1例罕見α-地中海貧血產(chǎn)前診斷與家系分子遺傳學(xué)分析

【摘要】 目的對1例疑似攜帶罕見地中海貧血（簡稱地貧）的產(chǎn)前診斷胎兒進(jìn)一步測序分析，對先證者進(jìn)行家系分子遺傳學(xué)分析。 方法運(yùn)用血常規(guī)和血紅蛋白電泳進(jìn)行地貧篩查，采用gap-PCR法和PCR-RDB法檢測24種地貧突變，對疑似罕見地貧進(jìn)行基因測序分析。 結(jié)果先證者為--SEA地貧與α2基因IVS-Ⅱ-119地貧雙重雜合子，其IVS-Ⅱ-119地貧基因遺傳自母方，--SEA地貧基因遺傳自父方。 結(jié)論--SEA/αIVS-Ⅱ-119α HbH地貧患兒的診斷，為罕見地貧的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供科學(xué)理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】地中海貧血；α2基因IVS-Ⅱ-119雜合突變；罕見地貧基因；分子遺傳學(xué)診斷；產(chǎn)前分析

中圖分類號： R714.5; R440文獻(xiàn)標(biāo)志碼： ADOI： 10.3969/j.issn.1003-1383.2024.02.005

Molecular genetic analysis of the family and prenatal diagnosis of 1 case of rare α-thalassemia

LI Jinhua1， ZHAO Wenjie1， QIN Qian1， XU Guidan2

【Abstract】 ObjectiveTo further undergo sequencing analysis on a suspected prenatal diagnosed fetus of rare thalassemia， and to perform family molecular genetic analysis on the proband. MethodsBlood routine and hemoglobin electrophoresis were used to screen thalassemia， 24 thalassemia mutations were detected by gap-PCR and PCR-RDB， and gene sequencing analysis was carried out on suspected rare thalassemia. ResultsThe proband was a double heterozygote for --SEA thalassemia and α2 gene IVS-Ⅱ-119 thalassemia， and the IVS-Ⅱ-119 thalassemia gene was inherited from" her mother， and the --SEA was inherited from her father. ConclusionThe diagnosis of --SEA/αIVS-Ⅱ-119α HbH thalassemia child can provide scientific theoretical basis for genetic counseling and prenatal diagnosis of rare thalassemia.

【Keywords】thalassemia; IVS-Ⅱ-119 heterozygous mutation in α2 gene; rare thalassemia gene; molecular genetic diagnosis; prenatal analysis

地中海貧血（簡稱地貧）是全球分布最廣、累及人群最多、危害最大的一組單基因遺傳病［1-2］，以α-和β-地貧最常見。我國長江以南是地貧高發(fā)區(qū)，重型地貧是出生缺陷的重要病因，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)［3-4］。地貧是由珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白鏈合成障礙而引起的遺傳性溶血性疾病，作為常染色體隱性遺傳性疾病，其代代遺傳，男女發(fā)病概率均等。通過人群篩查和遺傳咨詢，對高風(fēng)險胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷以防止重型患兒的出生是當(dāng)前國內(nèi)外公認(rèn)的首選措施［5］。因此，做好婚前、孕前和產(chǎn)前檢查對地貧的防控至關(guān)重要［6］。在中國人群中α-珠蛋白基因簇的變異以缺失型為主，其中--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2為主要的缺失型α-地貧基因，也是目前常規(guī)地貧基因檢測試劑盒的檢測目標(biāo)。除了--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2這四種常見缺失型α-地貧基因外，中國人群中偶有檢出-α21.9、-α27.6和--FIL等地貧，罕見地貧基因的漏檢，會給地貧產(chǎn)前診斷工作帶來一定的風(fēng)險［7］。在臨床上，實驗室人員和醫(yī)生發(fā)現(xiàn)表型與基因型不符或與孟德爾遺傳規(guī)律相悖的地貧病例時應(yīng)當(dāng)警惕罕見地貧的存在。本文報道1例α2基因IVS-Ⅱ-119地貧復(fù)合--SEA地貧家系的產(chǎn)前分析結(jié)果，并詳細(xì)闡明其表型與基因型特征，以便為罕見地貧的診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前分析提供借鑒。

1 對象與方法

1.1 研究對象

先證者來自百色市婦幼保健院，是孕18周的胎兒。其父親戶籍為廣西百色右江區(qū)陽圩鎮(zhèn)平圩村，母親戶籍為云南省文山壯族苗族自治州硯山縣者臘鄉(xiāng)。雙方常見地貧基因檢測結(jié)果均為--SEA/αα，意味著有生育重型α-地貧兒的風(fēng)險。因此，先證者在2020年11月進(jìn)行產(chǎn)前羊水地貧基因診斷。常規(guī)地貧基因分析顯示，先證者的缺失型α-地貧基因型為--SEA/αα， 但非缺失α-地貧檢測結(jié)果為空白。考慮到結(jié)果矛盾，我們采集先證者父母的樣本進(jìn)一步進(jìn)行罕見地貧基因檢測，并進(jìn)行詳細(xì)的家系分子遺傳學(xué)分析與診斷。先證者于2021年2月22日出生，女孩，筆者采集其出生后第1天外周血進(jìn)行地貧相關(guān)檢測，并對其進(jìn)行隨訪。

1.2 血液學(xué)分析

紅細(xì)胞指標(biāo)（RBC、Hb、HCT、MCV、MCH、RDW-CV等）采用自動血液分析儀（BC 3500，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）檢測；血紅蛋白的組分與含量采用全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（sebia capillarys 2 fiex piercing，法國西比亞公司）檢測；生化血清學(xué)指標(biāo)采用全自動生化檢測儀（AU680，美國貝克曼庫爾特公司）檢測。所有操作嚴(yán)格按照儀器SOP和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 地中海貧血基因測定

基因組DNA采用柱式提法（天根試劑盒）提取。缺失型α-地貧--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI采用gap-PCR法檢測（深圳益生堂生物企業(yè)有限公司基因診斷試劑盒）。常見的3種非缺失型α-地貧αQSα、αCSα、αWSα和17種β-地貧CD41/42（-TTCT）、CD43（GAG-TAG）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、-28（A-G）、-29（A-G）、-32（C-A）、CD71/72（+A）、βE（GAG-AAG）、CD17（AAG-TAG）、CD31（-C）、CD14/15（+G）、CD27/28（+C）、IVS-Ⅰ-1（G-T）、IVS-Ⅰ-5（G-C）、5'UTR、+40-43（-AAAC）、Initiation codon（ATG-AGG）和-30（T-C）采用PCR-RDB法［亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司基因診斷試劑盒］檢測。

1.4 罕見地貧分析

α-珠蛋白基因（α1基因、α2基因）采用Sanger測序檢測［亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司］。

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)分析

先證者父母的MCV和MCH均降低，表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素表型，血紅蛋白分析顯示女方Hb A2正常、Hb F偏高（gt;1.0%），男方Hb A2降低（lt;2.5%）、Hb F正常，先證者出生第一天Hb Barts含量為2.4%，母親生化血清學(xué)指標(biāo)正常（表1），該家系血紅蛋白電泳分析見圖1。根據(jù)地貧診斷標(biāo)準(zhǔn)，其父母可能為α-地貧基因攜帶者。

2.2 常規(guī)地貧基因分型結(jié)果

先證者及其父母均未檢出常見17種β-地貧基因突變，缺失型α-地貧分型結(jié)果均擴(kuò)增出兩個條帶，即--SEA條帶和αα條帶（圖2Ⅰ）；非缺失型α-地貧分型結(jié)果：先證者（羊水樣本）膜條所有位點都不顯色，先證者父親未見異常，先證者（外周血樣本）及其母親未見異常但正常對照位點偏淡（圖2Ⅱ）。

2.3 α-珠蛋白基因測序結(jié)果

先證者的父親未發(fā)現(xiàn)異常；先證者及其母親α1基因未見異常，α2基因 NG_000006.1∶g.34311位置發(fā)生del G；ins CTCGGCCC突變，即IVS-Ⅱ-119（-G，+CTCGGCCC）突變（圖3）。先證者及其母親均為--SEA地貧與α2基因IVS-Ⅱ-119地貧雙重雜合子，先證者IVS-Ⅱ-119地貧基因遺傳自母方，--SEA地貧遺傳自父方，該家系的遺傳圖譜如圖4所示。

3 討論

目前，臨床上地貧篩查主要采取血常規(guī)和血紅蛋白電泳技術(shù)進(jìn)行初篩，對初篩陽性者進(jìn)行基因確診的三級篩查模式［8-9］。在進(jìn)行常規(guī)地貧基因分析時，國內(nèi)大部分基因檢測機(jī)構(gòu)使用的商品化試劑盒，通常只包含23種常見的突變類型，其中包括采用Gap-PCR技術(shù)檢測的3種缺失型α-地貧，采用PCR-RDB技術(shù)檢測的3種非缺失型α-地貧和17種β突變地貧，有些試劑盒會在23種突變類型的基礎(chǔ)上增加--THAI缺失型α-地貧的檢測。近年來，隨著分子診斷技術(shù)的飛速發(fā)展和應(yīng)用，傳統(tǒng)地貧篩查模式的不足逐漸顯現(xiàn)［10-11］。根據(jù)人類異常血紅蛋白和地中海貧血數(shù)據(jù)庫（http：//globin.bx.psu.edu/cgi-bin/hbvar/query_vars3），截至2023年7月，已有538種地貧被報道。罕見地貧在常規(guī)檢查中容易漏診而導(dǎo)致產(chǎn)前診斷的誤診，因而罕見地貧的精準(zhǔn)診斷對產(chǎn)前診斷尤為重要［12-13］。因此，在臨床工作中，地貧篩查一定要結(jié)合血液學(xué)指標(biāo)，當(dāng)血常規(guī)和（或）血紅蛋白電泳分析陽性，但常見地貧基因分型未檢出突變時，則需警惕罕見地貧基因突變的存在，應(yīng)進(jìn)一步檢測確認(rèn)［14］。

人類α珠蛋白基因定位于16pter-p13.3，大小約26 kb，含3個外顯子與2個內(nèi)含子，基因排列的順序為5'-ζ-Ψζ-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ-3'，α1與α2基因編碼區(qū)的核苷酸序列完全相同，非翻譯區(qū)則至少存在19個堿基不同，另外，α1的第2個內(nèi)含子的序列較長［15-17］。每個單倍體含有2個α基因，因此正常人一共有4個α珠蛋白基因（αα/αα）。α-地貧是一種由于α-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而導(dǎo)致的單基因遺傳性血液病，多由α基因的缺失突變所致，少數(shù)由非缺失突變所致。重型α-地貧，又叫Hb Bart's水腫綜合征，是由于4個α基因都缺失 （--/--），往往在孕后期或出生后不久死亡，新生兒臍血中以Hb Bart's為主；中間型α-地貧，又稱HbH病，是由于有3個α基因發(fā)生了突變（--/-α或--/αTα），是α-地貧存活者中最嚴(yán)重的一種，絕大多數(shù)電泳可見HbH區(qū)帶，新生兒臍血中HbH和Hb Bart's含量可達(dá)10%以上；輕型α-地貧，是由于2個α基因發(fā)生了突變（--SEA/αα、-α/-α、-α/αTα或αTα/αTα），臨床上往往輕度貧血或不貧血，新生兒臍血中Hb Bart's含量為5%～10%；靜止型α-地貧是α-地貧中最輕微的類型，是由于1個α基因發(fā)生了突變（-α/αα或αTα/αα），通常沒有貧血的臨床表現(xiàn)，新生兒臍血中Hb Bart's含量為1%～2%［15-17］。

α2基因的IVS-Ⅱ-119突變是一種罕見的地貧基因突變，其分子生物學(xué)機(jī)制是在α珠蛋白α2基因 NG_000006.1∶g.34311位置發(fā)生“-G，+CTCGGCCC”雜合突變， 鑒于該家系對臨床有一定的借鑒作用， 遂進(jìn)行相關(guān)報道。目前，已報道了3例散發(fā)IVS-Ⅱ-119地貧病例，均為中國人群中發(fā)現(xiàn)，其中曹鵬駒等［18］ 2019年報道福州地區(qū)2074例疑似地貧人群中檢出了1例--SEA /αIVS-Ⅱ-55（Tgt;G），IVS-Ⅱ-119 α地貧，WANG等［19］ 從166 936例海南人群中檢出1例-α3.7/αIVS-Ⅱ-55 （Tgt;G）， IVS-Ⅱ-119α地貧，以上兩個報道缺乏血液學(xué)表型。李育敏等［20］個例報道中的基因型與本研究的先證者及其母親的一樣，其MCV、MCH和Hb A2均降低，呈現(xiàn)α地貧表型，但并未貧血。由于該突變可能導(dǎo)致DNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且該位置與本實驗所使用的非缺失型α-地貧檢測試劑盒的上游引物位置接近，這在一定程度上影響了模板與引物的結(jié)合［20］，這應(yīng)該是先證者（外周血）及其母親非缺失型α-地貧正常對照位點偏淡的原因。而先證者羊水DNA提取濃度較低，低濃度的模板大大影響了與上游附近存在突變的引物之間的結(jié)合，因此，非缺失型α-地貧膜條所有位點都不顯色，這也提醒實驗室人員，應(yīng)注意檢測的產(chǎn)前樣本DNA濃度是否達(dá)到要求，以免影響檢測結(jié)果。經(jīng)基因測序分析，證實該家系中先證者及其母親的地貧基因型均為--SEA/αIVS-Ⅱ-119α，為罕見HbH病，但先證者出生1天血紅蛋白電泳Hb Bart's檢出量僅為2.4%，無HbH帶，這與HbH病患者出生時HbH和Hb Bart's含量差異懸殊［15］；其母親血紅蛋白電泳也未檢出HbH帶，結(jié)果與絕大多數(shù)HbH病患不一致［15］。中間型α-地貧未檢出HbH帶的病例鮮有報道， 與本研究結(jié)果相似，吳潤強(qiáng)等［21］報道了一例--SEA/-α3.7不形成HbH的特殊病例。由于內(nèi)含子對翻譯產(chǎn)物無意義，不受自然選擇的壓力，比外顯子可能累積更多的突變，此前也報道α2基因內(nèi)含子可能發(fā)生的非致病性突變位點［22］。HbH臨床表現(xiàn)差異較大，即使基因型完全相同的HbH患者，臨床表型仍有明顯差異，給產(chǎn)前診斷和早期干預(yù)帶來了困難［1］。截至2022年8月，隨訪發(fā)現(xiàn)1歲半的先證者無貧血相關(guān)癥狀，先證者1歲10個月因上呼吸道感染行血常規(guī)檢查，表現(xiàn)為輕度貧血，MCV、MCH呈典型的地貧特征（表1）。IVS-Ⅱ-119突變對mRNA剪接加工無明顯影響，從而可能對α-珠蛋白基因的表達(dá)影響不大，本家系結(jié)合表型分析，推測該突變傾向于非致病性，因此對表型影響不大。

地貧難治可防，阻止重型地貧兒的出生是國內(nèi)外公認(rèn)的首選重要措施［23-24］。但是罕見地貧給重型地貧胎兒零出生帶來巨大挑戰(zhàn)。在實際工作中，臨床醫(yī)師和實驗室人員在進(jìn)行地貧基因診斷時，需要結(jié)合初篩檢測和基因分型結(jié)果綜合判斷，以免漏診。同時，應(yīng)客觀評價不同檢測方法的局限性，必要時應(yīng)采用多種檢測方法互相驗證。本研究報道了1例罕見α-地貧家系的分子遺傳學(xué)診斷與產(chǎn)前分析，為罕見地貧的診斷和產(chǎn)前分析提供參考依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)： 李金花負(fù)責(zé)文獻(xiàn)的檢索，論文起草，實驗指標(biāo)的分析與解釋；趙文杰負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的收集與整理；覃茜負(fù)責(zé)結(jié)果的分析與解釋；許桂丹提出研究思路，負(fù)責(zé)最終版本修訂，對論文負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2023-01-07 修回日期：2023-07-28）

（編輯：黃研研 梁明佩）

基金項目： 廣西自然科學(xué)基金（2020GXNSFBA297047）； 百色市本級財政科技計劃項目（百科20211815）；右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2020年度高層次人才科研項目（Y202011708）

第一作者簡介： 李金花，女，主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，研究方向：地中海貧血篩查與診斷。E-mail：710839134@qq.com

通信作者： 許桂丹。E-mail：597900654@qq.com

［本文引用格式］ 李金花，趙文杰，覃茜，等.1例罕見α-地中海貧血產(chǎn)前診斷與家系分子遺傳學(xué)分析［J］.右江醫(yī)學(xué)，2024，52（2）：127-132.