產香酵母菌丸麥曲固態發酵系統構建及其生長動力學研究

黃治國，張晴雯，鄭若欣，曾 波，任志強，鄧 杰，謝 軍*

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.四川國檢檢測有限責任公司，四川 瀘州 646000；3.四川輕化工大學 中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000）

中國白酒以酒曲作為糖化發酵劑，并以獨特的釀造工藝區別于白蘭地、龍舌蘭、伏特加等其他世界著名蒸餾酒。《尚書·說命篇》記載“若作酒醴，爾惟麹（曲）糵”表明在幾千年前我國先民就已經發現了酒曲的重要性。酒曲歷經上千年的發展與創新，已經取得了顯著的成就，形成了以大曲、小曲和麩曲為主的常規曲藥種類，以及強化曲、純種曲、液體曲等新型曲藥[1]。目前，酒曲存在一些不足，如大曲雖具有豐富的酶系、菌系和物系，但制曲周期長、制曲原料貴、儲存過程損失大以及用曲量大等，進而導致酒企生產成本增加；小曲相較于大曲具有生產成本低、釀酒周期短等優點，但小曲中菌群數量遠低于大曲，尤其是產香微生物菌群[2-5]。鑒于傳統小曲制曲原料主要為大米，形成了糧食供應的競爭問題，麩曲開始逐步替代小曲成為主流用曲之一。麩曲具有強糖化力、強發酵力、高出酒率等優點，但也存在菌群單一、產香力低導致基酒中風味物質遠低于大曲酒等缺點[6]。為此，產香酵母菌逐漸成為中國白酒行業的關注焦點之一。從釀酒原料、釀造環境、曲藥、糟醅以及窖泥等來源中分離篩選出具有優良發酵和產香特性的酵母菌株，并將其應用于白酒強化發酵是一個研究熱點[7-9]。李曉歡等[10]從大曲中篩選優良釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），并將其接種于小麥粉制作酵母曲，優化制曲工藝后釀酒酵母生物量為7.5×108CFU/g。夏玙等[11]復配麩皮、鮮酒糟、玉米粉并接種異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）制作麩曲，優化培養條件后酵母生物量為3.12×108CFU/g。富志磊等[12]應用異常威克漢姆酵母進行白酒模擬固態發酵提升了白酒乙酸乙酯含量。

小麥是中國白酒大曲中主要的制曲原料，屬于經驗性制曲原料。有研究表明，去除部分皮層的小麥更適合微生物生長[13-14]。傳統大曲的制作需要對小麥進行粉碎、潤濕、拌料、成型后進行發酵，這導致大曲的制作需要人工進行翻曲、打攏、收堆，存在極大的勞動量需求，難以完全實現機械化。基于此，本研究以丸麥制曲對小麥制曲工藝進行簡化。小麥去除皮層再經過局部精制后的小麥籽粒即為“丸麥”，又稱“麥仁”。目前，國內已有使用麥仁制曲以及利用麥仁曲制作醬油、面醬、食醋、生物飼料和釀酒的報道[15-17]，可見丸麥是一種在發酵行業中具有可行性和實用價值的原料。國外也有類似丸麥曲生產的實例，如日本清酒曲以蒸制熟化的去皮大麥、大米等為原料，接種曲霉菌種（如白曲霉（Aspergillus kawachii）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、琉球曲霉（Aspergillus luchuensis））制作而成[18-20]。但大麥皮殼較多，經過去皮處理產生的損耗相對小麥較多[21]。此外，大麥在中國的進口率遠超出口率，供銷不均，作為制曲原料成本較高[22]。

該研究以丸麥為制曲原料，以產香酵母菌為菌種發酵制備丸麥曲，首先根據淺盤生物反應器原理構建產香酵母丸麥曲固態發酵系統；然后接種產香酵母并監測其在丸麥曲培養過程中生物量的變化建立酵母菌生長動力學模型，以此探索酒曲制作新技術和產香酵母的固態發酵技術可行性，以期對產香酵母固態擴大培養技術提供理論支撐，對中國白酒酒曲產業技術創新提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

丸麥（人工剔除不完整粒）：新野縣優尚佳食品廠。

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）DQ-10、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）DQ-02、馬爾克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）DQ-03、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）DQ-04：均分離自濃香型白酒大曲，現保藏于釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；無水葡萄糖（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：成都市科隆化學品有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[23]：1%酵母浸粉，2%葡萄糖，2%蛋白胨。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

計數培養基：YPD培養基中添加2%瓊脂及0.01%氯霉素。

1.2 儀器與設備

ZXMP-R1430恒溫培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；LabServ-LS-O610干燥箱：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 丸麥曲固態發酵系統的設計

由于丸麥曲從原料、菌種上均與現有的酒曲存在較大的差異，因此制曲所用設施及環境不能借用現有的制曲設備。為此，本研究特為丸麥曲設計了一套實驗室規模的固態發酵生物反應器（以下簡稱“反應器”），結構圖見圖1。該反應器是由不銹鋼材料支撐的雙層淺盤式結構。反應器由蓋、物料層（具孔淺盤）、廢水層（無孔淺盤）三個部分組成。物料層高45 mm，內徑300 mm，物料層的底部均勻分布2 mm孔，制曲時擬填充丸麥基質20 mm，預留20～25 mm頂空。廢水層高40 mm，內徑300 mm。蓋、物料層、廢水層皆具有卷邊。具孔淺盤與無孔淺盤的卷邊外翻，曲邊平蓋的卷邊內扣。蓋與物料層卷邊之間形成一圈連續而彎曲的通風口。在制曲過程中反應器放置于恒溫恒濕的培養箱中，可根據產香酵母菌的生長情況及時調整溫度、濕度，盡可能地提高酵母菌在丸麥上的生物量。

圖1 雙層淺盤式丸麥曲固態發酵生物反應器結構Fig. 1 Structure of double-layer tray bioreactors for Wanmai-Qu solid-state fermentation

1.3.2 丸麥曲的制作工藝

取一環預活化酵母接種于YPD培養基中，在30 ℃、170 r/min的條件下擴大培養24 h。培養結束后使用顯微鏡進行鏡檢確保無雜菌后在3 000 r/min條件下離心5 min，收集酵母細胞沉淀。然后，加入等體積的無菌水復懸酵母細胞，得到菌懸液備用。

以無菌水沒水浸泡丸麥30 min，瀝水，經沸水浴15 s處理后于無菌環境攤晾至室溫，而后接種1%菌懸液，混勻，在無菌反應器的具孔淺盤中鋪成2 cm厚，于溫度30 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）80%條件下培養26 h即得到丸麥曲。

1.3.3 酵母菌計數

丸麥曲發酵開始后每隔2 h取樣，參考GB/T 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》中的方法[24]，對丸麥曲固態發酵過程中酵母菌的活菌進行計數。操作如下：取10 g樣品，加入90 mL無菌生理鹽水，170 r/min振蕩30 min，制成1∶10待測樣液。取100 μL待測樣液至900 μL無菌生理鹽水中，充分振蕩，并以此操作進行10倍遞增系列梯度稀釋。選擇適宜稀釋度待測樣液取100μL涂布于計數培養基上，于30 ℃培養箱中培養2 d進行菌落計數，平行測定3次取平均值。

1.3.4 酵母菌生長動力學模型的建立

為描述丸麥曲固態發酵中酵母菌的生長動力學，采用Logistic模型擬合丸麥曲固態發酵中酵母菌生長過程[25-26]，Logistic方程如下：

當t=0時X=X0，該方程的積分式為：

式中：X為菌體濃度，lg（CFU/g）；X0為t=0時菌體的初始濃度，lg（CFU/g）；Xm為菌體的最大濃度，lg（CFU/g）；μm為最大比生長速率，h-1；t為培養時間，h。

1.3.5 數據分析

試驗數據采用DPS 6.01、Excel 2016等軟件進行數據分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 丸麥曲固態發酵系統運行結果

2.1.1 基質三相結構

相較于大曲、小曲以及麩曲的制曲原料，丸麥曲由于具有極高的完整性，屬于類似于散料的制曲原料。因此，在制曲過程中丸麥曲料堆實際是一個復雜的氣-液-固三相結構（見圖2）。

圖2 丸麥基質（a）與結構（b）示意圖Fig. 2 Schematics of Wanmai substrate (a) and structure (b)

丸麥曲料堆中的三相結構會隨著制曲的進行產生波動性變化，如附著于丸麥粒表面的水薄膜是不穩定的，其中肉眼可觀測到的游離水隨著發酵的進行會因為通風、溫度變化等而減少或消失。丸麥顆粒中的水分可能隨著酵母菌的生長出現一定范圍的波動變化，同時也會參加酵母菌生長、繁殖、代謝過程中的物質傳遞與反應。丸麥在堆料過程中會自然形成空隙，形成空氣流動的通道，為酵母菌生長、繁殖過程中提供足夠的氧氣，形成了完整的氣相結構。根據前期的預試驗結果，該基質滿足酵母菌丸麥曲制曲的需求，可以進行后續的深入試驗。

2.1.2 丸麥曲外觀與酵母活菌數

經過丸麥曲固態發酵系統發酵后的四種產香丸麥曲見圖3。由圖3可知，丸麥曲具有較良好的外觀，顆粒分明，基質無明顯塌陷，表明丸麥顆粒之間結構相對穩定。顏色呈現較為均勻的淺黃色，具有適聞香氣。酵母菌在丸麥顆粒表面的生長較均勻，菌落在胚芽部分較胚乳部分明顯集中。這可能是因為胚芽部分提供了更多利于酵母菌生長的營養成分。發酵結束后季也蒙畢赤酵母DQ-10、異常威克漢姆酵母DQ-02、馬爾克斯克魯維酵母DQ-03、漢遜酵母DQ-04四種產香酵母丸麥曲的酵母活菌數（以濕重計）分別達（6.03±0.32）×109CFU/g、（5.49±0.33）×109CFU/g、（4.52±0.25）×109CFU/g、（4.04±0.31）×109CFU/g，表明丸麥曲固態發酵系統運行良好，可以為四株酵母在丸麥表面的生長提供適合的環境且酵母菌可以在丸麥表面生長到較高的密度。

圖3 四種產香酵母丸麥曲Fig. 3 Wanmai-Qu fermented with 4 aroma-producing yeasts

2.2 Logistic菌體生長動力學模型建立與驗證結果

利用DPS 6.01軟件對四種產香酵母丸麥曲固態發酵過程生物量監測值（以干基計）進行擬合，參數估計值見表1。

表1 Logistic方程參數估計值Table 1 Estimation of Logistic equation parameters

將表1參數代入公式（2）即可推導出季也蒙畢赤酵母DQ-10、異常威克漢姆酵母DQ-02、馬爾克斯克魯維酵母DQ-03、漢遜酵母DQ-04在丸麥曲固態發酵中的菌體生長動力學模型，分別為：

上述方程相關系數R2分別為0.963 4、0.968 8、0.979 9、0.983 7，P值均＜0.001，表明方程曲線擬合度較好。根據方程可得丸麥曲固態發酵過程中酵母菌活菌數隨培養時間變化的擬合值，將擬合值與試驗值進行對比，結果見圖4。由圖4可知，4種產香酵母在丸麥上的生長無明顯延滯期，其中酵母活菌數最高值均低于2.1.2中不間斷發酵26 h的丸麥曲。這可能是因為監測取樣時丸麥顆粒之間相對運動，對顆粒表面的酵母菌施加了剪切力導致部分酵母菌死亡。計算四組試驗值與擬合值之間的相對誤差可知，二值之間誤差均＜3%，說明該模型可以較好地描述4種產香酵母菌在丸麥曲固態發酵過程中的生長特征。

圖4 丸麥曲固態發酵過程中酵母菌活菌數的試驗值與模型擬合值Fig. 4 Experimental value and fitted value of models for viable counts of yeasts during Wanmai-Qu solid-state fermentation

3 結論

本研究基于產香酵母丸麥曲工藝創新研究目的，搭建了丸麥曲固態發酵系統，創新性地設計了一款用于丸麥曲培養的雙層式具蓋淺盤生物反應器，可同時滿足減少發酵過程中的雜菌污染和收集廢水的需求；在構建的發酵系統的基礎上探究了不同產香酵母菌的生長情況。分離自濃香型白酒大曲的四種產香酵母在丸麥基質上生長良好，其生長情況均符合Logistic模型，相關系數R2均＞0.96，P值均＜0.001，模型擬合值與試驗值間的相對誤差均＜3%，說明該模型能較好地反映酵母菌在丸麥上的菌體生長動力學特征。因此，丸麥作為一種顆粒狀固態發酵基質，可以供應產香酵母的增殖需求；產香酵母的酒曲化具有一定的可行性。