滋腎通關(guān)方對(duì)糖尿病大鼠腎損傷的改善作用及其機(jī)制

梁國(guó)強(qiáng) 蔣春波 王健生

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州,215009; 2 蘇州市吳江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院〔蘇州市吳江區(qū)第二人民醫(yī)院〕,蘇州,215220)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是一種以持續(xù)性蛋白尿和腎功能逐漸下降為特征的臨床綜合征,是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一,目前影響了40%以上的糖尿病患者,是全球終末期腎病的主要病因之一。DN的發(fā)病機(jī)制涉及血流動(dòng)力學(xué)和代謝因素,如慢性高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗和高脂血癥導(dǎo)致代謝失衡與DN的發(fā)生密切相關(guān),病理學(xué)認(rèn)為腎纖維化是DN進(jìn)行性加重的重要因素,因此早期預(yù)防治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的重要科學(xué)問題和挑戰(zhàn)[1]。

滋腎通關(guān)方記載于金元醫(yī)學(xué)著作《蘭室秘藏》(李東垣),由黃柏、知母、肉桂組成。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方能有效改善老年糖尿病前期患者餐后2小時(shí)血糖以及血清胰島素和脂聯(lián)素水平,調(diào)節(jié)血脂等[2];實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其抑制腎盂腎炎大鼠腎臟Toll樣受體和核因子κB的表達(dá),降低炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4),IL-6和IL-10的水平[3]。提示滋腎通關(guān)方具有改善血糖、抗炎癥反應(yīng)以及抑制腎損傷的潛在作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)/Smads通路在腎纖維化發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增炎癥和纖維化信號(hào)促進(jìn)腎病的進(jìn)展[4]。本實(shí)驗(yàn)通過制備糖尿病大鼠早期腎損傷模型,在觀察不同劑量滋腎通關(guān)方對(duì)其腎組織病理改變、血清生化指標(biāo)及炎癥介質(zhì)水平的變化基礎(chǔ)上,觀察其對(duì)TGF-β1/Smads通路蛋白表達(dá)的影響,確定滋腎通關(guān)方對(duì)糖尿病大鼠腎損傷的調(diào)節(jié)作用及其可能的通路,為中醫(yī)藥防治DN提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 50只雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,8周齡,體質(zhì)量180～220 g,購于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司,許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0006。飼養(yǎng)溫度21～24 ℃,濕度55%～65%,在12 h自然光照交替的屏障系統(tǒng)內(nèi)。動(dòng)物研究是按照南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行(倫理審批號(hào):2021倫動(dòng)批062)。

1.1.2 藥物 滋腎通關(guān)方(黃柏30 g、知母30 g、肉桂2 g)中藥飲片均由本院藥學(xué)部提供(購于蘇州市春暉堂飲片廠,批號(hào):210314、210104、210427)。參考前期基礎(chǔ)設(shè)低劑量(7.0 g生藥/kg大鼠),按2倍比例擴(kuò)大設(shè)中劑量、高劑量(14.0 g、28.0 g生藥/kg大鼠)[5]。由本院中心實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員制取低、中和高濃度滋腎通關(guān)方水煎液0.7 g生藥/L、1.4 g生藥/mL和2.8 g生藥/mL備用。戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):57-33-0)。

1.1.3 試劑與儀器 血糖檢測(cè)儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司,型號(hào):ONE TOUCH UltraEasy)及試紙(批號(hào):4795582),尿蛋白定量(CBB法)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):C035-2-1);大鼠腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,貨號(hào):BYE20040、BYE20064、BYE20024);蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C0105M和P0012S);TGF-β1抗體、Smad3抗體、Smad7抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha-smooth Muscle Actin,α-SMA)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗體(Abcam,英國(guó),貨號(hào):ab215715、ab208182、ab272928、ab7817、ab92547、ab9485);全自動(dòng)生化分析儀(日立,日本,型號(hào):7600),低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào):TG-16M);酶標(biāo)儀(雷勃,芬蘭,型號(hào):MK3);顯微鏡(Olympus,日本,型號(hào):CX23)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 50只SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將其隨機(jī)分為5組(每組10只):對(duì)照組、模型組和滋腎通關(guān)方低劑量、中劑量、高劑量(ZSTGF-L、ZSTGF-M、ZSTGF-H)組。模型組和ZSTGF-L、ZSTGF-M、ZSTGF-H組采用在高脂高糖飲食4周后,腹腔一次性注射STZ溶液,注射體積10 mL/kg,注射劑量35 mg/kg。參考文獻(xiàn)模型制備72 h后尾靜脈取血測(cè)定血糖(血糖試紙測(cè)定),當(dāng)空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)>13.9 mmol/L或隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L,即為糖尿病大鼠模型制備成功,7 d后檢測(cè)24 h尿蛋白定量(CCB法),當(dāng)濃度>20 mg/24 h,即為糖尿病腎損傷模型大鼠構(gòu)建成功[6]。經(jīng)檢測(cè)各造模大鼠均符合要求。

1.2.2 干預(yù)方法 模型制備成功后,ZSTGF-L、ZSTGF-M和ZSTGF-H組大鼠每天分別灌胃滋腎通關(guān)方水煎液7.0 g生藥/kg、14.0 g生藥/kg和28.0 g生藥/kg,對(duì)照組和模型組的大鼠灌胃等量生理鹽水。每天灌胃1次,連續(xù)4周,每周檢測(cè)各組FBG 1次。末次給藥后停止食物供給,于24 h后以戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉取血,放入10 mL離心管中,靜置2 h后分離血清后備用。然后立即安樂處死大鼠,取左腎組織用于4%多聚甲醛溶液固定,右腎組織置液氮速凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 HE染色檢測(cè)腎組織病理改變,將收集的腎組織用4%多聚甲醛固定,然后用梯度乙醇脫水,用二甲苯去除梯度乙醇,最后用石蠟包埋切片(尺寸:50 μm)、染色,在生物光鏡下觀察腎臟組織損傷和形態(tài)紊亂病變。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清腎功能指標(biāo)血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,Cr)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、三酰甘油(Triacylglycerol,TG)水平;同步采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腎組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平,將腎組織放入蛋白酶抑制劑PMSF的裂解緩沖液中裂解,4 ℃,13 000 r/min離心15 min,離心半徑10 cm。然后用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白濃度。蛋白裂解液與樣品蛋白分離緩沖液混合,95 ℃變性5 min,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分離20 μg蛋白,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封膜2 h,然后用特異性一抗在4 ℃下孵育過夜。最后,將膜和相應(yīng)的二抗在室溫下孵育2 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光、曝光顯影后,利用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG的比較 與對(duì)照組比較,模型組FBG水平明顯升高(P<0.05),4次(1次/周)檢測(cè)到FBG水平均高于16.7 mmol/L,均值達(dá)到23.0 mmol/L。滋腎通關(guān)方不同劑量干預(yù)后,大鼠FBG水平均有不同程度下降。在第4周時(shí),ZSTGF-L、M和H組FBG濃度均值分別為19.0 mmol/L、18.0 mmol/L和15.0 mmol/L,與模型組比較,滋腎通關(guān)方各組大鼠FBG水平明顯降低(均P<0.05)。見圖1。

圖1 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對(duì)糖尿病腎損傷大鼠FBG水平的影響

2.2 病理學(xué)觀察腎組織病理變化 對(duì)照組大鼠的腎組織HE染色未見病理改變,而模型組大鼠腎組織損傷明顯,表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞脫離水腫,腎小球系膜細(xì)胞增殖,腎小球基底膜擴(kuò)張,腎小管擴(kuò)張萎縮,局灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維增生,糖原豐富。滋腎通關(guān)方治療可減輕上述損傷,其中滋腎通關(guān)方中劑量、高劑量組對(duì)DN大鼠的腎組織保護(hù)作用顯著。滋腎通關(guān)方可改善DN大鼠的腎損傷,且隨著劑量的增加,作用更為顯著。見圖2。

圖2 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對(duì)糖尿病腎損傷大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響(HE染色,×400)

2.3 對(duì)糖尿病大鼠腎功能損傷的影響 與對(duì)照組比較,模型組BUN、Cr、TC和TG水平均顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,滋腎通關(guān)方低劑量、中劑量、高劑量組大鼠血清的BUN、Cr、TC、TG水平均顯著降低(P<0.05),且隨劑量增加下降更顯著。提示滋腎通關(guān)方可明顯改善糖尿病大鼠腎功能損害。見圖3。

圖3 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對(duì)糖尿病腎損傷大鼠腎功能的影響

2.4 各組大鼠血清炎癥介質(zhì)水平比較 與對(duì)照組比較,模型組的大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,滋腎通關(guān)方低劑量、中劑量、高劑量組的大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著降低(均P<0.05),且隨其劑量的增加下降更明顯。見圖4。

圖4 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對(duì)糖尿病腎損傷大鼠血清炎癥介質(zhì)水平的影響

2.5 各組腎臟TGF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,模型組TGF-β1、Smad3、α-SMA、波形蛋白表達(dá)水平顯著升高,Smad7蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。滋腎通關(guān)方低劑量組與模型組比較,蛋白表達(dá)水平TGF-β1和α-SMA具有下調(diào)趨勢(shì)且Smad3和波形蛋白顯著下調(diào)(均P<0.05),而Smad7顯著升高(P<0.05)。滋腎通關(guān)方中劑量、高劑量組與模型組比較,TGF-β1、Smad3、α-SMA、波形蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(均P<0.05),Smad7蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),且呈一定的濃度依賴性。見圖5。

圖5 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對(duì)糖尿病腎損傷大鼠腎臟TGF-β1/Smads通路表達(dá)的影響

3 討論

中醫(yī)藥在防治腎纖維化方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),腎纖維化信號(hào)通路研究也成為篩選和研究中藥作用機(jī)制和靶點(diǎn)手段[7]。中醫(yī)藥對(duì)DN防治的療效確切,研究表明,中醫(yī)藥能干預(yù)糖尿病腎損傷的炎癥反應(yīng)[8],通過抑制腎小管上皮細(xì)胞的焦亡、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種作用機(jī)制發(fā)揮治療作用[9]。

基于“滋陰清熱”立論的滋腎通關(guān)方以黃柏、知母等量配伍,少佐肉桂。黃柏清熱燥濕,瀉火除蒸為君,知母清熱瀉火,滋陰潤(rùn)燥為臣,二者相須為用,有補(bǔ)水瀉火、滋陰清熱之功,主治陰虛內(nèi)熱、骨蒸盜汗,是典型的治療消渴的藥對(duì);肉桂補(bǔ)火助陽,引火歸元,散寒止痛,溫通經(jīng)脈為佐藥,既能溫補(bǔ)腎陽、行氣利水,又有緩和知母黃柏甘寒苦寒之效,三者共奏“滋補(bǔ)陰液、清利內(nèi)熱”標(biāo)本兼治之功效,又無甘寒苦寒傷脾胃之弊。臨床上近代名醫(yī)施今墨以藥對(duì)形式將其應(yīng)用于糖尿病之“下消”,證見小便混濁、如膏如脂者[10],臨床觀察發(fā)現(xiàn)以該方為主聯(lián)合西藥口服顯著降低早期DN患者24 h尿蛋白定量、尿微量白蛋白,并提高血漿白蛋白水平,總有效率明顯優(yōu)于單用西藥患者[11];另外在減輕腎損傷、縮短術(shù)后臨床癥狀和提高療效等方面取得了較為滿意的療效[12]。

當(dāng)前循證醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)了降糖藥物通過調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂對(duì)糖尿病腎臟的保護(hù)作用,但是長(zhǎng)期預(yù)后及安全性尚待進(jìn)一步考察,藥物不良反應(yīng)也有所報(bào)道[13]。本研究采用高脂高糖飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病早期腎損傷大鼠模型,與對(duì)照組比較,FBG水平和BUN、Cr、TC、TG水平均顯著升高,且出現(xiàn)腎病理學(xué)損傷情況。通過滋腎通關(guān)方治療4周后,發(fā)現(xiàn)糖尿病腎損傷大鼠FBG水平和BUN、Cr、TC、TG水平均明顯降低,腎病理學(xué)損傷得到有效改善且隨著劑量的增加效果更加顯著。表明滋腎通關(guān)方對(duì)脂高糖飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟損傷有潛在的治療作用。

炎癥是DN發(fā)病的主要因素。在糖尿病情況下,巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)腎臟,并創(chuàng)造一種炎癥環(huán)境,幾乎對(duì)所有的腎細(xì)胞產(chǎn)生有害影響,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積、間質(zhì)纖維化和細(xì)胞功能障礙,最終導(dǎo)致蛋白尿,不同的炎癥成分,包括脂肪因子、Toll樣受體、趨化因子、黏附分子和炎癥介質(zhì),可能是DN等并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素[14]。研究表明,腎病患者藥物治療后血清炎癥標(biāo)志物TNF-α、IL-6、IL-18水平顯著降低,抗炎細(xì)胞因子IL-10水平顯著升高[15]。近年來中醫(yī)藥醫(yī)家針對(duì)DN的炎癥反應(yīng)探討其病機(jī)特點(diǎn),認(rèn)為熱邪與DN早期炎癥反應(yīng)密切相關(guān),如腎小球血流量大、流速快、濾過功能亢進(jìn)與中醫(yī)“陽熱亢進(jìn)、熱迫血行”表現(xiàn)相符合[16];結(jié)合微觀辨證理論分析DN早期為腎絡(luò)癥瘕形成的早期,熱入腎絡(luò),邪正相爭(zhēng)于腎之脈絡(luò),熱傷氣陰,腎絡(luò)受損,炎癥通路和炎癥介質(zhì)被激活[17]。可見陰虛為其病之本,內(nèi)熱為其病之標(biāo),本虛標(biāo)實(shí)。傳統(tǒng)中醫(yī)常以“滋陰清熱”立法,滋陰扶正,清熱祛邪,以求標(biāo)本兼治。滋腎通關(guān)方原方主治“不渴而小便閉,熱在下焦血分”,方中黃柏色黃味苦,入腎經(jīng)血分,瀉下焦火;知母性寒,滋腎水以瀉熱;肉桂辛熱,色赤入血,用以反佐,取中醫(yī)“寒因熱用”與“甘苦合化”之意,其主證與糖尿病腎損傷早期炎癥反應(yīng)的中醫(yī)病機(jī)相符。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較,模型組的大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高,而滋腎通關(guān)方明顯降低了糖尿病大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥指標(biāo)的水平,且隨劑量的增加下降更明顯。提示滋腎通關(guān)方治療可能通過改善腎臟炎癥環(huán)境而對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子,具有多種生理功能,TGF-β被認(rèn)為是參與血管系統(tǒng)和腎臟纖維化疾病的關(guān)鍵纖維化細(xì)胞因子之一,其可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增炎癥和纖維化信號(hào)促進(jìn)腎病的進(jìn)展[18]。TGF-β1/Smads信號(hào)通路被認(rèn)為是腎纖維化發(fā)展的關(guān)鍵途徑,TGF-β1與TGF-β Ⅱ型受體結(jié)合激活TGF-β Ⅰ型受體,導(dǎo)致Smad2和Smad3磷酸化,激活的Smad2和Smad3與Smad4形成復(fù)合物,從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)到細(xì)胞核,并在纖維化基因表達(dá)中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[19]。Smad3在纖維形成過程中高度激活,抑制性Smad7的表達(dá)顯著下調(diào)。Smad3和Smad7之間平衡的改變導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的積累和激活、細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生以及細(xì)胞外基質(zhì)降解的減少。有研究認(rèn)為,同時(shí)下調(diào)Smad3和上調(diào)Smad7表達(dá)有助于腎病模型中腎纖維化的治療[20]。本研究中,與對(duì)照組比較,模型組大鼠的腎臟中TGF-β1和Smad3過表達(dá),而Smad7的表達(dá)明顯降低,提示了糖尿病大鼠腎臟可能發(fā)生纖維化。經(jīng)過滋腎通關(guān)方治療4周后,糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號(hào)明顯減弱,提示滋腎通關(guān)方可能通過介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào),抑制了腎臟纖維化進(jìn)程。另外肌成纖維細(xì)胞是引起膠原過度沉積、促進(jìn)腎纖維化的主要細(xì)胞類型,α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志,波形蛋白是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞骨架形成的基礎(chǔ)。研究表明,抑制波形蛋白的表達(dá)有助于減少與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的腎纖維化的發(fā)展[21]。我們進(jìn)一步檢測(cè)了α-SMA和波形蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)滋腎通關(guān)方明顯降低了糖尿病大鼠腎臟中α-SMA和波形蛋白的過表達(dá)水平,進(jìn)一步證明滋腎通關(guān)方可能抑制糖尿病大鼠腎臟纖維化的進(jìn)展。

綜上所述,滋腎通關(guān)方可明顯減輕糖尿病大鼠腎臟損傷,改善腎功能,且呈濃度依賴性,其機(jī)制可能與滋腎通關(guān)方通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路降低炎癥反應(yīng)有關(guān),從而阻止糖尿病大鼠腎纖維化進(jìn)程,最終改善腎功能損害。

利益沖突聲明:無。