芒柄花素通過miR-1229/ZDHHC9分子軸對膠質瘤細胞增殖、活力及凋亡的影響

黃淵智 劉紅玲

(欽州市第二人民醫院,欽州,535099)

膠質瘤是一類來源于神經膠質細胞的顱內腫瘤,其病死率高,預后較差[1]。盡管在診斷和治療膠質瘤方面取得了重大進展,但患者的中位生存率很低[2]。微RNA(miRNAs)是一種非編碼RNA,其已被證實可通過靶向mRNA的3′非翻譯區域(3′Untranslated Region,3′UTR)改變基因的表達,參與調控疾病的進展[3]。研究表明,miRNAs在膠質瘤的發生和發展中起至關重要的作用,可作為膠質瘤靶向治療的新方向[4]。近年來隨著科學的進步,中藥由于其抗腫瘤安全性高、不良反應小、抑制作用持久等優點,已成為抑制腫瘤生長的重要手段[5],目前已有多種中藥有效成分被證實對膠質瘤具有顯著的抑制效果[6]。芒柄花素是從雞血藤、紅三葉草、黃芪等草本植物中提取的一種植物異黃酮,對多種腫瘤均有抑瘤作用,且其可通過靶向調控miRNAs表達發揮抑癌作用[7-8]。有研究表明miR-1229和在膠質瘤癌組織中差異表達、低表達的miR-1229與膠質瘤細胞的惡性生物學行為密切相關[9]。已證實鋅指DHHC型棕櫚酰轉移酶9(Zinc Finger DHHC-type Palmitoyltransferase 9 Gene,ZDHHC9)可通過調節細胞免疫逃逸參與膠質瘤進程[10],在本實驗預實驗中發現miR-1229與ZDHHC9具有靶向結合位點,但miR-1229/ZDHHC9分子軸在膠質瘤中的調控作用還未見報道。有研究報道,芒柄花素對膠質瘤的發展也具有一定的抑制作用[11],但關于芒柄花素對膠質瘤的作用及其作用機制的研究仍較少。因此,本研究通過在線數據庫篩選膠質瘤中差異表達的mRNAs,進一步探討芒柄花素對差異表達mRNAs的調控作用,并深入探究芒柄花素抑制膠質瘤細胞生長的靶向調控機制,以期為中藥防治膠質瘤提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 膠質瘤細胞U251、BT325、TJ905均購自上海盈灣生物科技有限公司(貨號分別為C1135、C1624、C1377);膠質瘤T98細胞株購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號:YS1100C);人腦正常膠質細胞株HEB購自上海莼試生物技術有限公司(貨號:CS-X0178)。

1.1.2 動物 30只6～8周齡BALB/c裸鼠,體質量18～22 g,雌雄各半,購自廣西壯族自治區食品藥品檢驗所,許可證號為SCXK桂2022-0001。本實驗已獲得欽州市第二人民醫院倫理委員會的批準(倫理審批號:2023-10-17)。小鼠均飼養在清潔級恒溫動物房中,溫度(22±2)℃,濕度為50%～60%,自由飲食水,適應性生長1周后進行后續實驗。

1.1.3 藥物 芒柄花素購自武漢科斯坦生物科技有限公司,純度:98%。貨號:PS0215-0025。

1.1.4 試劑與儀器 改良培養基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium,DMEM)(上海戶實醫藥科技有限公司,貨號:12800-017);Lipofectamine 2000轉染試劑(上海創賽科技有限公司,貨號:11668-027);miR-NC、miR-1229 mimic、棕櫚酰化轉移酶9(Palmitoyltransferase 9,ZDHHC9)過表達質粒及所有引物序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供;兔單克隆增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)抗體(Abcam公司,英國,貨號:ab265609);細胞計數試劑盒8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)(上海澤葉生物科技有限公司,貨號:ZY121205);兔ZDHHC9多克隆抗體(Abcam公司,英國,貨號:ab74504);TRIzol試劑(上海愛必信生物科技有限公司,貨號:abs60154);逆轉錄試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司,貨號:XY-PCR-1590);一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C1086);Edu試劑盒(廣州銳博生物技術有限公司,貨號:C10310-1);BCA蛋白法檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,貨號:mlsw_E0768);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:KFS303);辣根過氧化物酶標記二抗(北京博爾西科技有限公司,貨號:BHR102)。酶標儀(美谷分子儀器有限公司,型號:SpectraMax i3x);倒置熒光顯微鏡(徠卡微系統有限公司,德國,型號:DMi8-電動);實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司,型號:SLAN-96S);預制凝膠蛋白電泳系統(賽默飛世爾科技公司,美國,型號:Bolt TM Bis-Tris Plus)。

1.2 方法

1.2.1 體外實驗

1.2.1.1 細胞培養與分組 所有細胞均于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基中,置于恒溫培養箱(5%二氧化碳,37 ℃)中進行培養,待細胞融合至70%～80%時進行消化(0.25%)傳代。并將TJ905細胞按照簡單隨機法分為空白對照組、20 μmol/L處理組、50 μmol/L處理組、80 μmol/L處理組、110 μmol/L處理組、110 μmol/L+miR-1229組、110 μmol/L+miR-1229+ZDHHC9組、miR-NC組、miR-1229 mimic組。

1.2.1.2 轉染與藥物干預 空白對照組細胞不做處理,20 μmol/L處理組、50 μmol/L處理組、80 μmol/L處理組、110 μmol/L處理組細胞分別使用20/50/80/110 μmol/L的芒柄花素處理細胞;110 μmol/L+miR-1229組細胞先使用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-1229 mimic質粒轉染至細胞48 h后再用110 μmol/L的芒柄花素繼續處理細胞;110 μmol/L+miR-1229+ZDHHC9組細胞先用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-1229 mimic和過表達ZDHHC9質粒轉染至細胞48 h后再使用110 μmol/L的芒柄花素繼續處理細胞;miR-NC組、miR-1229 mimic組分別使用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-NC和miR-1229 mimic質粒轉染至細胞48 h。

1.2.1.3 觀察指標 1)CCK-8法檢測細胞活力。收集TJ905細胞,并接種于96孔板中,每孔接種5 000個細胞,在培養箱中培養24 h后按照1.2.1中方法進行藥物處理細胞,分別在處理24、48、72、96 h后棄培養液,然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,在培養箱中繼續培養1 h,用酶標儀檢測波長450 nm處吸光值(OD值)。

2)Edu法檢測各組細胞增殖。將細胞接種于96孔板,按照1.2.1中分組處理細胞,然后每孔加入100 μL的Edu試劑(50 μmol/L),培養箱孵育2 h后棄上清,并使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗后加入50 μL多聚甲醛(4%)固定細胞30 min,加入50 μL的甘氨酸(2 mg/mL)室溫孵育5 min后棄甘氨酸,然后加入100 μL的滲透劑,10 min后棄去滲透劑并清洗。進行Apollo染色,用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復染細胞核(藍色熒光)30 min,用熒光顯微鏡觀察并隨機采集5個視野進行拍照。細胞增殖率=Edu各觀察組陽性細胞數/各觀察組總細胞數×100%。

3)TUNEL法檢測細胞凋亡率。收集各組TJ905細胞,用多聚甲醛固定30 min,用含0.3% Triton X-100的PBS室溫孵育5 min,加入50 μL的TUNEL檢測液(綠色熒光),37 ℃避光孵育1 h,并使用DAPI進行核復染。熒光顯微鏡觀察,并計算TUNEL陽性細胞率。

4)實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)法檢測細胞miR-1229和ZDHHC9 mRNA表達。收集各膠質瘤細胞以及miR-NC組、miR-1229 mimic組TJ905細胞,使用TRIzol法提取細胞中總RNA,并檢測其質量和濃度,用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA,以cDNA為模板進行實時定量PCR擴增,反應體系:1 μL cDNA、10 μL SYBR supermix染料、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、8.2 μL d H2O。反應條件:95 ℃預變性30 s(1循環),95 ℃ 60 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(40循環)。并分別以U6和GAPDH為內參,用2-△△Ct法分析miR-1229和ZDHHC9 mRNA的相對表達量。各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

5)檢測相關蛋白表達。收集各組細胞加入放射免疫沉淀法(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液后提取總蛋白,二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid Assay,BCA)法測定蛋白的濃度,取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,結束后轉膜(聚偏二氟乙烯(Poly Vinylidene Fluoride,PVDF)膜,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加ZDHHC9一抗稀釋液(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜,次日滴加二抗(1∶5 000)孵育2 h后進行ECL顯影,并拍照,以GAPDH為內參使用Image J軟件進行灰度值分析,使用目的蛋白條帶灰度值/內參條帶的灰度值表示蛋白相對表達量。

6)生物信息學分析。通過dbDEMC數據庫(https://www.biosino.org/)miRNAs芯片(ID:EXP00174)對影響膠質瘤異常表達相關的miRNAs進行篩選,篩選到異常表達的miR-1229,通過Targetscan(https://www.targetscan.org/)在線數據庫預測miR-1229下游靶基因ZDHHC9,通過基因表達譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2,Gepia2)數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(https://www.cancer.gov/)數據庫篩查ZDHHC9在膠質瘤組織中的表達情況。

7)雙熒光素酶報告基因法驗證ZDHHC9與miR-1229靶向結合。將ZDHHC9野生型和突變型3′-UTR克隆到熒光素酶報告載體上,將TJ905細胞接種于96孔板,接種密度為每孔10 000個細胞,將3′-UTR質粒與miR-1229 NC或miR-1229 mimic共轉染至TJ905細胞,轉染48 h后通過雙熒光素酶報告分析系統檢測熒光素酶活力(將相對的Renilla熒光素酶活力進行歸一化作為對照)。

1.2.2 體內實驗

1.2.2.1 小鼠皮下移植瘤模型制備與分組 使用不含血清的培養基將TJ905細胞制備成細胞懸液,并調整為5×107個/mL,然后進行移植瘤構建。背部皮下注射5×106個TJ905細胞(0.1 mL)到裸鼠體內,接種后第5天觀察成瘤情況,在接種部位觸摸到結節的小鼠為構建成功。將構建成功的小鼠按照簡單隨機法分為空白對照組、5.72 mg/kg喂藥組、14.31 mg/kg喂藥組、22.9 mg/kg喂藥組、31.49 mg/kg喂藥組,每組6只。

1.2.2.2 藥物干預 空白對照組灌胃給予等量的生理鹽水,72 mg/kg喂藥組、14.31 mg/kg喂藥組、22.9 mg/kg喂藥組、31.49 mg/kg喂藥組小鼠分別灌胃給予5.72、14.31、22.9、31.49 mg/kg的芒柄花素,1次/d,連續5周。

1.2.2.3 觀察指標 1)腫瘤體積和重量檢測。從給藥后第7天開始(記為第1周),每隔1周使用游標卡尺測量腫瘤的長經、短徑,并計算腫瘤體積[腫瘤體積(mm3)=長徑×短徑2/2]。處理結束后腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉后處死小鼠并取移植瘤,稱取瘤重,并用于后續實驗。

2)免疫組織化學法檢測腫瘤組織PCNA蛋白表達。取各組小鼠腫瘤組織,進行常規石蠟包埋后切片(4 μm),脫蠟后進行阻斷內源性過氧化物酶,然后PBS清洗后進行抗原修復,使用自來水沖洗干凈后加入PCNA一抗稀釋液(1∶1 200)孵育30 min,結束后滴加二抗孵育30 min,然后根據試劑盒操作進行二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色,封片后使用顯微鏡進行觀察(PCNA陽性著色為黃棕色),以黃棕色陽性表達的顆粒的平均光密度值表達PCNA蛋白的表達水平。生物學重復實驗3次。

2 結果

2.1 芒柄花素對TJ905細胞增殖、活力及凋亡的影響 與空白對照組比較,各濃度芒柄花素處理組細胞增殖率均低(均P<0.05)。見圖1A。與空白對照組比較,培養96 h各濃度芒柄花素處理組OD值均低(均P<0.05)。見圖1B;與空白對照組比較,各濃度芒柄花素處理組細胞凋亡率均高(均P<0.05)。見圖1C。

圖1 各組膠質瘤細胞增殖率、活力及凋亡率比較

2.2 芒柄花素對皮下移植瘤小鼠腫瘤生長的影響 與空白對照組比較,各劑量芒柄花素處理組小鼠21 d后腫瘤重量及體積均低(均P<0.05)。見圖2A～C。與空白對照組比較,各劑量芒柄花素處理組小鼠腫瘤組織中PCNA蛋白表達低(均P<0.05)。見圖2D。

圖2 不同劑量芒柄花素對皮下移植瘤重量、體積及PCNA表達的影響

2.3 miR-1229與ZDHHC9的靶向結合 通過dbDEMC數據庫miRNAs芯片(ID:EXP00174)對影響膠質瘤異常表達相關的miRNAs進行了篩選,共篩查到857個miRNAs,并發現28個高表達miRNA和35個低表達miRNA。見圖3A。與正常細胞HEB比較,miR-1229在其他膠質瘤U251、BT325、TJ905、T98細胞中表達均低(均P<0.05)。見圖3B。通過Targetscan在線數據庫預測,ZDHHC9與miR-1229具有靶向結合位點。見圖3C。通過Gepia2和TCGA數據庫發現,ZDHHC9在膠質瘤組織中高表達,且高表達ZDHHC9與膠質瘤患者的低生存率正相關[P(HR)=0.93](P<0.01)。見圖3D～F。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,miR-1229 mimic能降低轉染ZDHHC9-WT(野生型)質粒的293T細胞的熒光素酶活力(P<0.01),對轉染ZDHHC9-Mut質粒(突變型)的293T細胞的熒光素酶活力無顯著影響(P>0.05)。見圖3G。與miR-NC組比較,miR-1229組細胞ZDHHC9蛋白表達低(P<0.05)。見圖3H。與空白對照組比較,50、80、110 μmol/L芒柄花素處理組ZDHHC9蛋白表達均低,miR-1229表達高(均P<0.05)。見圖3I～J。與對照組比較,miR-1229組細胞ZDHHC9 mRNA表達低(P<0.01)。見圖3K。

圖3 miR-1229與ZDHHC9的調控關系及其在膠質瘤中的表達

2.4 芒柄花素通過miR-1229/ZDHHC9軸對TJ905細胞增殖、活力及凋亡的影響 與空白對照組比較，110 μmol/L組細胞Edu增殖率和細胞活力均低，細胞凋亡率高(均P<0.01)；與110 μmol/L組比較，110 μmol/L+miR-1229組細胞Edu增殖率和細胞活力均低，細胞凋亡率高(均P<0.05)；與110 μmol/L+miR-1229組比較，110 μmol/L+miR-1229+ZDHHC9組細胞Edu增殖率和細胞活力均高，細胞凋亡率低(均P<0.05)。見圖4。

圖4 芒柄花素通過miR-1229/ZDHHC9軸對TJ905細胞增殖、活力、凋亡的影響

3 討論

芒柄花素又名芒柄花黃素、刺芒柄花素,是一種弱極性異黃酮類化合物,廣泛存在于黃芪、紅車軸草等中藥材中。現代藥理學研究顯示,芒柄花素具有抗炎、抗腫瘤、調節血脂代謝等多種藥理學作用[12-13]。芒柄花素對包括膠質瘤在內的多種腫瘤均具有不同程度的抑制作用,可通過誘導細胞凋亡、抑制血管生成等多種途徑發揮抑瘤作用[7,15-16]。王維等[11]在研究中證實,芒柄花素可通過抑制周期蛋白D1表達,從而抑制膠質瘤細胞惡性生物學行為;張雄[17]也在實驗中證明,芒柄花素對膠質瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用。在本研究中,使用不同劑量的芒柄花素處理TJ905細胞,發現芒柄花素可呈劑量依賴性抑制TJ905細胞增殖,并誘導其凋亡;同時通過裸鼠皮下移植瘤實驗也觀察到,芒柄花素治療后小鼠體內腫瘤重量和體積均顯著降低;此外還發現,芒柄花素可顯著抑制小鼠腫瘤組織中PCNA蛋白的表達。PCNA是細胞核脫氧核糖核酸復制所必需的聚合酶輔助蛋白,其在腫瘤細胞中高表達反映腫瘤細胞增殖程度。本研究結果表明芒柄花素具有顯著抑制膠質瘤細胞增殖的作用,這與王維[11]、張雄[17]的研究結果一致。

miRNAs是一種長度為21～24個核苷酸的非編碼RNA,主要通過與mRNA的3′-UTR互補位點結合,在轉錄后水平上調控靶基因的表達。因此,miRNAs在胚胎發育及細胞分化、增殖、生長等生理過程中發揮重要作用[18-20]。miRNAs表達異常是導致多種惡性腫瘤發生發展的重要因素。研究表明,miR-1229在膠質瘤細胞中低表達,且過表達的miR-1229可通過抑制細胞增殖,誘導其凋亡,參與調控膠質瘤進展[9,21-22]。本研究通過在線數據庫基因芯片篩選的miR-1229在膠質瘤組織中顯著低表達,且在不同膠質瘤細胞中均表達下調,這與研究結果一致[18-20]。此外在線預測網站及雙熒光素酶報告基因實驗顯示,miR-1229與ZDHHC9靶向結合;同時還發現芒柄花素處理TJ905細胞后,細胞中miR-1229表達明顯升高,而ZDHHC9表達下調;且過表達miR-1229后,TJ905細胞中ZDHHC9 mRNA和蛋白表達水平均下降。Gepia2和TCGA數據庫顯示ZDHHC9在膠質瘤組織中高表達,且高表達的ZDHHC9與膠質瘤患者的低生存率正相關。以上提示芒柄花素可能通過miR-1229靶向調節ZDHHC9,進而發揮抑瘤作用。

為進一步證實以上猜想,通過體外細胞實驗觀察到,芒柄花素聯合過表達miR-1229處理細胞后,TJ905細胞增殖率和細胞活力均較單獨使用芒柄花素處理組進一步降低,而凋亡率均進一步升高;此外還觀察到上調ZDHHC9表達后,可顯著削弱芒柄花素聯合過表達miR-1229對TJ905細胞增殖的抑制作用及對細胞凋亡的促進作用。這提示芒柄花素可能通過miR-1229/ZDHHC9分子軸抑制膠質瘤細胞增殖,并促進其凋亡,從而發揮抑瘤作用。提示miR-1229有望成為膠質瘤診斷的臨床指標,但仍需要進一步研究驗證。

綜上所述,芒柄花素可通過抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡進而抑制膠質瘤的進程,這可能是通過靶向調控miR-1229/ZDHHC9分子軸實現的。本研究揭示了芒柄花素抑制膠質瘤細胞增殖的可能機制,然而仍需要大量的體內實驗進一步驗證。

利益沖突聲明:本研究與任何單位或個人無利益沖突。