基于多元曲線分辨的植物中3種光合色素的抗干擾檢測

接收日期：2023-05-08

基金項目：

貴州省煙草公司畢節市公司科技項目（2022520500240187）；貴州省煙草公司科技項目（2021XM24）；貴州省煙草科學研究院科技項目（GZYKY2021-09）；云南省煙草專賣局科技一般項目（2021530000242014）；貴州省基礎研究（自然科學）項目（ZK[2022] 一般126）

*通訊作者：

嚴秀芳（1988—），女，博士，講師，主要從事化學量測的基礎理論與方法學研究，E-mail： xfyan@gzu.edu.cn.

摘" 要：

為克服Arnon公式法測定植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素含量的干擾問題。論文基于可見光譜量測，引入多元曲線分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）算法提取單分析物信號、使用朗伯-比爾定律計算濃度，建立了一種測定植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的定量分析方法，將發展的方法應用于煙草工業烘烤及煙葉醇化過程中3種光合色素的抗干擾定量分析，并對彈簧煙桿裝煙烘烤及煙夾裝煙烘烤的實際體系進行了加標驗證實驗。研究結果表明，預測得到葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的平均相對誤差分別為1.9%和0.2%以及1.2%， 0.8%和1.5%以及3.6%，實驗結果滿足實際檢測的需求。論文提出的方法可為復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素含量的測定提供一種新的選擇。

關鍵詞：

MCR-ALS；紫外可見光譜；葉綠素a；葉綠素b；β-胡蘿卜素

中圖分類號：S132

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）02－0008－09

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.02.002

地球上的生命歸根結底依賴于太陽的能量，植物、藻類和光合細菌的光合作用是獲取這種能量的唯一生物學途徑[1-2]。綠色植物中含有大量葉綠素a和b，葉綠素通過2種不同的光系統將光能轉化為化學能，類胡蘿卜素可作為輔助色素，其把吸收的光能轉移給葉綠素用于光合作用，還能幫助抵御光損傷[3-4]。植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的含量的測定是一項常規的工作，在很多研究中都需要檢測。

關于測定復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的含量，高效液相色譜法（HPLC）甚至液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）是非常好的分離分析策略[5-7]。如果需要在實驗室準確定量分析植物體系中的葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素，HPLC和LC-MS是非常有力、非常準確的分析策略；但如果需要在現場（例如大田試驗現場、烘烤現場）進行快速檢測[8]，HPLC和LC-MS就受儀器價格昂貴、維護要求高、需要昂貴的分析標準品等因素的限制[5-7]。

葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素都具有較大的共軛體系，葉綠素a和b在紅光區的最大吸收波長分別位于663 nm和645 nm，β-胡蘿卜素的最大吸收波長在452 nm[2]，它們有較大的吸光系數，因此使用紫外可見分光光度法測量它們是一種很好的途徑。Daniel I. Arnon在1949年提出了測定葉綠素a和b的著名的Arnon公式[9]，該公式基于波長663 nm和645 nm處的朗伯比爾定律，使用MacKinney在1941年測量的吸光系數[10]，可直接計算葉綠素a和b的濃度。Lichtenthaler等[11]又基于Arnon公式開發出了計算β-胡蘿卜素濃度的類似公式。Arnon公式的優點包括：使用的紫外可見分光光度計價格低廉、維護要求低、不需要昂貴的分析標準品等[6，12]，非常適合農林科學與工程等領域的現場快速分析任務，至今仍然是測定復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的最常用、最經典的方法[13-15]。韋克蘇等人在2021年提出了一種基于光線探頭式近紅外光譜儀快速、無損測定葉綠素和β-胡蘿卜素的方法[16]，該方法需要的基礎濃度數據依然是基于Arnon公式得到的。

顯然，Arnon公式有一個重要的假定：在波長663 nm和645 nm處只有葉綠素a和b對入射光有吸收現象。但是，在復雜植物體系中依然會有一些其他吸光物質在波長663 nm和645 nm處有吸光現象，例如細菌葉綠素a（植物體系若含有細菌，就可能存在這種干擾物質）、葉綠素d、藻藍素等，如圖1所示。在波長470 nm處測定β-胡蘿卜素濃度時，會遇到更多更嚴重的干擾，例如葉綠素d、藻紅素、葉黃素、細胞色素c、黃酮類物質等。光譜干擾引入的誤差大小取決于3個因素：（1）光譜干擾物質的數量；（2）各個光譜干擾物質的濃度；（3）各個光譜干擾物質在上述波長點的吸收系數。這些物質的存在會對3種光合色素的檢測構成嚴重的光譜干擾。如果有種簡便的方法既能保留Arnon公式優點，又能能克服這些光譜干擾的影響，那將有望成為復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素更準確的定量分析方法。

得益于化學量測的基礎理論和方法學的快速發展，化學計量學領域已有一些算法/模型可用于分辨光譜類型的數據[17-18]。通過多元曲線分辨，化學和其他科學領域中存在的非完全選擇性定量分析難題有望借助數學模型使用計算機軟件直接解決，而不必使用復雜、昂貴的實驗技術和儀器裝備（例如昂貴的液相色譜-質譜聯用法）[19-20]。多元曲線分辨-偏最小二乘（MCR-ALS）算法是一種常用的化學計量學方法，特別適合于分辨光譜類型的雙線性數據，它可用于將多組分體系的雙線性量測數據分辨為各組分的純輪廓，從而克服光譜干擾，實現復雜體系中目標分析物的準確定量分析。

本研究工作擬基于可見光譜量測，引入MCR-ALS算法將單分析物信號貢獻從混合信號中提取出來，隨后使用朗伯-比爾定律計算濃度，建立一種快速、抗干擾、準確測定復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的定量分析方法，并將本文提出的定量分析方法應用于煙草工業烘烤過程和不同醇化質量的片煙中3種光合色素的快速定量測定。

1" 材料與方法

1.1" 試驗部分

1.1.1" 試驗材料及樣本制備

煙草工業烘烤過程的葉片樣本制備：選定貴州省黔西市主栽品種云煙87作為研究對象，對上部和中部葉片依次展開烘烤和采樣工作。在烘烤之前對葉片進行初步篩選，挑選大小、形狀、成熟度較一致且完整無病蟲害的葉片約200片，將挑選的葉片分別綁竿并標記（彈簧煙桿和煙夾分別準備2竿，每竿約50片），將標記的兩種綁煙方式的葉片分別裝在兩個烤房（下層靠門左右兩邊），從近門第二竿開始向里排列。在烘烤過程中分別對兩爐煙進行取樣，具體取樣安排如下：依次在點火、36 ℃（變黃初期）、38 ℃（變黃前期）、40 ℃（變黃中期）、42 ℃（變黃后期）、44～46 ℃（定色前期）、48～49 ℃（定色中期）、52～54 ℃（定色后期）、60 ℃（干筋前期）、65 ℃（干筋中期）、68 ℃（干筋后期）等對應時刻取樣，每次取5片煙葉。

煙草工業不同醇化質量片煙樣本的制備：從貴州中煙片煙倉儲庫選取不同產地（黔西南、黔南和六盤水）、不同年份（2019年、2020年、2021年和2022年）入庫的片煙為研究對象，采用5點取樣法從煙箱中采集煙樣，每個樣本取100 g 片煙，混勻后隨機選取10片片煙作為測定對象。

1.1.2" 儀器及參數設置

采用型號為Evolution-201的紫外可見吸收光譜儀（賽默飛世爾，麥迪遜，美國）進行光譜量測，其中，使用1.00 cm的石英比色皿在室溫下操作。光譜量測范圍設定為400～700 nm（間隔1 nm采樣）。光譜帶寬設定為1 nm，積分時間設定為0.03 s，掃描速度設定為1200 nm/min。

1.1.3" 樣本預處理

對葉片樣本，使用打孔器（直徑6 mm）分別在主葉脈兩側上、中、下3個部位，采集6個圓孔小樣，置于5 mL離心管中，用4 mL 95%乙醇溶液萃取24 h后，搖勻，進行光譜測量。另外，以95%乙醇溶液作為空白樣品。由于烘烤過程中葉片的水分含量變化很大，本文統一以單位葉面積所含質量來表示濃度。

1.2" 理論部分

1.2.1" 朗伯-比爾定律

1760年，朗伯發現吸光度與溶液吸收層厚度成正比； 1852年，比爾發現吸光度與吸光物質濃度成正比［6］。上述研究發現形成了光譜定量分析的理論基礎，一般稱之為朗伯-比爾定律：當一束單色光通過含有吸光物質的溶液后，每個吸光物質的吸光度與該物質的濃度和吸收層厚度成正比［6， 7， 12］。該定律可用公式表示為

A = Kbc（1）

式中，A是吸光度，b是吸收層厚度，c是吸光物質的濃度，K是吸光系數。當b的單位取cm、c的單位取g/L時，K的單位為L/（g·cm）。在上述定律中，吸光度對濃度表現出典型的單線性特征，溶液的吸光度等于溶液中所有吸光物質的吸光度之和。

1.2.2" Arnon公式

葉綠素a和b在紅光區的最大吸收波長分別位于663 nm和645 nm，如果在這兩個波長下只有葉綠素a和b對入射光有吸收的現象，則根據朗伯-比爾定律可列出如下二元一次方程組：

A663=KChla，663 bcChla+KChlb，663 bcChlb（2）

A645=KChla，645 bcChla+KChlb，645 bcChlb （3）

式中，A663和A645分別為溶液在663 nm和645 nm的吸光度，cChla和cChlb分別表示葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb）的濃度（g/L），吸收層厚度b為1 cm。葉綠素a和b在663 nm處的吸光系數KChla，663和KChlb，663分別為82.04和9.27 L/（g·cm），葉綠素a和b在645 nm處的吸光系數KChla，645和KChlb，645分別為16.75和45.60 L/（g·cm）［9， 11］。將數值代入公式（2）和（3），并使用消元法解上述二元一次方程組，即可得到計算葉綠素a和b濃度（g/L）的Arnon公式［9， 11， 13-15］：

cChla = （12.72 A663 – 2.59 A645）/1000（4）

cChlb = （22.88 A645 – 4.67 A663）/1000（5）

β-胡蘿卜素的最大吸收波長在470 nm處，如果該處只有葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素對入射光有吸收現象，則β-胡蘿卜素的濃度（g/L）可按如下表達式計算（只用數值運算）：

cβ-Carotene=（A470 – 2.0 cChla – 114.8 cChlb）/245（6）

1.2.1" 雙線性模型

使用紫外可見光譜儀對樣本測量一條光譜（包含J個波長點的吸光度數值），那么將I個樣本（例如，煙葉烘烤或醇化過程中不同時刻采集的樣本）的光譜數據逐行排列就能構建一個數陣D（I個樣本×J個變量）。根據朗伯-比爾定律，這個數陣D中的每一個元素dij可如下表示：

dij=∑Nn=1cinsjn ，i=1，2，…，I;j=1，2，…，J（1）

式中，cin表示第i個樣本中第n個物質的濃度，sjn表示第n個物質在第j個波長處的吸光系數，cin和sjn分別是數陣DI×J的濃度變化輪廓矩陣CI×N和光譜輪廓矩陣SJ×N中第i行第n列和第j行第n列的元素。N表示有吸光作用的組分數。dij分別對cin和sjn都具有線性關系，因此，這個數列符合雙線性模型［21-22］。

1.2.2" MCR-ALS算法

多元曲線分辨-交替最小二乘（Multivariate curve resolution-alternating least squares，MCR-ALS）算法是最常用的多元曲線分辨算法之一，它通過交替迭代方式進行曲線分辨，在需要的情況下可選合適約束條件（例如，非負約束，單峰約束，局部秩約束，封閉性約束，硬模型約束等）以得到更好的分辨結果［23-27］。MCR-ALS非常適合光譜學分辨任務，給出的結果具有明確的物理意義。MCR-ALS已被用于很多儀器分析領域［28-31］，它可被用于將分析儀器的響應矩陣D（樣本中全部有響應組分的混合信號）分解成單個純組分的信號（例如，濃度變化輪廓和光譜輪廓）。

DI×J=CI×N STJ×N+EI×J=c.1 sT.1+c.2" sT.2+…+c.N sT.N+EI×J（2）

式中，C和ST分別是由N個組分在行方向和列方向的輪廓構成的矩陣，E為殘差矩陣。

1.2.3" MCR-ALS輔助可見光譜抗干擾定量策略

為了解決基于紫外可見分光光度法測定植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素時面臨的光譜干擾難題，我們引入MCR-ALS算法，借助多元曲線分辨模型將單分析物的信號從復雜體系的混合信號中提取出來，以克服非完全選擇性定量的難題。本文提出的MCR-ALS輔助可見光譜抗干擾定量策略如圖2所示，以定量分析煙草工業烘烤過程葉片葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素為例，分4步完成：

（1）測量可見光譜。使用紫外可見光譜儀測量每個樣本提取液的可見光譜。（2）用MCR-ALS分辨出待分析物的光譜。將多個樣本（例如，烘烤過程不同時刻采集的樣本）的紫外光譜數據逐行排列得到雙線性混合信號數陣D，并且將標準樣品的光譜數陣Dcal與其排列在一起，使用MCR-ALS算法將其分解為各物質的純濃度變化輪廓矩陣C和純光譜輪廓矩陣ST，之后選出單分析物的純濃度變化輪廓向量cn和純光譜輪廓向量snT。如圖中輪廓矩陣和向量外積形式所示，我們選取400～700 nm區間，通過MCR-ALS分辨雙線性模型分別得到了葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的純濃度變化輪廓向量和純可見光譜，其中，使用主成分分析算法選取組分數為5，對濃度變化輪廓和光譜都使用了非負約束，并且對光譜進行了歸一化操作。（3）重構單分析物的純吸光度矩陣。對于分辨的第n個組分，使用對其分辨的純濃度變化和純光譜輪廓向量，通過向量外積操作重構純吸光度矩陣Dn=cn snT。在這種重構的純吸光度矩陣中，每一行都是該物質的純光譜，不包含研究體系中共存干擾的信號。（4）根據朗伯-比爾定律計算濃度。對單個分析物，選取合適的定量波長并查閱或測量該處的吸光系數，直接根據朗伯-比爾定律A=Kbc計算濃度。

1.2.4" 軟件

使用MCR-ALS GUI 2.0圖形用戶界面進行光譜分辨［32］，在MATLAB（MathWorks）環境下運行，使用配置64位Windows 10操作系統的計算機（處理器為Intel（R） Core（TM） i3-8100 CPU @ 3.60 GHz實現所有計算。MCR-ALS GUI 2.0圖形用戶界面的代碼、相關教程和練習數據集可在多元曲線分辨率網頁（http：//www.mcrals.info）免費查閱下載［32］。

2" 結果與分析

2.1" "基于MCR-ALS和可見光譜數據監測煙草工業烘烤過程中3種光合色素的濃度變化

在煙草工業中，烘烤是決定煙葉最終品質的關鍵程序之一，是一個涉及很多化學物質轉化的復雜過程。其中，葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的轉化是葉片顏色變化的化學物質基礎，且與烤后煙葉的色澤品質直接相關［33］?，F場快速、準確分析烘烤過程中上述色素有重要意義，可為及時、精準優化烘烤參數提出基礎數據。

采用本文發展的方法對用彈簧煙桿裝煙烘烤采集的樣本進行了分析。所獲得的葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的光譜與其標準光譜的相似度分別為0.995 1、0.993 0及0.997 2，結果表明MCR-ALS正確地分辨出了上述3個分析物的光譜。在此過程中，MCR-ALS將雙線性數陣D分解為濃度變化輪廓矩陣C和光譜矩陣S（D=CST）。從矩陣計算的角度看，只要正確分辨出了光譜矩陣S，得到的濃度變化輪廓矩陣C當然是準確且唯一的。對葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的檢測下限分別為0.03、0.02和0.15 μg/mL。對于用煙夾裝煙烘烤所采集的樣本，所分辨的葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的光譜與其標準光譜的相似度分別為0.998 3、0.993 2及0.991 6（相似度數值都在0.99以上），檢測下限分別為0.05、0.03及0.14 μg/mL。

圖3為可見光譜結合MCR-ALS預測的煙葉烘烤過程中煙葉葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的濃度變化箱線圖。使用彈簧煙桿裝煙烘烤的實驗結果列于左側3個子圖（圖3-a， 3-b， 3-c）。鮮葉片中葉綠素a含量在2.5～4.5 μg/cm2左右（對應于本實驗萃取液中葉綠素a濃度1.0～1.8 μg/mL左右），隨烘烤過程的進行，葉綠素a含量快速降低，至大約60 h（兩天半）時基本降至0，大約在0.05～0.1 μg/cm2左右（對應于萃取液中的濃度0.02～0.05 μg/mL左右，基本達紫外可見光譜法的定量下限）。自此至烘烤結束，葉綠素a的含量處于當前紫外可見光譜法的檢測下限之下（可以認為基本為0）。鮮煙葉葉片中葉綠素b含量在1.4 μg/cm2左右，隨烘烤過程的進行，葉綠素b含量逐漸降低（但降解速度較葉綠素a慢），至大約108 h（四天半）時基本降至在0.1 μg/cm2以下，低于紫外可見光譜法的檢測下限。鮮葉片中β-胡蘿卜素含量在0.25～0.5 μg/mL左右，隨烘烤過程的進行，在0至20 h 再到60 h，β-胡蘿卜素含量先升高后降低，在60 h到96 h又輕微升高，而在96 h至烘烤結束基本不變。在整個烘烤過程中，葉片中β-胡蘿卜素含量基本位于0.2 ～1.5 μg/mL（對應于萃取液中類胡蘿卜素濃度0.1～0.6 μg/mL區間），可實現準確確定與監測。使用煙夾裝煙烘烤的實驗結果列于右側3個子圖（圖3-d， 3-e， 3-f），3個分析物的變化趨勢與彈簧煙桿烘烤實驗的變化趨勢沒有明顯差異，β-胡蘿卜素含量在煙烘烤后期呈弱增加的趨勢。

另外，對葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素分別設計了3個水平（5個重復）的加標驗證試驗，其中，葉綠素a的加標水平分別為0.5、1.0、1.5 μg/mL，葉綠素b的加標水平分別為0.2、0.4、0.6 μg/mL，β-胡蘿卜素的加標水平分別為0.2、0.4、0.6 μg/mL。通過上述方式進一步分析了加標樣本。在用彈簧煙桿裝煙烘烤的實驗中，該方法在加標驗證集中預測葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的平均相對誤差分別為1.9%、0.2%及1.2%。在用煙夾裝煙烘烤的實驗中，該方法在加標驗證集中預測葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的平均相對誤差分別為0.8%、1.5%及3.6%。這些結果表明該方法的準確度令人滿意。

2.2" 基于MCR-ALS和可見光譜數據監測煙草工業醇化過程中3種光合色素的濃度變化

使用前面提出的MCR-ALS輔助可見光譜方法，快速、準確地測定了不同醇化程度的片煙中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的濃度變化。對葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素分辨的光譜與其標準光譜的相似度分別為0.999 8、0.988 3及0.996 9，從定性的角度看MCR-ALS正確地分辨出了上述3個分析物的光譜，雖然葉綠素b在藍光區的定性結果不夠好，但并不影響定量結果，因為定量是基于定性結果很好的紅光區的峰而完成的。從矩陣計算的角度看，分辨的濃度變化輪廓矩陣C是準確且唯一的。在醇化階段，片煙已經歷過工業烘烤的階段，葉綠素a和b的含量已非常小，因此，我們后續只討論β-胡蘿卜素，試驗得到β-胡蘿卜素的檢測下限為0.01 μg/mL。

MCR分辨結果和預測的β-胡蘿卜素濃度變化趨勢如圖4所示。首先，測量不同醇化程度片煙的可見光譜；其次，使用MCR-ALS算法進行曲線分辨，分辨出濃度變化輪廓矩陣和光譜輪廓矩陣；再次，重構分析物β-胡蘿卜素的純光譜矩陣；最后，基于分辨-重構的純信號，直接使用朗伯比爾定律計算濃度。純化過程中β-胡蘿卜素濃度的變化趨勢見圖4-h。同樣，也對醇化程度的片煙中β-胡蘿卜素的測定設計了3個水平（各5個平行樣本）的加標驗證試驗，加標水平分別為0.2、0.4、0.6 μg/mL。通過上述方法進一步分析了加標樣本，在加標驗證集中預測β-胡蘿卜素的平均相對誤差為0.8%。這些結果表明該方法的準確度令人滿意。

注：箱線圖自上向下分別是上邊緣、上四分位、中位數、下四分位、下邊緣，異常值用“+”符號表示。

3" 討論與結論

傳統的MCR-ALS算法會設計并測量純分析物的標準樣本（真實濃度cref已知），然后將分辨出的標準樣本的純濃度變化輪廓向量cMCRcal對真實濃度cref進行單變量回歸（構建標準曲線），將分辨出的未知樣本的純濃度變化輪廓向量cMCRunk代入回歸方程（標準曲線）來預測未知樣本的真實濃度。這樣當然更準確，但是葉綠素a和b的分析標準品非常貴。例如，國內試劑供應商阿拉丁銷售的葉綠素a（≥85.0%，色譜級別）價格約為5457元/5 mg，純度僅為大于等于85.0%；國際試劑供應商默克銷售的葉綠素a和葉綠素b（分析標準品級別）的價格都是4302元/1 mg左右。構建一個標準曲線配樣一般需要至少5 mg分析標準品，那么為葉綠素a和葉綠素b構建一次標準曲線的成本就需要大約4萬元。從實驗成本的角度考慮，Arnon公式廣為接受的原因之一就是測定葉綠素a和b時不需要分析標準品。

本研究工作通過引入多元曲線分辨-交替最小二乘算法（MCR-ALS）輔助可見光譜，將葉綠素a和b的純信號從分析體系的混合信號中分辨提取出來，再基于朗伯-比爾定律計算濃度，建立了一種快速、簡單、低成本、抗干擾、準確測定復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的定量分析方法。隨后將提出的這個定量分析方法用于煙草工業烘烤過程中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的濃度和煙草工業醇化過程中β-胡蘿卜素的抗干擾定量分析。另外，對煙葉烘烤的實驗體系還進行了加標驗證實驗，彈簧煙桿裝煙烘烤的加標驗證集中預測得到葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的平均相對誤差分別為1.9%和0.2%以及1.2%，煙夾裝煙烘烤的加標驗證集中預測得到葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的平均相對誤差分別為0.8%和1.5%以及3.6%，實驗結果滿足工業檢測需求。本文所提方法不僅繼承了Arnon公式的優點，而且可以克服分析體系中潛在的光譜干擾，有望為復雜植物體系中葉綠素a和b以及β-胡蘿卜素的定量分析提供一種高選擇性測定方法。

（責任編輯：于慧梅）

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Anti-Interference Determination of Three Photosynthetic Pigments in Plant System Based on Multivariate Curve Resolution

Li Leilei1，Wei Kesu2，Yao Jing3，Huang Lan1，Sun Xiwen1，Zhao Erwei1，Wu Shengjiang2，Chen Yi4，Wang Dejun4，Yan Xiufang5*

（1.Guizhou Tobacco Company Bijie City Company， Bijie 551700， Guizhou， China;

2.Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， Guizhou， China;

3.Bijie Tobacco Company Qianxi Branch Company， Qianxi 551500， Guizhou， China;

4.Baoshan Branch of Yunnan Provincial Tobacco Company， Baoshan 678000， Yunnan， China;

5.College of Tobacco Science， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：

In order to overcome the interference of Arnon formula method in the determination of chlorophyll a， chlorophyll b and β-carotene content in plant system. In this paper，based on visible spectrum measurement， the multivariate curve resolution-alternating least squares （MCR-AIS） algorithm was introduced to extract the single analyte signal from the mixed signal of the analysis system， and then the Lambert-Beer’s law was used to calculate the concentration， an analysis method with some advantages of rapid， simple， low-cost， anti-interference， accurate quantitative was estimated for the determination of chlorophyll a， chlorophyll b and β-carotene in complex plant systems， and the proposed method was applied to the practical analysis system of tobacco industrial baking and tobacco aging process. In addition， the standard addition verification experiments were carried out on the actual system of flue-cured tobacco baking with spring tobacco rod loading method and tobacco clip loading method， the average relative errors of chlorophyll a， chlorophyll b and β-carotene were predicted to be 1.9 %， 0.2 % and 1.2 %， 0.8 %， 1.5 % and 3.6 %， respectively. The experimental results meet the needs of actual detection. The method proposed in this paper could provide a new choice for the determination of chlorophyll a， chlorophyll b and β-carotene in complex plant system.

Keywords：

multivariate curve resolution-alternating least squares; visible spectrum; chlorophyll a; chlorophyll b; β-carotene