 mL TTB培養基，這些食品中微 生物負荷量高的食物，轉種至TTB培養基后需要在 43℃±0.2℃條件下培養24 h±2 h，微生物負荷量低 的食物轉種至TTB培養基后則需要在35℃±2.0℃條 件下培養24 h±2 h。

2.4 平板分離

GB 4789.4—2016規定，取培養后的TTB及SC選 擇性增菌液，分別劃線接種于亞硫酸鉍（BS）瓊脂 平板和木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂平板（或 Hektoen Enteric（HE）瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培 養基平板），其中BS 瓊脂平板需要在36℃±1℃培養 40 h～48 h，XLD 瓊脂平板、HE 瓊脂平板、沙門氏菌 屬顯色培養基平板需要在36℃±1℃培養18 h～24 h。

ISO 6579-1：2017規定，對于食品、動物飼料樣 品、食品生產區域環境樣品，其分離步驟為，用接種 環從RVS增菌液或MSRV瓊脂平板及MKTTn增菌液 中蘸取一環后，接種至XLD平板及另外一種選擇性 平板中，另外一種選擇性平板要與XLD瓊脂平板互 補且與XLD判別原理不同。XLD平板的培養條件為 34℃～38℃培養24 h±3 h。對于初級生產階段的樣 品，則用接種環取MSRV瓊脂平板上的菌落接種至 XLD平板及第二種選擇性平板。XLD平板的培養條 件也為34℃～38℃培養24 h±3 h。初級生產階段的 樣品在MSRV瓊脂平板初次培養未生長菌落時，需 要再額外培養24 h±3 h。

FDA細菌分析學手冊第8版中規定，TTB與RV/SC 培養基中培養的增菌液都需要分別劃線接種到BS、XLD、HE三種瓊脂平板上后于35℃培養24 h±2 h。

2.5 鑒定

GB 4789.4—2016中規定，對于選擇性瓊脂平 板上生長的典型和可疑菌落，需要進行生化鑒定及 血清學鑒定，可以自主選做血清學分型。做生化鑒 定時，既可以根據標準中規定的方法逐步開展，也 可以根據三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗結果選 擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統 進行鑒定。血清學鑒定時，要先檢查培養物有無自 凝性，再對無自凝現象的培養物進行多價菌體抗原 及多價鞭毛抗原鑒定。

與GB 4789.4—2016中的規定相似，ISO 6579- 1：2017中也規定，對于選擇性瓊脂平板上生長的典 型和可疑菌落，需要進行生化鑒定及血清學鑒定， 可以自主選做血清學分型。進行生化鑒定時既可以 按照ISO 6579-1：2017規定的方法進行，也可以使用 經驗證的商業化的培養基或生化鑒定試劑盒。ISO 6579-1：2017規定的生化鑒定方法及判定方法較為 簡單，三糖鐵瓊脂試驗、尿素瓊脂試驗、賴氨酸脫 羧酶試驗屬于必做項目，如果這三項試驗無法給 出明確的鑒定結果，可以再做另外兩項生化試驗。 ISO 6579-1：2017還規定，進行血清學鑒定時，要 先排除能夠引發自凝現象的菌株，再進行多價O抗 原、Vi抗原及多價H抗原鑒定，其中Vi抗原鑒定屬 于選做項目。

FDA細菌分析學手冊第8版中規定，與對照菌 株培養產物進行比對后，對于BS、XLD、HE三種瓊 脂平板上生長的可疑性菌落，要先進行三糖鐵瓊脂 試驗及賴氨酸脫羧酶試驗，對于這兩種試驗中被 推定為沙門氏菌的培養物再進行進一步生化鑒定 及血清學鑒定。此方法中生化鑒定方法比較繁瑣， 不再詳述。此標準中血清學鑒定方法主要包括三 種，即多價鞭毛血清學試驗、Spicer-Edwards血清學 試驗及血清學體細胞（O）試驗。初步生化試驗結 果及血清學試驗結果中未表現出典型沙門氏菌反 應的菌落需要進一步用補充生化實驗進行鑒定。值 得注意的是，在本方法中還指出，以下幾種方法是 公認的通用的沙門氏菌的鑒定方法，包括上述三種 血清學試驗方法、5種商業生化系統鑒定方法、實 時定量PCR方法、LAMP方法、ANSR 沙門氏菌確 定方法、布魯克飛行時間質譜生物分型法。在本方 法中還規定，通過生化試驗、血清學試驗方法鑒定 出沙門氏菌后，可送往特定實驗室通過全基因組測 序、seqsero數據庫比對分析或傳統血清學分型方法 進行血清分型。

2.6 修訂次數

GB 4789.4—2016自2017年6月23日實施以來， 尚未進行過修訂。ISO 6579-1：2017自2017年實施以 來，于2020年修訂過一次。FDA細菌分析學手冊第8 版自2000年11月14日正式定稿以來，到目前為止，已 經進行了28次修訂。

3 結 論

從中美歐三種沙門氏菌檢驗標準的分析中可 以看出，GB 4789.4—2016與ISO 6579-1：2017兩個 標準有諸多的相似之處，與FDA細菌分析學手冊 第8版的差異較大。這三種標準中，FDA細菌分析 學手冊第8版沙門氏菌的檢驗方法令人感觸頗深， 具有3個極為明顯的特點。第一個特點是方法規定 最為細致，根據不同食品樣本的特點制定了不同的 前增菌方法，這樣可以最大程度地使樣品中的目標 菌得以增殖，提高預增菌效率，減少漏檢；第二個 特點是對新技術的應用最多，廣泛地將現代科學 技術的最新成果應用于沙門氏菌的鑒定，明確了全 自動生化鑒定系統、實時定量PCR方法、LAMP方 法、ANSR 沙門氏菌確定方法、飛行時間質譜生物 分型法、全基因組測序等新型鑒定技術在沙門氏菌 鑒定中的作用；第三個特點是更新速度快，自2000 年11月14日正式定稿以來，到目前為止已經進行了 28次修訂。

GB 4789.4是國家基礎標準，使用者眾多，影響范圍廣，在國家標準體系中有著非常重要的地位。

標準制定機構應及時對標準進行修訂，使標準符合 用戶需求與時代發展。在標準的修訂過程中，建議 從以下三個方面努力，做好修訂工作。一是要加強 研究，完善標準細節。要對方法中涉及的培養基、 培養條件、試劑等開展詳細科學的研究，確定最優 條件。二是要加大現代科學技術的應用力度。近年 來，迅速發展的分子生物學技術在微生物檢測方面 具有鑒定速度快、準確率高的特點，應加大這些新 技術的運用力度。三是要加快標準修訂速度。應創 新體制機制，改善標準修訂流程，縮短標準修訂時 間。

參考文獻

劉理慧，儲錦華，隋雨欣，等.沙門氏菌中主要毒力因子的研 究進展[J].生物技術通報，2022，38（9）：72-83.

馬愷，周翌婧，鄭東宇，等.2015—2020年江蘇省食源性 疾病主動監測沙門氏菌情況分析[J].公共衛生與預防醫 學，2022，33（6）：33-37.

吳憲.我國食品沙門氏菌污染率與引起的發病率統計分 析[D].大連：大連理工大學，2022.

A R NOL D M E ， M A RT E L L I F， MCL A R EN I ， et al. Estimation of the rate of egg contamination from Salmonella-infected chickens. Zoonoses Public Health. 2014，61（1）：18-27.

陳秀玲.實時熒光雙重SRCA方法檢測食品中沙門氏菌和 志賀氏菌研究[D].保定：河北農業大學，2021.

吳仙陽，國譯丹，楊菁，等.一起家庭自辦宴席引起的都 柏林沙門氏菌食物中毒調查研究報告[J].實用預防醫 學，2023，30（8）：981-984.

李遲. 2016—2022年安徽省某醫院兒童非傷寒沙門氏菌 感染的流行病學特征及耐藥性分析[D].合肥：安徽醫科 大學，2023.

覃湘婕，孫寧與，李春堯，等.食品中沙門氏菌檢測方法研 究進展[J].中國釀造，2020，39（9）：18-24.

中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品 藥品監督管理總局. 食品安全國家標準 食品微生物學 檢驗 沙門氏菌檢驗：GB 4789.4—2016 [S].北京：中國標準 出版社，2016.

ANDREWS W H ， WANG H， JACOBSON A， et al. Bacteriological Analytical Manual （BAM） Chapter 5： Salmonella[EB/OL]. （2023-04-12）［2023-09-06］. https：//www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam[1]chapter-5-salmonella.

Inter national Organization for Standardization. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection， enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1： Detection of Salmonella spp. — Amendment 1： Broader range of incubation temperatures， amendment to the status of Annex D， and correction of the composition of MSRV and SC[EB/OL]. （2020-04-30）［2023-09-05］. https：//www.iso.org/standard/76671.htmL.

中華人民共和國國家衛生健康委員會，國家市場監督 管理總局. 食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限 量：GB 29921—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

中華人民共和國國家衛生健康委員會，國家市場監督管 理總局. 食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限 量：GB 29921—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

作者簡介

丁衛平，高級工程師，分子生物測定室主任，研究方向為食 品檢驗檢測。

張士財，工程師，食品檢驗員，研究方向為食品檢驗檢測。

（責任編輯：袁文靜）