紫龍金聯合埃克替尼對Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能及腫瘤血管生成的影響

李 朕 張洪亮 嚴勝利 陳月嬋 鄔 超 蔡 鋼

(1 新疆醫科大學第四臨床醫學院,烏魯木齊,830000; 2 石河子大學第一附屬醫院,石河子,832000; 3 新疆醫科大學附屬中醫醫院腫瘤二科,烏魯木齊,830000; 4 新疆維吾爾自治區人民醫院呼吸與危重醫學科,烏魯木齊,830000)

肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一,最新的流行病學數據顯示,2020年全球范圍內新發肺癌221萬例,因肺癌死亡180萬例[1-2]。肺癌的發病率和死亡率呈現持續上升趨勢,而血管生成在腫瘤的生長和轉移過程中起重要作用。抑制腫瘤血管生成可限制腫瘤細胞獲取氧氣和營養物質,并阻斷其侵襲和轉移所需的通路,成為治療肺癌的重要策略之一[2]。紫龍金是一種傳統中藥,由黃芪、當歸、白英、龍葵、丹參、半枝蓮、蛇莓、郁金組成,其活性成分具有抗腫瘤和抗血管生成的特性[3]。此外,既往研究還發現紫龍金片對肝癌、肺癌小鼠模型有抗癌作用,其主要通過激活人體淋巴細胞,促進T淋巴細胞增殖,提高巨噬細胞的吞噬能力,從而有效增強機體免疫能力[3]。埃克替尼是一種靶向治療藥物,主要針對表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR),可用于肺癌的治療,被廣泛應用于臨床,并取得了良好療效[4]。然而,紫龍金和埃克替尼在肺癌血管生成和免疫功能方面的相互作用尚未明確。本研究探究紫龍金和埃克替尼對Lewis肺癌荷瘤小鼠模型中腫瘤血管生長的抑制作用,并評估其對細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、細胞 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級C57BL/6雄性小鼠50只,4～6周齡,體質量18～22 g,購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司,生產許可證號:SCXK(滬)2020-0016。將所有小鼠飼養在無菌的鼠房中,恒溫25 ℃,每12 h進行1次晝夜交替,給予充足的糧食和水。小鼠Lewis肺癌細胞株(上海冠導生物工程有限公司,批號:GD-C9819889),采用高糖的含10%胎牛血清的改良Eagle培養基(Dulbeccos Modification of Eagles Medium,DMEM)培養基進行培養,培養環境為37 ℃,5%CO2培養箱。動物實驗經我院實驗動物動心實驗動物倫理委員會批準(倫理審批號:A2023-069-01)。

1.1.2 藥品 紫龍金片(天津中新藥業集團股份有限公司隆順榕制藥廠,包裝規格:0.65 g,國藥準字Z20010064);埃克替尼(貝達藥業股份有限公司,125 mg/片,國藥準字H20110061)。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養基(CHI Scientific公司,美國,批號:3-2010);胰酶(北京伊塔生物科技有限公司,批號:YT00044);無菌生理鹽水(上海撫生實業有限公司,批號:FS-P0178);FITC anti-mouse CD3 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:100203);APC anti-mouse CD4 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:100515);PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8b.2 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:140417);PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:103235);放射性免疫沉淀分析(Radioimmunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海羽朵生物科技有限公司,批號:LG-PS0013);10%體積的10 mmol/L PMSF(MyBioSource公司,美國,批號:MBS355475-E);白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M25951);腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M29261);γ干擾素(Interferon Gamma,IFN-γ)ELISA試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M25913);血管內皮生長因子ELISA試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M29117);二氧化碳(Carbon Dioxide,CO2)培養箱(Eppendorf公司,美國,批號:S41I230014);酶標儀(BioTek公司,美國,型號:BioTek Synergy H1);流式細胞儀(BD Biosciences公司,美國,型號:Accuri C6);離心機(青島澳柯瑪生物醫療有限公司,型號:ALX-18R);4 ℃冰箱(海爾公司,型號:HXC-149)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參考既往文獻[5-6]構建Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。從液氮中取出Lewis肺癌細胞株于37 ℃恒溫水浴中使其完全解凍,將恢復活力的Lewis肺癌細胞株懸浮于DMEM培養基,并在37 ℃的CO2培養箱中進行培養,待細胞進入對數生長期,使用胰酶消化細胞,并制備5×106個/mL的細胞懸液備用。取10只小鼠,在無菌條件下將細胞懸液(0.2 mL/只)注射到小鼠的右前肢腋窩皮下,建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。在無菌條件下飼養14 d后脫頸椎處死小鼠,將瘤體組織剝離、剪碎、勻漿,制備成1×107個/mL的Lewis瘤細胞懸液。取40只小鼠,于右前肢腋窩皮下分別接種0.2 mL的Lewis瘤細胞懸液。模型制備成功標準:7 d后,在接種部位觸摸到約黃豆大小的結節狀腫塊[6]。將造模成功的40只小鼠隨機分為模型組、紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組,每組10只。

1.2.2 給藥方法 參照相關文獻[7],紫龍金組將紫龍金片碾碎后溶于無菌生理鹽水備用,每只小鼠采用灌胃的方式給予紫龍金水溶劑,給藥劑量為20 g/kg;埃克替尼組灌胃給予埃克替尼,給藥劑量5 mg/kg[8];聯合觀察組給予紫龍金與埃克替尼聯合治療,給藥方法同紫龍金組、埃克替尼組。模型組給予同紫龍金組相同劑量的生理鹽水灌胃。4組均每日給藥2次,間隔12 h,持續14 d,末次給藥后小鼠禁食24 h,取眼眶靜脈血。隨后處死小鼠,收集小鼠的腫瘤組織保存備測。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 腫瘤生長抑制率檢測 處死小鼠后,取小鼠接種部位腫瘤稱重,計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=(模型組平均腫瘤重量-觀察組平均腫瘤重量)/模型組平均腫瘤重量×100%[6,9]。

1.2.3.2 血管生長指標檢測 1)血管內皮生長因子的檢測:參照先前文獻[10-11]的方法進行評估分析,對小鼠進行靜脈取血后,將收集的血液進行離心3 min,離心半徑7 cm,離心轉速為12 000 r/min,之后收集上清液,按照說明,用ELISA試劑盒檢測小鼠血管內皮生長因子水平。2)微血管密度(Microvessel Density,MVD)檢測:參照先前文獻[12]里的方法來評估腫瘤MVD。具體而言,將腫瘤血管組織進行石蠟包埋并切成4 μm厚的切片,把切片放入二甲苯中2次脫蠟,10 min/次。然后把切片放入無水乙醇中10 min洗去二甲苯。之后,把切片依次放入95%、90%、80%和70%乙醇中各1次,2 min/次。進行切片抗原修復,即將切片放入盛有枸橡酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內加熱使溫度保持在92～98 ℃之間并持續10～15 min。取出容器,室溫冷卻10～20 min。之后,用PBS沖洗,5 min×3次。使用1%BSA封閉液封閉非特異性結合位點,滴加CD34一抗進行4 ℃孵育過夜,次日將切片與對應的二抗繼續進行孵育,并使用DAB進行核復染,最后在顯微鏡下觀察。將染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇視為1個計數單位,而不計數血管腔大于8個紅細胞大小且具有較厚肌層的血管。首先在低倍視野下選取5個MVD較高的區域,通過觀察CD34陽性細胞(染成棕色的內皮細胞)來確定最高的血管密度區域。高倍鏡下(×200)將孤立的內皮細胞或細胞簇視為1個計數單位,記錄5個視野內的微血管數量,取平均值。計數標準:單個染色陽性的血管內皮細胞;1個染色陽性的血管內皮細胞簇;血管干上的分支結構。

1.2.3.3 脾臟免疫細胞檢測 處死小鼠后,在無菌條件下分離小鼠脾臟,制備脾細胞懸液。加入紅細胞裂解液裂解紅細胞,在冰浴中孵育30 min后離心去除上清液,并用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)進行洗滌,將細胞調整至107個/mL。取100 μL細胞懸液,加入2 μL的異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)anti-mouse CD3 Antibody、1 μL的anti-mouse CD4 Antibody、1 μL的PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8b.2 Antibody、1 μL的PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody。4 ℃避光條件下孵育40 min,用PBS進行洗滌,并去除上清液,用流式細胞儀檢測小鼠脾臟細胞內CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞的比例。

1.2.3.4 腫瘤組織炎癥介質檢測 采集小鼠腫瘤組織后,取適量腫瘤組織制備勻漿,用90%體積RIPA裂解液和10%體積的10 mmol/L PMSF進行組織勻漿(10%),置于冰上裂解30 min,于12 000 r/min離心30 min,離心半徑為7 cm,取上清液,置于4 ℃冰箱保存備測。分別用對應的ELISA試劑盒檢測腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ。

2 結果

2.1 紫龍金及埃克替尼對小鼠腫瘤生長的抑制作用 與模型組比較,紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠腫瘤重量低(均P<0.05);與紫龍金組及埃克替尼組比較,聯合觀察組小鼠腫瘤重量低(均P<0.05),腫瘤生長抑制率高(P<0.05)。紫龍金組與埃克替尼組小鼠腫瘤重量、腫瘤生長抑制率比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤重量及腫瘤生長抑制率比較

2.2 各組小鼠血管內皮生長因子水平比較 模型組、紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠血管內皮生長因子水平分別為(129.10±21.87)、(85.70±6.36)、(81.10±9.15)、(69.70±5.29)pg/mL。與模型組比較,紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠血管內皮生長因子水平低(均P<0.05);與紫龍金組及埃克替尼組比較,聯合觀察組小鼠血管內皮生長因子水平低(均P<0.05);紫龍金組與埃克替尼組小鼠血管內皮生長因子水平比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 各組小鼠MVD比較 免疫組化染色結果揭示各組小鼠MVD的組織表達情況。見圖1。模型組、紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠MVD分別為(1.39±0.21)%、(0.63±0.05)%、(0.65±0.05)%、(0.42±0.08)%。與模型組比較,紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠MVD低(均P<0.05)。與紫龍金組及埃克替尼組比較,聯合觀察組小鼠MVD低(均P<0.05);紫龍金組與埃克替尼組小鼠MVD比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。

圖1 免疫組化染色檢測各組小鼠MVD組織表達水平

2.4 各組小鼠血清免疫細胞比例比較 與模型組比較,紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠血清CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞的百分比例均高于模型組(均P<0.05);與紫龍金組及埃克替尼組比較,聯合觀察組小鼠血清CD4+T淋巴細胞比例、CD8+T淋巴細胞比例、B淋巴細胞比例較高(均P<0.05);紫龍金組與埃克替尼組小鼠血清的CD4+T淋巴細胞比例、CD8+T淋巴細胞比例、B淋巴細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清免疫細胞比例比較

2.5 各組小鼠腫瘤組織炎癥介質水平比較 與模型組比較,紫龍金組、埃克替尼組、聯合觀察組小鼠腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平低(均P<0.05);與紫龍金組及埃克替尼組比較,聯合觀察組小鼠腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平低(均P<0.05);紫龍金組與埃克替尼組小鼠腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腫瘤組織炎癥介質水平比較

3 討論

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因[2,13-14],肺癌的治療策略包括手術切除、放療、化療和靶向治療等[14]。手術切除是早期肺癌的主要治療方法,但對于晚期肺癌或存在遠處轉移的患者來說,手術切除的效果有限[15]。放療和化療可以控制腫瘤生長和轉移,但常伴有嚴重的不良反應[15]。近年來,靶向治療作為一種個體化的治療策略,在肺癌治療中取得了顯著療效[16-17]。針對EGFR突變的患者,埃克替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制劑已經成為標準的一線治療方案[17]。然而,由于腫瘤的異質性和耐藥性的出現,單一靶向治療的效果通常不持久。

既往研究表明,紫龍金作為傳統中藥,有多種生物活性成分(黃酮類、多糖類和三萜類化合物等),具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種作用[18]。本研究結果顯示,紫龍金與埃克替尼聯合治療后小鼠的腫瘤重量和小鼠腫瘤生長抑制率高于二者單獨治療,這一發現說明紫龍金與埃克替尼聯合使用具有更強的抗腫瘤作用,能夠在一定程度上提高治療效果。

血管內皮生長因子是一種關鍵的血管生成因子,能夠促進內皮細胞的增殖、遷移和血管通透性增加,從而在腫瘤血管生成中發揮核心作用[19]。MVD則反映了腫瘤組織內新生血管的數量和密度,是評估腫瘤血管生成程度的重要指標。MVD的增加通常意味著腫瘤血管生成活躍,腫瘤細胞的供血和營養供應充足,從而加速了腫瘤的生長和轉移[20]。埃克替尼作為靶向治療藥物,可以抑制EGFR活性,進而抑制腫瘤細胞的生長和分裂[21-22]。紫龍金與埃克替尼聯合治療抑制Lewis肺癌小鼠血管生成的機制可能與二者共同抑制血管內皮生長因子表達有關。本研究結果顯示,紫龍金與埃克替尼聯合治療后小鼠血管內皮生長因子水平降低。本研究發現,紫龍金與埃克替尼聯合治療后腫瘤內MVD降低,說明二者降低了腫瘤的供血和營養,從而限制了腫瘤的生長和擴散。

CD4+T淋巴細胞,又稱輔助性T細胞,在免疫應答中起到調控和協調的作用。它們能夠激活其他免疫細胞,如CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞,從而發起針對腫瘤細胞的特異性免疫反應。CD4+T淋巴細胞的增加通常意味著機體免疫功能的增強,有助于更有效地抵抗腫瘤[23]。CD8+T淋巴細胞,即細胞毒性T細胞,是機體抗腫瘤免疫的主要效應細胞。它們能夠直接識別并殺滅腫瘤細胞,是機體對抗腫瘤的重要細胞。CD8+T淋巴細胞數量的增加和活性的提高,有助于增強機體對腫瘤細胞的清除能力[23]。紫龍金作為傳統中藥,已知具有抗炎和抗氧化作用,能夠激活淋巴細胞,增強免疫反應。已有研究表明,紫龍金能夠調節免疫細胞的功能和數量,從而增強機體的抗腫瘤能力。埃克替尼作為靶向治療藥物,雖然主要針對腫瘤細胞的特定分子靶點,但其對免疫系統的影響也不容忽視。一些研究表明,靶向治療藥物可能通過調節免疫微環境,增強機體的免疫反應,從而提高治療效果[24-25]。本研究結果顯示,紫龍金與埃克替尼聯合治療后小鼠免疫細胞比例升高。紫龍金和埃克替尼協同作用增加淋巴細胞活性,激活免疫系統,使其更有效地抵抗腫瘤細胞。

IL-2是一種重要的免疫調節因子,能夠促進T淋巴細胞的增殖和分化,增強機體的細胞免疫應答。在抗腫瘤免疫中,IL-2能夠激活和增強CD4+T細胞和CD8+T細胞的活性,從而增強機體對腫瘤細胞的識別和清除能力[26]。TNF-α則是一種具有廣泛生物活性的細胞因子,能夠誘導腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞的生長和轉移。同時,TNF-α也能夠激活其他免疫細胞,如巨噬細胞,進一步增強機體的抗腫瘤免疫反應[26]。本研究結果顯示,紫龍金與埃克替尼聯合治療后腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平下降。IFN-γ作為一種免疫調節因子,可抑制腫瘤細胞的增殖,誘導腫瘤細胞凋亡,下調血管內皮生長因子的表達,從而抑制腫瘤血管的形成。檢測IFN-γ的水平可以間接反映腫瘤的生長狀況。此外,在口咽癌的研究中顯示,紫龍金通過干預受體和通路活性以及調控TNF-α等信號通路發揮抗癌作用[27];而埃克替尼被證明在非小細胞肺癌的發生發展中具有良好的抗腫瘤作用,但具體作用靶點尚未揭示[28]。本研究的結果表明紫龍金與埃克替尼的聯合使用在抑制腫瘤生長的同時,也影響了腫瘤組織內的免疫微環境,減少了炎癥介質的釋放。

綜上所述,本研究采用Lewis肺癌荷瘤小鼠構建模型,發現紫龍金與埃克替尼聯合治療可抑制腫瘤生長及血管生成,增強免疫功能,減輕炎癥反應。本研究為肺癌治療策略制定提供重要的理論和實驗基礎。然而,本研究仍存在一些不足之處,需要在后續研究中加以改進和完善。首先,本研究僅在小鼠模型上進行了初步探索,雖然取得了一定的研究成果,但尚需進一步在人體上進行臨床試驗,以驗證紫龍金與埃克替尼聯合治療的療效和安全性。其次,本研究對于紫龍金與埃克替尼聯合治療的具體機制仍需要深入研究,以便更好地優化治療方案,提高治療效果。此外,本研究未涉及紫龍金與埃克替尼聯合治療的最佳用藥劑量和用藥時間等問題,這也是后續研究需要關注的重要方向。

利益沖突聲明:無。