黍稷麩皮多糖分離純化、結構表征及抑菌活性分析

陳燕云，平 華，高 媛，杜遠芳，劉 靜，張麗珍,*

（1.山西大學生命科學學院，山西太原 030006；2.北京市農林科學院質量標準與檢測技術研究所，北京 100097）

黍稷（Panicum miliaceumL.）又稱糜子、黍子，禾本科黍屬一年生草本植物，廣泛種植于山西、陜西等中國北方地區，含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪及鉀、鎂、鈣、磷等大量元素和鐵、銅、鋅、硒等微量元素，具有消炎、抗氧化和預防心腦血管疾病等功效[1]。黍稷磨米去除皮殼后稱黃米，麩皮作為加工副產物，除用作動物飼料外，大部分被丟棄，開發利用程度低[2]。所以黍稷麩皮中活性物質的提取與生物活性研究極其重要。

多糖是由十個以上的單糖聚合在一起形成的碳水化合物。現已從小麥、藜麥等禾本科植物中提取純化出多糖，并對其進行結構表征，發現每種植物多糖具有不同的分子量與單糖組成[3-4]。研究表明多糖具有多種生物活性，如抗氧化[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、免疫調節[7]等作用，廣泛應用于食品、醫藥等領域。如今具有抑菌活性的天然多糖也被發現，研究表明多糖類物質對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均具有不同程度的抑制效果[8]，其對革蘭氏陽性菌的抑制能力高于革蘭氏陰性菌[9]。多糖生物活性高、安全性高、毒副作用小，且從麩皮中提取多糖價格低廉，具有極高的應用價值。

目前關于黍稷麩皮多糖的抑菌活性研究未見報道，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escherichia coli作為常見食源性致病菌對人類生活產生影響，而枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis在植物生長等方面發揮作用[10]，本研究選擇這三種菌具有對比參考價值。多糖生物活性與其結構緊密相關[11]，包括單糖組成比例、官能團類型和糖苷鍵連接方式等。因此，對黍稷麩皮多糖進行分離，并研究其抑菌活性與結構間的構效關系具有重要意義。本實驗旨在通過采用堿提法提取黍稷麩皮多糖，并對其分離純化，分析多糖分子量、單糖組成及結構特征，進而研究其體外抗菌活性，為黍稷加工副產物中營養物質進一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黍稷麩皮 購自山西河曲；無水乙醇、苯酚、硫酸、正丁醇、氯仿、氫氧化鈉、氯化鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；AB-8 大孔樹脂、DEAE 纖維素DE-52、葡聚糖凝膠G-100 北京索萊寶科技有限公司；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、大腸桿菌Escherichia coli本實驗室-80 ℃密封保藏。

JHBE-50V 實驗型閃式提取器 河南盛孚生物科技有限公司；Ifinite 200 Pro 多功能微孔板檢測儀帝肯貿易有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市環宇科學儀器廠；HC-2062 高速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；RV8 旋轉蒸發儀 艾卡儀器設備有限公司；Alpha2-4 LD plus 真空冷凍干燥機 北京博勱行儀器有限公司；MS7-Pro 數控方盤磁力攪拌器 上海世澤生物技術有限公司；依利特液相色譜儀 大連依利特分析儀器公司；高效液相色譜1260 美國安捷倫科技有限公司；Regulus8230 掃描電鏡 日立公司；Dimension Icon 原子力顯微鏡 德國Bruker 公司；STA449F3 TGDSC 同步熱分析 德國Netzsch 公司；MiniFlex 600X-射線衍射儀 日本東京理學公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黍稷麩皮多糖的提取 參考陳樹俊等[12]的方法，稍作修改，黍稷麩皮經提取皂苷多酚等小分子物質后，采用堿提醇沉法對濾渣進行多糖提取，稱取30.00 g 黍稷麩皮濾渣，料液比為1:20（m/V）加入0.16 mol/L 的NaOH 溶液，65 ℃下磁力攪拌浸提2 h，離心過濾得上清液，合并上清液，濃縮至150 mL，加入4 倍體積95%乙醇沉淀過夜，離心收集沉淀，冷凍干燥得粗多糖。

1.2.2 黍稷麩皮多糖的分離純化 將粗多糖溶液用Sevag 試劑（氯仿:正丁醇=4:1）進行脫蛋白處理，用AB-8 大孔樹脂脫色，透析48 h（Mw=3500 Da）。將多糖溶液進行DEAE-52 纖維素柱層析，用蒸餾水、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液依次洗脫，流速為1 mL/min，每5 min 收集一管，采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中的總糖含量[12]，收集洗脫組分，凍干后得到含量較高的多糖組分，經Sephadex G-100 凝膠柱層析，洗脫液經測定收集凍干后得到純化多糖，并通過紫外光譜法測定其純度，測量的波長范圍為200～400 nm[12]。

1.2.3 黍稷麩皮多糖的結構表征

1.2.3.1 分子量分布的測定 參考倪茂君等[13]的方法：采用高效凝膠滲透色譜法，稱取10 mg 的多糖樣品溶于2 mL 水中，配制己知分子量的葡聚糖系列標準品溶液，以保留時間為橫坐標，分子量的對數為縱坐標繪制標準曲線。色譜條件：示差折光檢測器（shodex RI201-H）；色譜柱（TSKgel GMPWxl），柱溫35 ℃；流動相為超純水；流速為1 mL/min；進樣量20.0 μL。

1.2.3.2 單糖組成測定 參考Liang 等[14]的方法：多糖水解及衍生化：稱取10 mg 的多糖樣品，加入2 mol/L 三氟乙酸（TFA）6 mL 在110 ℃下水解3 h，減壓蒸干后加1 mL 甲醇，再蒸干，重復3 次后得到水解產物，加入0.3 mol/L NaOH 200 μL，0.5 mol/L PMP-甲醇200 μL，在70 ℃下水浴進行衍生化1 h，冷卻后加入0.3 mol/L 的HCl 溶液200 μL，用1 mL氯仿萃取，重復萃取3 次后取上清液經0.45 μm 濾膜過濾進行單糖組成測定。

色譜條件：采用UltimateXB-C18色譜柱；流動相：A 為0.05 mol/L 的KH2PO4（pH6.7）；B 為乙腈；A:B=82:18；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；波長：250 nm。

1.2.3.3 傅里葉紅外光譜分析 參考劉露等[15]的方法：稱取5 mg 黍稷麩皮多糖樣品和KBr 混合研勻壓片后，在4000～650 cm-1波長范圍內通過紅外光譜儀掃描，掃描16 次。

1.2.3.4 X-射線衍射分析 參考李占君等[16]的方法：通過XRD 衍射圖譜分析多糖的晶體結構，操作條件：Cukα輻射，管內電壓40 kV，管內電流40 mA，角度4°～60°，角度梯度0.02°，掃描運行速度5 ℃/min。

1.2.3.5 掃描電鏡分析 參考楊許花等[17]的方法：將樣品粘在導電膠上，置于真空離子濺射儀內鍍導電層，時長90 s，厚度7±2 nm，將樣品臺放入冷場掃描電鏡進行抽真空，開啟加速電壓，選二次電子模式，電子槍加速電壓5 kV，選擇不同放大倍數進行拍照測試。

1.2.3.6 原子力顯微鏡（AFM）分析 參考梁濤等[18]的方法：取部分多糖樣品分散到乙醇溶液中進行超聲，然后取幾滴分散好的液體逐滴滴加在云母片上，晾干后，進行原子力顯微鏡觀測。

1.2.3.7 TG-DSC 測定 參考馬永強等[19]的方法：通過同步熱分析TG-DSC 觀察多糖的量熱變化，測試條件：以氮氣為載氣，流速為20 mL/min 溫度升高速率為10 ℃/min 溫度變化范圍為30～800 ℃。

1.2.4 黍稷麩皮多糖體外抑菌活性測定

1.2.4.1 體外抑菌效果測定 采用牛津杯法測定多糖抑菌效果：將菌懸液用生理鹽水依次稀釋10-1，10-2，10-3，10-4倍，用移液槍分別移取50 μL 上述稀釋的菌懸液至凝固的培養皿上，用無菌的涂布棒均勻涂布，置于培養箱中培養24 h，發現當上述菌懸液稀釋10-3倍時培養基中細菌分布的密集度最符合實驗要求。按方法重新制備菌懸液后，稀釋10-3倍，移取50 μL，均勻涂布到無菌的固體培養基上。靜置10 min 后，每個培養皿等距離放置3 個滅菌的牛津杯，將配制好的樣品溶液經0.22 μm 濾膜過濾除菌后各取200 μL 加入牛津杯中，用青霉素作為陽性對照，用無菌生理鹽水作為陰性對照。細菌置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察抑菌圈情況，量取各個培養皿中抑菌圈直徑，各組取平均值后進行比較[20]。

1.2.4.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定 將多糖樣品用無菌水溶解，濃度為15 mg/mL，然后用無菌LB 肉湯稀釋，達到15 mg/mL 至0.9375 mg/mL 的連續梯度濃度。將稀釋后的細菌懸液（100 μL）加入到96 孔微孔板中，然后加入不同的樣品（100 μL）。每個孔中的最終細菌濃度為1×105集落形成單位（CFU/mL）。以無多糖試劑肉湯作為空白對照。以青霉素為陽性對照，96 孔板在37 ℃下孵育24 h。觀察孔中濁度MIC 為抑制細菌生長的多糖的最低濃度[21]。

1.3 數據處理

本研究均進行3 次重復實驗，數據以平均值±標準差表示，采用Origin8.0 和Excel 軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 黍稷麩皮多糖的提取、分離和純化

以葡萄糖質量濃度和其吸光度值繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程為y=7.314x+0.0012，R2=0.999。根據標準曲線，采用苯酚硫酸法測得黍稷麩皮多糖含量為45.7%±0.32%，如圖1 所示，經DEAE-50 纖維素柱分級得到MBP-A（后續稱MBP），由于MBP-B和MBP-C 峰較小即含量較少，則不做后續研究。由圖2 可知，經Sephadex G-100 洗脫后呈現單一對稱峰，經測定純度達到98.40%±0.09%。從圖3 可知，在260 和280 nm 處沒有出現核酸和蛋白質的特征吸收峰，說明MBP 不含核酸和蛋白質，純度較高。

圖1 黍稷麩皮多糖的DEAE-50 洗脫曲線Fig.1 DEAE-50 elution curves of proso millet bran polysaccharide

圖2 黍稷麩皮多糖的Sephadex G-100 洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-100 elution curve of proso millet bran polysaccharide

圖3 黍稷麩皮多糖的紫外光譜圖Fig.3 UV-VIS spectroscopy of proso millet bran polysaccharide

2.2 黍稷麩皮多糖結構表征

2.2.1 分子量分析 采用高效凝膠滲透色譜測定多糖分子量，圖4 可以看出，MBP 在色譜圖中呈現單一峰，保留時間8.76 min，根據標準曲線y=-1.1004x+14.181（R2=0.9984）計算，黍稷麩皮多糖MBP 分子量為3.479×104Da。

圖4 黍稷麩皮多糖凝膠滲透色譜圖Fig.4 Gel permeation chromatogram of proso millet bran polysaccharide

2.2.2 單糖組成分析 混合的單糖標準品色譜圖見圖5。采用PMP 衍生化HPLC 法檢測黍稷麩皮多糖的單糖組成，通過與圖5 對比，得出黍稷麩皮多糖由6 種多糖組成（見圖6），摩爾比為甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.11:0.13:5.86:0.62:1.00:0.52。MBP 是一種中性雜多糖，主要單糖為葡萄糖和阿拉伯糖。與其他一些麥麩等多糖相比，雖然大多數單糖組成相似，但含量最高的單糖卻有所不同，如在Shang 等[22]的研究中麥麩多糖主要由木糖與阿拉伯糖組成。

圖5 混合單糖標準品高效液相圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standard

圖6 黍稷麩皮多糖的單糖色譜圖Fig.6 Composition of proso millet bran polysaccharide

2.2.3 紅外光譜結果分析 采取傅里葉紅外光譜對黍稷麩皮多糖官能團進行分析，由圖7 可知，黍稷麩皮多糖紅外光譜中分子內或分子間氫鍵的OH 伸縮振動在3336.3 cm-1處有一個強吸收峰[23]，在2927.2 cm-1左右的弱吸收帶歸因于不對稱的CH 伸縮振動，在1622.7 cm-1左右的吸收峰是糖環上的C-O 不對稱拉伸峰，這可以說明樣品在4000～650 cm-1波長區域范圍內是具有多糖類物質的一般性共性特征。1022.7 cm-1是吡喃環的特征吸收峰；854.5 cm-1是β型糖苷鍵吸收峰[24]；在1741.18 cm-1處未觀察到吸收峰，表明沒有大量糖醛酸[25]。由上可知，此多糖是一種含β型糖苷鍵結構的吡喃糖。

圖7 黍稷麩皮多糖傅里葉紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectroscopy of proso millet bran polysaccharide

2.2.4 X-射線衍射結果分析 采用X-射線衍射法分析黍稷麩皮多糖MBP 的晶體結構，一般來說，晶體材料呈尖銳的窄衍射峰，而非晶組分呈寬峰。如圖8 所示，MBP 在20°處有一個寬的衍射峰，在32°有少量峰值較小的峰出現，并無較明顯性吸收峰產生，呈現出一種無定形狀態。Ren 等[26]采用XRD 分析藜麥多糖（QP）及其分離純化得到的多糖組分的構象，發現QP 未經進一步分離純化不能形成單晶，以無定形形式存在，而MBP 經分離純化后仍呈現無定形狀態，這可能與提取方式以及分子量大小單糖組成等不同有關，水解程度增加、分子量和聚合度的降低等均會破壞多糖的內部晶體結構。

圖8 黍稷麩皮多糖X 射線衍射結果Fig.8 X-ray diffraction (XRD) patterns of proso millet bran polysaccharide

2.2.5 表觀形貌分析 采用掃描電鏡觀察黍稷麩皮多糖MBP 的表觀形貌，如圖9 所示，SEM 圖中多糖呈現不規則片狀，結構疏松，分子間存在空隙，圖中觀察到一些光滑的球形顆粒和棒狀結構，為多糖聚合物之間的相互連接提供機會。Shang 等[22]從小麥麩皮中提取的多糖呈光滑片狀形態，表面邊緣有褶皺。多糖的形態結構受到原料來源或提取工藝的影響，如超聲波產生的強剪切力會使多糖形態粗糙多孔。

圖9 黍稷麩皮多糖SEM 圖Fig.9 SEM images of proso millet bran polysaccharide

2.2.6 分子形貌分析 采用原子力顯微鏡觀察黍稷麩皮多糖MBP 的分子形貌，如圖10 所示，AFM 圖上出現了相對均勻的顆粒狀結構，多糖分子高度最高為12.46 nm。有研究表明，多糖中的單鏈高度一般在0.1～1.0 nm 范圍內，所以推斷圖中的線性鏈結構是由多條鏈通過范德華力或氫鍵連接締合形成的凝聚結構[27]。

圖10 黍稷麩皮多糖AFM 圖Fig.10 AFM images of proso millet bran polysaccharide

2.2.7 熱性能分析 采用TG-DSC 分析黍稷麩皮多糖MBP 的熱力學性質，如圖11 所示，黍稷麩皮多糖熱重變化主要分為3 個階段：第1 階段，室溫至193.94 ℃，質量損失率為9.17%，質量損失主要是失去了多糖分子中的自由水和結合水；第2 階段，193.94 ℃至389.47 ℃，質量損失率為62.89%，此階段多糖質量損失率加快，熱降解速率和重量損失達到最大值，主要可能是高溫使多糖分子碳鏈和氫鍵被破壞，多糖分子被分解；第3 階段，389.47 ℃至800 ℃，樣品損失率較慢，質量損失率為7.38%。這可能是由炭的熱分解引起的[28]。王鑫等[29]的研究表明小麥麩皮多糖在30～132 ℃溫度范圍內具有較好的穩定性，與之相比，黍稷麩皮多糖在室溫至193.94 ℃范圍內保持穩定，說明黍稷麩皮多糖的熱穩定性更好。差示掃描量熱分析（圖12）顯示黍稷麩皮多糖分別在63.25、257.66、291.29、354.17 ℃有吸熱反應。這可能是由于脫水或外圍多糖鏈和脫羥基化反應，在保護性氣體（氮氣）的保護下并無放熱峰的產生，說明黍稷麩皮多糖MBP 是一種無定形性多糖，這與X 射線條件下的試驗結果一致。結果表明，多糖MBP 的熱穩定性良好，可作為添加物用于需高溫處理食品中[30]。

圖11 黍稷麩皮多糖的熱重分析結果Fig.11 Rmogravimetry analysis curves of proso millet bran polysaccharide

圖12 黍稷麩皮多糖的差示掃描量熱分析Fig.12 Scanning calorimetry curve of proso millet bran polysaccharide

2.3 黍稷麩皮多糖抑菌活性分析

由表1 可知，黍稷麩皮多糖提取物對3 種指示菌中的金黃色葡萄球菌表現出較強的抑制作用，MIC 值為2 mg/mL，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制作用不明顯。黍稷麩皮多糖提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑分別為16.10±0.32，9.30±0.00，10.70±0.32 mm，其中大腸桿菌抑菌圈直徑高于對照青霉素組。多糖對革蘭氏陽性菌的抑菌能力高于革蘭氏陰性菌，可能是因為陽性菌的細胞膜比陰性菌敏感，這與前人關于茯苓多糖抑菌實驗結果一致[31]。周欣[20]研究結果表明香菇多糖對大腸桿菌抑菌作用最強，MIC 為1.25 mg/mL，這可能是由于香菇多糖和黍稷麩皮多糖在結構方面存在差異；香菇多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌MIC 均為2.5 mg/mL，黍稷麩皮多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用略高于香菇多糖。魏磊等[32]研究得出赤松茸多糖對金黃色葡萄球菌的MIC 為25 mg/mL。與之相比，本研究的黍稷麩皮多糖抑菌活性明顯高于赤松茸多糖，且成本更低。因此，利用黍稷麩皮生產飼用多糖作為一種新型、天然的抑菌劑具有良好的開發前景。

3 結論

黍稷麩皮多糖提取物經分離純化后，MBP純度達到98.40%±0.09%，分子量為3.479×104Da，主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖等6 種單糖組成。進一步進行結構鑒定，紅外光譜結果表明MBP 為β型吡喃多糖，掃描電鏡及原子力顯微鏡觀察多糖MBP 的形態學特征多為片層狀結構且連接緊密，X-射線衍射結果表明多糖MBP 在晶體結構方面呈現出無定形狀態，TGDSC 結果表明多糖MBP 具有良好的熱穩定性。通過抑菌實驗，結果表明多糖MBP 對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌活性。本研究為黍稷麩皮的開發提供了參考，為其功能性食品或醫藥工業中的應用提供了理論依據。

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