參仙升脈口服液中揮發性成分及無機元素研究

宗時宇 黃壯壯 張 紅 李 曄 劉 峰 劉 洋

(1 陜西省中醫藥研究院中藥研究所,西安,710003; 2 陜西步長制藥有限公司,西安,710075)

參仙升脈口服液是用于專門治療緩慢性心律失常的專利中成藥,具有溫補心腎,活血化瘀的作用[1]。該復方制劑由8味中藥組成,包括紅參、淫羊藿、補骨脂(鹽炙)、枸杞子、麻黃、細辛、丹參和水蛭[2]。參仙升脈口服液的化學組成十分復雜,既包括難揮發的黃酮類、苷類、醌類和糖類等成分,又包括具有揮發性的小分子化學物質,還含有多種無機元素。中藥藥效的發揮是基于藥物中多種成分綜合協同作用的結果[3],但目前研究多僅局限于方中單一中藥的化學成分研究[4-5],并不能夠體現中藥復方的整體性和化學成分的復雜多樣性。因此,參仙升脈口服液全方整體化學成分的快速、準確鑒定是一項非常必要又艱巨的工作。

近年來,色譜-質譜聯用技術被廣泛應用于多種化學成分的高效分析鑒定。課題組前期借助超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術手段,對參仙升脈口服液的化學成分進行了快速有效的辨識,共鑒定出160種化學成分。然而,僅利用單一的技術分析手段,對于揮發性成分和無機元素的檢測仍存在一定局限,為了實現對參仙升脈口服液整體化學物質基礎的全面、系統的表征,本研究分別采用頂空氣相色譜質譜聯用(Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry,HS-GC-MS)和電感耦合等離子體質譜(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer,ICP-MS)技術手段,進一步對該復方制劑的揮發性成分和21種無機元素進行分析,為參仙升脈口服液全面的藥效物質基礎研究及安全性評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀(島津公司,日本,型號:TQ8040);GC-MS solution色譜工作站和NIST14 LIBRARY數據庫(島津公司,日本);ICP-MS(賽默飛世爾科技有限公司,美國,型號:ICAP-Q);微波消解儀(CEM公司,美國,型號:Mars6);超純水機(Millipore公司,美國,型號:Mill-Q);電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,型號:SQP]。

1.2 試劑 濃硝酸(默克公司,德國,貨號:PSC01270);DEPC水(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:R0601);校正液(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:88323);各無機元素標準液(國家標準物質研究中心);甲醇(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:A452-4);甲酸(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:A117-50);水為超純水。

1.3 分析樣品 參仙升脈口服液(山東步長制藥股份有限公司,批號:181202)由陜西步長制藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 基于HS-GC-MS的參仙升脈口服液揮發性物質辨識

2.1.1 檢測條件 頂空條件:樣品瓶加熱溫度70 ℃;孵育時間30 min;定量環加熱溫度80 ℃;吸取樣品體積1 mL。GC條件:色譜柱HP-5 ms(60 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm);分流比20∶1;柱箱初始溫度60 ℃;進樣口溫度280 ℃;程序升溫:初始溫度60 ℃,保持1 min,以3 ℃/min速率升至195 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min速率升至240 ℃,保持5 min;載氣N2;柱流量1.5 mL/min;吹掃流量3 mL/min。MS條件:離子源為EI離子源;離子源溫度230 ℃;接口溫度260 ℃;溶劑延遲時間4 min;采集時間5～65 min;采集方式為Q1 Scan;間隔0.3 s;掃描范圍45～600 m/z。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取參仙升脈口服液5 mL,置20 mL頂空進樣瓶中,快速壓蓋密封瓶口,置于頂空自動進樣系統AOC-6000,注入色譜儀分析。

2.1.3 數據處理 質譜數據歸屬利用工作站自帶的Nist 4.0數據庫進行解析,主要考察基峰和二級碎片離子峰的相似程度,根據Nist 4.0數據庫相似性打分選擇分值最高的結果作為化合物歸屬結果,對于打分相同的化合物歸屬,則根據參仙升脈口服液中構成藥材所含有揮發性成分的相關文獻報道進行篩選和歸屬。參仙升脈口服液揮發性成分的GC-MS分析總離子流見圖1。通過搜索數據庫(美國國家標準與技術研究院,National Institute of Standards and Technology,NIST),共鑒定出29個揮發性成分,并以峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。結果顯示,參仙升脈口服液中相對含量較高的揮發性成分有11個,占所鑒定揮發性成分總量的82.64%。這些成分的量由高到低依次為2-甲基-3-丁烯-2-醇(14.71%)、乙酸(11.66%)、1,2-丁二醇(10.77%)、乙二醇(10.47%)、3,5-二甲氧基甲苯(10.06%)、黃樟醚(7.69%)、α-蒎烯(4.54%)、桉葉油醇(4.35%)、β-蒎烯(3.39%)、優葛縷酮(2.57%)和甲基丁香酚(2.43%)。見表1。

表1 參仙升脈口服液的GC-MS解析結果

圖1 參仙升脈口服液GC-MS總離子流

2.2 基于ICP-MS的參仙升脈口服液無機元素分析

2.2.1 檢測條件 ICP-MS工作參數:功率13.5 kW,冷卻氣體積流量15 L/min,載氣體積流量0.8 L/min,輔助氣體積流量0.94 L/min,樣品提升量為1.5 L/min,蠕動泵采集樣品轉速40 r/min,測量條件為積分時間為10 s,數據采集方式為跳峰,單峰采樣點數為3,延遲時間1 s,重復次數3次。采用雙蠕動泵管進樣,按照檢測條件對待測樣品進行檢驗。

2.2.2 標準溶液的制備 精密移取鉻(52Cr)、銅(63Cu和65Cu)、砷(75As)、鎘(111Cd和114Cd)、汞(202Hg)、鉛(208Pb)、鈹(9Be)、硼(11B)、鈉(23Na)、鎂(24Mg)、鋁(27Al)、鉀(39K)、錳(55Mn)、鐵(56Fe)、鎳(58Ni)、鋅(64Zn)、銣(85Rb)、鍶(88Sr)和鋇(137Ba)適量的標準溶液,用10%硝酸溶液稀釋,配制成含上述21種無機元素質量濃度分別為10 μg/mL的混合對照溶液。精密移取混合標準溶液適量,用10%硝酸溶液稀釋,配成含上述各元素質量濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 ng/mL的混合對照溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取參仙升脈口服液1.0 mL,置于聚四氟乙烯消解罐中,加入濃硝酸5 mL,密閉消解罐,放入微波消解儀中,按表2消解條件進行微波消解。消解完全后,消解液冷卻至60 ℃以下,轉入50 mL量瓶中,用DEPC水洗滌消解罐3次,洗液合并于量瓶中,定容至50 mL。

表2 微波消解條件

2.2.4 標準曲線的測定 依照測定條件以濃度為橫坐標、峰強度為縱坐標繪制21種無機元素的標準曲線,得到各元素的回歸方程,線性關系均較好。見表3。

表3 參仙升脈口服液各待測元素回歸方程及含量

2.2.5 供試品的測定 采用ICP-MS對參仙升脈口服液中的21種無機元素進行測定分析,并通過標準曲線計算參仙升脈口服液各待測元素的含量。結果顯示,參仙升脈口服液中含有豐富的Na、Mg和K人體必需的常量元素;較高的Fe、Zn、Mn微量元素;少量的Cd、Pb、As、Hg、Cu重金屬及有害元素。見表3。

3 討論

本研究采用HS-GC-MS分析技術,對參仙升脈口服液中的揮發性化學成分進行了快速分析,共鑒定出29個化學成分,這些成分多數來源于藥材細辛,個別歸屬藥材紅參和麻黃,另有10個成分未找到歸屬藥材。未找到歸屬藥材的成分可能是由口服液制備過程中添加的輔料引入;也存在煎煮、混合等制備工藝過程中,口服液單味或多味組方藥材中的化合物之間相互反應而產生的可能性,該類成分可能與藥物之間的增溶、助溶等相互作用有關[11-12]。本研究所鑒定出的參仙升脈口服液揮發性成分中,蒎烯具有抗氧化、抗衰老作用[13],桉葉油醇對神經系統具有調節作用[14-15],二者均能提高內皮細胞活力,改善血管內皮的功能狀態[16]。甲基丁香酚和黃樟醚是組方藥材細辛的主要活性成分,前者為主要有效成分,具有抗炎、降血壓和保護神經系統的作用[7];而后者則為主要毒性成分,長期使用可致肝臟毒性[17];然而,也有研究表明,甲基丁香酚也具有一定程度的肝臟毒性[18-19]。課題組前期曾對10個不同產地細辛藥材中甲基丁香酚和黃樟醚的含量進行了定量分析與比較,發現2種成分在所檢的所有正品細辛中均占有相對較高的含量[20],這可能成為參仙升脈口服液引發潛在不良反應的因素之一。

無機元素尤其是某些微量元素,與中藥藥效物質的積累及功效的發揮也具有一定的相關性[21],且某些重金屬元素含量超限會直接影響中藥的用藥安全[22-23]。本研究利用ICP-MS對參仙升脈口服液中的21種無機元素進行了定量分析。結果符合2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》9302“中藥有害殘留物限量制定指導原則”中的相關要求(As≤2.0 μg/mL,Hg≤0.2 μg/mL,Pb≤5.0 μg/mL,Cd≤0.3 μg/mL,Cu≤20 μg/mL)[24]。有研究顯示,缺Zn、Mn可致中醫的“腎虛證”[25];具有溫理、補氣助陽一類功效的中藥,Mn含量較高;具有清熱、平肝熄風、活血補陽作用的中藥,Zn的含量較高;補陽藥中Fe、Zn、Mn的含量均較高。本研究結果表明,參仙升脈口服液中Fe、Mn和Zn元素含量在所測元素含量值中均處于較高的水平,這是否與其溫補心腎、活血補陽的功效具有一定的相關性,還需要進一步探究。

揮發性成分和無機元素在中藥藥理活性及臨床療效中發揮重要作用,是中藥物質基礎全面、系統研究不可或缺的部分,對中醫藥現代化具有實際意義。本研究結合HS-GC-MS和ICP-MS技術手段,明晰了參仙升脈口服液中的揮發性化學物質基礎和無機元素的種類及含量,為后續參仙升脈口服液進一步的藥效物質基礎研究、質量控制及安全評價體系的提升提供了參考。

利益沖突聲明:無。