宏基因組二代測序在肺部感染患者病原體檢測中的價(jià)值

戴新剛

溧陽市中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，江蘇溧陽 213300

判斷肺部感染患者病因種類時(shí)，可采取痰液培養(yǎng)、支氣管灌洗液涂片等方式，其于臨床上應(yīng)用廣泛且操作簡便，適合于早期快速篩查工作，同時(shí)還可配合血液檢查、肺部影像檢查等結(jié)果綜合評估病情[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、支原體等導(dǎo)致的肺部感染概率最高，尤其是在抗生素類制劑尚未被發(fā)現(xiàn)之前，肺炎鏈球菌是肺部感染的最常見原因[2]。但傳統(tǒng)方法實(shí)際操作時(shí)會受到多種客觀因素的影響，繼而導(dǎo)致陽性率波動，加之可能存在混合感染的情況，使得診斷準(zhǔn)確率難以滿足現(xiàn)代治療的需求。宏基因組二代測序（Metagenomic Next-generation Sequencing, mNGS）技術(shù)則是直接通過對樣本中的核酸物質(zhì)給予測序，從而獲取感染源的遺傳信息，在判斷感染源的工作中能夠發(fā)揮指導(dǎo)作用[3]。本研究選取溧陽市中醫(yī)醫(yī)院呼吸科于2022年1—12月收治的70例疑似肺部感染患者作為研究對象，探討mNGS用于病原體檢測的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的70例疑似肺部感染患者作為研究對象。其中男39例，女31例；年齡25～72歲，平均（49.85±3.77）歲；入院時(shí)58例患者癥狀表現(xiàn)為劇烈咳嗽，22例患者發(fā)熱，6例患者咳血。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核（2021LY-12-20-01）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過肺部CT等影像檢查及臨床綜合診斷疑似肺部感染疾病；②抽血檢查存在血象升高情況；③臨床資料完整；④對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并支氣管疾病患者；②合并肺部腫瘤疾病患者；③合并自身免疫性疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 mNGS檢測 ①標(biāo)本采集：需由院內(nèi)擁有臨床操作經(jīng)驗(yàn)至少5年的纖維支氣管鏡醫(yī)師負(fù)責(zé)實(shí)施。先為患者開展纖支鏡下的肺泡灌洗手術(shù)，選擇地西泮（國藥準(zhǔn)字H41020631；規(guī)格：2 mL∶10 mg×10支/盒）5 mg肌注適當(dāng)鎮(zhèn)靜，隨后經(jīng)由鼻腔向支氣管內(nèi)置入纖支鏡，觀察病灶所在的支氣管或肺內(nèi)情況，期間通過利多卡因給予黏膜局部麻醉，以最大程度控制不適感。根據(jù)病變程度由重至輕實(shí)施關(guān)系，注射適溫生理鹽水，劑量控制在60～120 mL，再以正負(fù)壓反復(fù)抽吸，壓力控制在100 mmHg左右。灌洗完成后將灌洗液回收備用，回收率需達(dá)到40%～60%，回收量需＞10 mL。將回收的灌洗液轉(zhuǎn)移至滅菌后的密封容器中，并立即實(shí)施冰凍保存，轉(zhuǎn)運(yùn)至檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)內(nèi)開展mNGS檢測，所有操作均需按照檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。②檢測方法：檢測時(shí)需提取3～5 mL灌洗液樣本，將其轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，置入離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行處理，離心機(jī)內(nèi)環(huán)境溫度需控制在4℃，離心速率設(shè)定為4 000 r/min，連續(xù)離心10 min后提取沉淀物樣本。使用mNGS相關(guān)試劑盒，根據(jù)說明書內(nèi)操作標(biāo)準(zhǔn)對樣本中的DNA碎片進(jìn)行提取。首先需將樣本經(jīng)超聲破碎處理，使DNA片段保持在150 bp左右即可，再借助Agilent 2 100型質(zhì)控文庫插入200～300 bp的DNA片段，經(jīng)環(huán)化處理后獲得單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)。環(huán)化處理后還需進(jìn)一步使用文庫開展?jié)L環(huán)式復(fù)制，以此生成DNB納米球。將制備好的納米球加載至測序芯片中，使用配套軟件對DNA序列進(jìn)行測量，測序時(shí)需將長度＜35 bp的低質(zhì)量片段去除，以此確保測序數(shù)據(jù)的整體質(zhì)量。再通過測序庫和人類參考DNA基因組進(jìn)行對比，將屬于人類的基因序列清除，隨之獲得感染源的DNA序列，再將其與細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲的基因庫進(jìn)行對比，從而確定感染源的具體種類。

1.3.2 痰培養(yǎng) 由護(hù)理人員負(fù)責(zé)采集患者的痰液樣本，最好取晨起時(shí)的第1口痰液，采樣前先清水漱口，去除口腔內(nèi)雜菌，指導(dǎo)患者咳嗽方法，咳出呼吸道深部痰液樣本，密封后送往檢驗(yàn)科室。檢測嚴(yán)格遵照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和分離，使用PROBACT-K自動化細(xì)菌分離培養(yǎng)儀和西門子WalkAway-40plus全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，鑒定分離出的細(xì)菌并進(jìn)行藥品試驗(yàn)，并參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2012標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo)

①準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度。以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較mNGS技術(shù)、痰培養(yǎng)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)針對病原體的檢出率。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；準(zhǔn)確度=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

②mNGS與痰培養(yǎng)對病原體診斷符合率的比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行本文研究數(shù)據(jù)的處理，診斷符合率、診斷效能（靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度）為計(jì)數(shù)資料，以例數(shù)（n）和率（%）表示，差異比較行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢查方法的診斷效能比較

經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，70例疑似肺部感染患者中，有50例確診肺部感染疾病，20例未感染；mNGS靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率均明顯高于痰培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

2.2 兩組檢查方法的診斷符合率比較

經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，檢出銅綠假單胞菌18例、肺炎鏈球菌12例、曲霉菌8例、結(jié)核分歧桿菌6例、非結(jié)核分歧桿菌6例，mNGS檢測與經(jīng)痰培養(yǎng)檢驗(yàn)符合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩種檢查方法對病原體診斷符合率對比（%）

3 討論

由于肺部與外界始終存在氣體交換，因此很容易受到外界病菌的侵入，從而產(chǎn)生肺部感染類病變。該病癥可由多種病原體引發(fā)，包括細(xì)菌、病毒、真菌等，臨床治療時(shí)需先對感染源的種類、耐藥性等特征給予確認(rèn)，從而實(shí)施針對性的干預(yù)，以提升整體治療效果。肺部感染屬于呼吸系統(tǒng)中最常見的病變之一，病情較輕者通過常規(guī)的抗感染治療即可快速痊愈，而病情較重的群體則很可能威脅生命安全[4-5]。臨床在治療肺部感染時(shí)可通過應(yīng)用廣譜抗菌藥物以抑制病原體的生長，但若病情較為嚴(yán)重或存在耐藥菌的情況，則廣譜抗菌藥物的治療效果不佳，甚至可能誘發(fā)多重耐藥菌株的產(chǎn)生，給后續(xù)治療帶來更大的難題[6-7]。為此，針對中度及以上的肺部感染患者，可先實(shí)施廣譜抗菌藥物抑制病菌的生長速度，再針對感染源種類給予檢測，參考檢測結(jié)果選擇相應(yīng)的窄譜抗菌藥物實(shí)施針對性治療。

病原體檢測的常用方式包括痰液樣本培養(yǎng)、灌洗液樣本涂片培養(yǎng)等，其操作簡便，在醫(yī)院內(nèi)即可完成[8-9]。但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)受外界客觀因素影響嚴(yán)重，導(dǎo)致檢出率有所下降。mNGS技術(shù)則是利用對灌洗液中包含的病原體遺傳物質(zhì)進(jìn)行測序，從而準(zhǔn)確判定病原體的具體種類[10-12]。本研究結(jié)果顯示，mNGS檢測對病原體檢出率（準(zhǔn)確率98.57%）高于痰培養(yǎng)（P＜0.05），這與張安兵等[13]研究結(jié)果一致，觀察組病原體檢出率（92.85%）高于對照組（P＜0.05）。說明運(yùn)用mNGS檢測可以提升病原體的檢出率，尤其是少見病原菌的檢出。分析原因：痰培養(yǎng)以往被視為診斷感染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床實(shí)踐中，由于標(biāo)本收集不合格、標(biāo)本保存不當(dāng)致病原菌死亡，加之部分微生物不能培養(yǎng)的特性，以及痕菌量少無法被檢測等原因，導(dǎo)致痰培養(yǎng)存在假陰性結(jié)果[14-15]。而mNGS技術(shù)能夠在單次檢測中對數(shù)百萬條遺傳物質(zhì)給予測序，從而獲得樣本中所有病原體的基本信息，其檢出率、靈敏度、檢驗(yàn)速度均相對較高，且不會受到宿主個(gè)體差異、是否使用抗菌藥物等客觀因素的影響，大幅提升病原體檢測的準(zhǔn)確度[16-18]。

綜上所述，宏基因組二代測序技術(shù)可以有效規(guī)避傳統(tǒng)痰培養(yǎng)的假陰性問題，以此提高肺部感染患者病原體種類的診斷準(zhǔn)確度。