醬香型白酒冬季堆積發酵過程中酒醅升溫機制初探

張德芹，胡建鋒，吳 成，張二康，李嶺卓*

（1.貴州習酒投資控股集團有限責任公司，貴州 遵義 564600；2.貴州習酒股份有限公司，貴州 遵義 564600；3.貴州省制造業創新中心，貴州 遵義 564500；4.中國輕工業醬香型白酒智能化釀造工程技術研究中心，貴州 遵義 564600）

堆積發酵是醬香型白酒獨具特色的生產工藝之一[1-2]，因該過程具有網羅環境微生物的作用[3-4]，也被稱為“二次制曲”。研究證實，堆積發酵過程中種類、數量十分豐富的酒醅微生物生長代謝與演替變化，分解大分子物質，產生了大量的風味物質以及其前體，為酒醅進入窖池發酵產酒、產香創造必要的條件[5-6]。任婷婷等[7]對洞釀醬香酒一輪次堆積發酵過程微生物群落與理化因子關聯性進行研究，結果表明酒醅中優勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia），優勢真菌屬為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）和復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。吳成等[8]探究了醬香酒造沙輪次堆積發酵酒醅微生物與理化指標演替規律，表明在發酵末期乳桿菌屬（Lactobacillus）和畢赤酵母屬（Pichia）為絕對優勢菌屬，且與酒醅溫度呈顯著正相關關系（P＜0.05）。張春林等[9]研究了醬香酒二輪次堆積過程酒醅微生物與理化指標變化規律，證實酒醅溫度與假絲酵母屬相對豐度呈正相關，與裸胞殼屬（Emericella）、畢赤酵母屬呈負相關。此外，還有研究表明，醬香型白酒堆積發酵過程微生物的代謝產熱作用帶動酒醅溫度升高，進而利于微生物生長繁殖[10]。

一般地，醬香型白酒一、二輪次發酵生產處于氣溫較低的冬季（1～2月份），堆積酒醅容易出現“來溫慢、冷心、達不到頂溫”等發酵異常現象，從而導致發酵不徹底，進而影響基酒產質量。袁再順等[11]研究表明，破堆移位處理能使異常堆恢復正常升溫、降低酒醅的總酸與水分含量，并顯著增加二輪次酒醅中還原糖含量，該處理對堆積酒醅中好氧細菌芽孢桿菌的生長具顯著促進作用，而乳酸桿菌大量減少。談沖等[12]對醬香型白酒一輪次酒醅微生物的溯源分析發現，生產環境為堆積酒醅提供了大多數細菌（93.8%），乳酸菌主要來源于車間過道以及生產工具。目前，盡管已有研究者對冬季醬香型白酒堆積發酵過程酒醅中微生物來源以及堆子溫度變化原因進行了分析，但對于整個堆積發酵過程酒醅升溫的內在機制仍缺乏較為清晰的認知。基于此，本研究以醬香型白酒冬季一輪次堆積發酵酒醅為研究對象，采用實時溫度監測儀、傳統可培養方法和高通量測序技術，對堆積發酵過程中酒醅溫度、微生物菌落總數、真菌群落結構的變化規律及其相關性進行了探索，以期為闡釋醬香型白酒堆積發酵過程升溫機制提供基礎數據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅樣品：貴州習酒股份有限公司制酒車間。

1.1.2 化學試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Omega BioTek公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、2×HieffRRobust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads：上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

孟加拉紅培養基、營養瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；WL培養基：上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F無菌操作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；KG-AP32L自動蒸汽滅菌器：日本ALP公司；Pico-21臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳托能達科技有限公司；L300T3實時溫度監測桿：四川科學儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

酒醅經出甑、攤晾、拌曲、完全收堆后開始采集，完全收堆時記為發酵0 h，每24 h采集樣品一次至入窖，如圖1所示。A、B、C、D、E、F分別為糖化堆上層中心、表面；中層中心、表面；下層中心、表面，不同位置采集樣品時繞堆子1周隨機取3個酒醅樣品混合進行檢測分析。

圖1 堆積發酵過程中取樣示意圖Fig. 1 Sampling diagram during heap fermentation process

1.3.2 發酵溫度及菌落總數檢測

將3支實時溫度檢測桿插入糖化對上、中、下不同位置，從完堆開始（0 h）至堆積發酵結束（116 h），每4 h采集一次糖化堆各取樣點溫度。分別使用WL培養基、孟加拉紅培養基和營養瓊脂分離篩選酒醅中的酵母菌、霉菌和細菌，并采用稀釋平板涂布法，記錄菌落總數[13]。

1.3.3 MiSeq高通量測序

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA試劑盒提取樣本總DNA，具體操作流程見試劑盒說明書。分別選取不同堆積發酵時間和不同位置的酒醅樣品，進行高通量測序檢測分析，擴增區域為ITS3～ITS4區，擴增引物為ITS3（3'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-5'）和引物ITS4（3'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5'）。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25次循環；72℃終延伸5 min降至4 ℃。PCR擴增體系為：2×HieffRRobust PCR Master Mix15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA模板20～30 ng，使用雙蒸水（ddH2O）補齊體系至30 μL。

1.3.4 數據分析

高通量測序下機序列經cutadapt去除引物接頭序列后，根據PE reads間的overlap關系使用PEAR將成對的reads拼接成一條序列，再按照barcode對其進行識別和過濾等處理后得到有效序列數據。將相似度為97%下的有效系列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，采用UNITE數據庫進行比對。數據的分析及計算使用Microsoft Office Excel 2016軟件；微生物相對豐度熱圖采用TBtools軟件繪制；選取相對豐度排名前10的真菌屬和酒醅溫度，采用SPSS 24.0軟件計算Spearman相關性系數。

2 結果與分析

2.1 酒醅溫度和菌落總數變化

一輪次酒醅堆積發酵過程中酒醅溫度變化情況，結果見圖2。由圖2可知，完堆時，不同位點酒醅中心溫度均高于表面，上、中、下層中心溫度（18.8 ℃，24.4 ℃，25 ℃）＞上、中、下層表面溫度（16 ℃，15.8 ℃，15.7 ℃），而中層和下層溫差較大，中心溫度分別高于表面溫度8.6 ℃和9.3 ℃。在堆積發酵0～64 h階段，堆子上層中心和表面酒醅溫度升高較快，溫度分別由18.8 ℃和16 ℃上升至32.7 ℃和29 ℃；中層和下層中心酒醅溫度變化不大，中層中心溫度維持在24.4～26.6 ℃，下層中心溫度維持在25 ℃左右；而中、下層表面酒醅溫度呈現緩慢上升趨勢，溫度分別由15.8 ℃和15.7 ℃上升至27.1 ℃和19.0 ℃。當堆積發酵至67 h時進行翻堆操作，堆子上、中、下層溫度均降至22.4 ℃左右，然后隨著堆積發酵至96 h，上層中心和表面酒醅溫度迅速上升，堆積發酵至116 h時頂溫達到最高48.7 ℃；而中層表面和下層表面酒醅溫度則升高緩慢，分別由23.6 ℃和24.2 ℃（67 h）上升至36.9 ℃和31 ℃（116 h），中心酒醅溫度基本維持恒定，分別在24 ℃和28 ℃左右。

圖2 堆積發酵過程中不同位置溫度變化Fig. 2 Changes of temperature at different positions during heap fermentation process

一輪次酒醅堆積發酵過程中酒醅不同位置微生物菌落總數平均值的變化情況，結果見表1。由表1可知，酵母菌菌落總數在堆積過程中大幅增長，從完堆時的103數量級，到最高時（96 h）達到106數量級；細菌菌落總數在堆積過程中變化不大，從完堆到下窖，細菌數量在106～107數量級之間波動，這與張健等[14]的報道一致；霉菌菌落總數穩定在102～103數量級之間，發酵96 h后，霉菌菌落總數未檢出。需要特別注意的是，在堆積發酵48～72 h階段進行了翻堆操作，堆子上層表面酒醅的酵母菌數量急劇上升（數量級從102增加至104），翻堆操作增加了酒醅中酵母菌數量，有利于解決糖化堆升溫較慢的問題。研究表明，醬香型白酒第二輪次堆積發酵過程經“FD工藝”處理后酒醅真菌群落多樣性和豐富度均有明顯增加，且有利于大部分真菌群落的生長，有效提高了出酒量和基酒的品質[15]。由此可見，醬香型白酒一輪次酒醅堆積發酵過程中心位置酒醅率先啟動發酵，溫度緩慢上升并擴散至表層；表層酒醅達到一定溫度后，在較充足的溶氧條件下酵母菌快速生長，溫度迅速上升，且翻堆操作可以顯著增加上層表面酒醅中酵母菌數量，有利于提升糖化堆快速達到頂溫。

表1 堆積發酵過程中不同位置微生物菌落總數變化Table 1 Changes of number of total microbial colonies at different positions during heap fermentation process CFU/g

2.2 微生物菌落總數與酒醅溫度相關性分析

溫度是評價堆積發酵狀態最直觀的指標[15-17]。為了探究堆積發酵過程可培養微生物數量與溫度之間的相互作用關系，采用SPSS 24.0軟件對酒醅溫度和微生物數量進行了Spearman相關性分析，結果見表2。

表2 酒醅溫度與微生物菌落總數的相關性Table 2 Correlation between temperature of fermented grains and total number of microbial colonies

由表2可知，酒醅溫度與酵母菌總數呈極顯著正相關（P＜0.01），這表明堆積發酵過程酒醅熱量可能主要來源于酵母菌生長代謝產熱。而酒醅溫度與細菌總數、霉菌總數無顯著相關（P＞0.05），相關研究表明，溫度和乙酸對酵母菌群的協同抑制可以導致釀造菌群失穩，且粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）能夠通過提高丙酸和丁酸代謝關鍵酶的表達水平從而提高相關醇酸的含量，促進群落中其他揮發性風味代謝產物的生成，進而影響醬香型白酒發酵進程[1，18]。

2.3 一輪次堆積發酵酒醅真菌群落結構組成及演替規律

基于菌落總數與溫度相關性分析結果，進一步對一輪次堆積發酵酒醅真菌群落結構進行高通量測序分析，結果見圖3。

圖3 基于門水平（A）和屬水平（B）堆積發酵過程中酒醅樣品真菌群落相對豐度變化Fig. 3 Changes of relative abundance of fungal communities of fermented grains samples during heap fermentation process at phylum level (A) and genus level (B)

由圖3可知，一輪次堆積發酵過程共檢測到真核微生物2個門、5個綱、5個目、13個科、17個屬和19個種。門水平上，全發酵過程以子囊菌門（Ascomycota）為主導；屬水平上，優勢真菌屬主要有畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）等，這與GUAN T W等[19-20]的研究報道一致。堆積發酵過程中Pichia相對豐度由初期的1.82%上升至結束時的49.14%，Issatchenkia相對豐度由6.03%上升至34.67%；Rhizopus相對豐度由19.67%下降至0.24%；Penicillium相對豐度由12.45下降至1.44%；Thermomyces相對豐度由22.63%下降至0.73%。發酵中后期Pichia和Issatchenkia成為絕對優勢菌屬，這與呂錫斌等[21]研究報道一致。

選擇相對豐度排名前10的優勢真菌屬（包括Pichia、Issatchenkia、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、Penicillium、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、Thermomyces、Aspergillus和Rhizopus），對堆積發酵過程中優勢真菌屬進行聚類分析，結果見圖4。

圖4 堆積發酵過程中酒醅優勢真菌屬聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of dominant fungi genus in fermented grains during heap fermentation process

由圖4可知，在堆積發酵24～48 h階段，以Thermomyces、Aspergillus、Rhizopus、Penicillium，以及其他小類真菌屬為主。從完堆（0 h）至堆積發酵結束（116 h），由于Pichia、Issatchenkia、Zygosaccharomyces和Saccharomyces相 對 豐度發生變化，從而造成酒醅中心位置真菌群落結構組成與表面、下層存在較大差異，被聚類在兩邊。堆積發酵至72 h時，酒醅不同位置真菌群落結構差異較大，72A和72F、72B、72E、72D、72C樣品分別被單獨聚成一類，表明翻堆操作將重塑酒醅真菌微生物群落結構組成。王貴軍等[22]研究表明，醬香型酒醅在堆積發酵過程，不同部位升溫不同而使各層酒醅具有不同風格。此外，采用破堆移位技術，可使堆積發酵酒醅再次網羅空氣中的微生物，提高醬香型白酒出酒率的同時，優質品率也得到了提升[23]。當堆積發酵96～116 h階段時，堆子表面位置酒醅Pichia相對豐度顯著高于Issatchenkia，中心位置酒醅Pichia相對豐度則略低于Issatchenkia。由于Issatchenkia具有更強的厭氧耐受能力，本階段好氧條件下Pichia在與Issatchenkia的競爭中占據優勢，而厭氧條件下Pichia在與Issatchenkia的競爭中則處于劣勢。研究表明，Saccharomyces、Issatchenkia、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyce、Kazachstania等酵母菌對高級醇、酸、酯、醛等風味成分的貢獻很大[24]。

2.4 真菌群落組成與溫度相關性分析

選取溫度變化較為劇烈的堆積發酵48 h和96 h的酒醅，結合酒醅溫度與相對豐度排名前10的優勢真菌屬進行Spearman相關性分析，結果見表3。

表3 酒醅溫度與優勢真菌屬相對豐度的相關性Table 3 Correlation between the temperature and the dominant fungi genus of fermented grains

由表3可知，Pichia與酒醅溫度呈顯著正相關（P＜0.05），說明Pichia在糖化堆升溫過程中扮演了重要的角色。ZHANG H X等[25]研究發現，釀造環境是醬香型白酒堆積發酵過程中重要微生物Pichiasp.的主要來源，其具有較好的熱耐受性以及較強的競爭效應，對維持醬香型白酒固態發酵穩態具有重要意義。林良才等[26]在高溫、高酸雙脅迫條件下從醬香型白酒酒醅中篩選獲得11株具有高耐性的庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），利用玉米濃醪進行模擬白酒發酵，發現菌株XDNZ_PK05除可耐受45 ℃高溫、5 g/L乙酸、70 g/L乳酸和體積分數14%乙醇之外，還具有高產酯低產高級醇的代謝特性。將該株菌應用于醬香型白酒的生物強化實際生產中，可提高原料利用率20%，提升乙醇產量13%，同時降低正丙醇含量53%，同時其他風味物質無顯著差異。堆積發酵48 h時，Aspergillus與酒醅溫度呈顯著負相關（P＜0.05）；堆積發酵96 h時，Saccharomyces、Schizosaccharomyces與酒醅溫度呈顯著負相關（P＜0.05）。醬香型白酒堆積發酵過程中霉菌和酵母是最重要的微生物，霉菌可以分泌水解酶類降解大分子物質為酵母菌的生長和發酵提供底物，而酵母菌將底物轉化為乙醇和風味物質。陳筆[27]研究表明，米曲霉（A.oryzae）與釀酒酵母（S.cerevisiae）混合發酵，能夠提高酯類、酸類、醇類、醛酮類等風味物質的濃度，表明Aspergillus與Saccharomyces在醬香型白酒一輪次堆積發酵可能存在協同作用。袁再順[28]對“破堆移位”影響醬香型白酒冬季堆積發酵因素進行了探究，結果表明發酵酒醅曲霉與溫度呈顯著負相關，與本研究結果一致，課題組擬在后續研究中進一步探究溫度對Aspergillus、Saccharomyces和Schizosaccharomyces的作用機理。

3 結論

本研究以醬香型白酒一輪次堆積發酵為研究對象，采用實時溫度監測儀、傳統可培養方法和高通量測序技術，并結合多元統計學方法，初步探究了醬香型白酒冬季堆積發酵酒醅升溫機制。結果表明，堆積發酵不同部位溫度變化存在差異，中心位置酒醅率先啟動發酵，溫度緩慢上升并擴散至表層，且溫度與酵母菌菌落總數呈極顯著正相關關系（P＜0.01）。進一步結合高通量測序和相關性分析結果表明，溫度是醬香型白酒冬季堆積發酵菌群演替的重要驅動因素，酒醅中心位置真菌群落結構組成與表面、下層存在較大差異，Pichia與酒醅溫度呈顯著正相關（P＜0.05），表明酵母菌以Pichia為主的生長代謝產熱為糖化堆升溫提供了主要動力，本研究為進一步解析醬香型白酒冬季堆積發酵升溫機制提供了理論參考。