PEG3、STMN1基因在非小細胞肺癌的表達及其與臨床病理特征、血管生成相關性研究*

訾瑞， 胡萍

（寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院 腫瘤內科， 寧夏 銀川 750004）

肺癌是亞洲女性及45 歲以下人群最易發生的惡性腫瘤，常見影響因素包含遺傳、吸煙及被動吸煙等[1]。肺癌仍是惡性腫瘤死亡的主要原因，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）的發生率占肺癌的80%。NSCLC 早期臨床癥狀隱匿性較強，確診時易發生血行轉移，多數患者錯過最佳治療時機，5 年生存率較低[2]。肺癌細胞的增殖、分化及轉移過程均依賴血管生成，腫瘤新生血管導致患者預后不佳。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是當前公認的腫瘤血管生成的刺激因子，在肺癌中過表達，能加快腫瘤細胞侵襲及轉移，惡化病情[3]。現有的腫瘤標志物在肺癌早期篩查中效果不佳，敏感性和特異性較低，往往達不到早發現、早診斷的要求[4]。現階段，有學者提出采用基因檢測技術可提高對腫瘤的診斷價值，進而有利于進行針對性治療，提高治療準確性，降低患者痛苦。肺癌組織的父系表達基因3（paternally expressed gene 3, PEG3）表達下調，抑微管裝配蛋白1（Stathmin 1, STMN1）表達上調[5]，猜測這兩種基因聯合可能會增加NSCLC 診斷的敏感性與特異性。

PEG3 位于人體染色體19q13.43 上，包含一些非編碼區域，可參與調控多種信號通路表達，例如能夠通過抑制Wnt 信號而遏制膠質瘤生長，且通過調控核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）水平而調節糖尿病腎臟功能[6]。肺腺癌、膠質瘤、乳腺癌及子宮內膜癌組織中PEG3 表達缺失，顯著低于癌旁組織，富集分析認為PEG3 的DNA 甲基化發生改善可導致染色體結構改變，可通過關閉抑癌基因活性而促進腫瘤細胞發生發展[7]。STMN1 定位于人基因染色體1p35-36 中，全長6.3 kb，具有高度保守性，與腫瘤發生、發展密切相關。STMN1 在肺癌組織中表達升高，采用化療藥物長春瑞濱干預后表達降低，患者中位生存期增加，反之，其表達升高，患者生存率降低[8]。本文探討PEG3、STMN1 基因在NSCLC 中的表達及其與臨床病理特征和血管生成的關系，期望為相關研究提供有利依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院2021 年1 月—2023 年1 月收治的經組織學確診的96 例NSCLC 患者作為研究對象，經手術切除后保留NSCLC 患者癌組織及癌旁正常組織（距癌組織邊緣>5 cm）放入液氮中低溫保存。納入標準：①未接受放化療或免疫治療等；②術前經支氣管鏡或腫塊穿刺標本病理檢查確診；③所有研究對象均根據第8 版TNM 標準進行分期[9]；④組織樣本均由患者或家屬知情同意獲取；⑤病理資料齊全。排除標準：①合并嚴重纖維化；②腫瘤發生轉移；③合并其他部位惡性腫瘤；④妊娠和哺乳期；⑤參與其他臨床項目研究者。96 例NSCLC 患者男性55 例，女性41 例；年齡34～74 歲，平均（63.25±9.80）歲；TNM 分期Ⅰ期20 例、Ⅱ期46 例、Ⅲ期30 例；腺癌25 例，鱗癌71 例；高分化24 例；中分化38 例，低分化34 例；淋巴結轉移45 例，未轉移51 例。本研究經醫院醫學倫理委員會審核標準（倫理編號：KYLL-2021-698），患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人PEG3 單抗（上海易匯生物科技有限公司，貨號：sc-102056），兔抗人STMN1 多抗（武漢博歐特生物科技有限公司，貨號：orb512182），兔抗人VEGF 多抗（北京義翹神州股份有限公司，貨號：10542-RP01），兔抗人CD105 單抗（北京義翹神州股份有限公司，貨號：10149-R103-A），兔抗人VEGF 多抗（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：AV202），CD105（上海莼試生物技術有限公司，貨號：CSK99816），免疫組織化學SP 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CDLG-4852)；TRIzol 試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司，貨號：11131-100），Nano-Drop 2000c 紫外可見光分光光度計（美國 Thermo Fishe 公司），CFX 型號熒光定量儀（美國伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 資料采集 收集所有研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、TNM 分期、分化程度及淋巴結轉移等。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測PEG3、STMN1、VEGF 及CD105 mRNA 表達 取NSCLC 患者癌組織及癌旁組織，TRIzol 法提取組織中RNA。紫外分光光度計測定RNA 濃度、純度及完整性，經鑒定RNA 無降解符合后續實驗標準。按照轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。反應體系為20 μL，分別為總RNA 1.5 μL、特異性莖環逆轉錄引物2.0 μL、RNA 酶抑制劑1.0 μL、緩沖液4.0 μL、逆轉錄酶1.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、DECP 水8.5 μL。PEG3 正向序列：5′-TAATGAAAGTGTTTGAGATTTG TTC-3′，反向序列：5′-CCTATAAACAACCCCACAC CTATAC-3′；STMN1 正向序列：5′-TGAAAGACGCA AGTCCCAT-3′，反向序列：5′-GGTAGCCCCTAAAA CAACAT-3′；VEGF 正向序列：5′-CAGCACGAGCTA CCTCAGCAAG-3′，反向序列：5′-TTTAGACATGCA TCGGCAGGAA-3′；CD105 正向序列：5′-GTCTTGC GCAGTGCTTACTC-3′，反向序列：5′-AGTGTGGGC TGAGGTAGAGG-3′；β-actin 正向序列：5′-GGCATC GTGATGGACTCCG-3′，反向序列：5′-GCTGGAAGG TGGACAGCGA-3′。反應條件：42 ℃ 60 min，25 ℃5 min，70 ℃ 5 min。合成cDNA，低溫保存。PEG3、STMN1 均由中國北京賽百盛基因技術有限公司合成。按照TaqMan PCR 說明書進行PCR。反應體系20 μL：正反向引物分別0.6 μL，cDNA 模板2.0 μL，2×Taqman PCR Master Mix為10.0 μL，DECP水6.8 μL。反應條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸7 min，40 個循環。樣本為3 個復孔，反應過程中熒光信號達到所設定值所經歷的循環數為Ct 值。所有實驗重復3 次，以β-actin 為內參，2－ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.3.3 免疫組織化學SP 法檢測PEG3、STMN1、VEGF及CD105蛋白表達 NSCLC 患者癌組織及癌旁組織石蠟包埋，連續4 μm 切片，脫蠟、二甲苯水花，微波爐修復，3%的H2O2失活，低火加熱1 min修復抗原加血清封閉，加一抗PEG3（1∶200）、STMN1（1∶200）、VEGF（1∶100）及CD105（1∶100），磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1∶1 000），最后加入DAB 顯色劑染色。蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結果由本院病理科兩位高年資病理醫師共同評估，每張切片對100 個觀察細胞數的高倍鏡視野進行評估，高倍鏡視野至少10 個。PEG3、VEGF 蛋白陽性物質定位于細胞漿中，棕黃色或棕褐色顆粒。STMN1、CD105 蛋白陽性物質定位于細胞膜和細胞漿著色，呈棕褐色顆粒狀。評分標準：①以陽性細胞數在同類細胞數中占比進行評分：無為0 分，< 20%為1 分，20%～60%為2 分，> 60%為3 分；②按切片中細胞著色深度進行評分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；兩項乘積為最終的得分。< 4分定義為低表達，≥ 4分定義為高表達。

1.4 統計學方法

數據分析采用Graph Pad Prism 8.0 統計軟件。計數資料以構成比或率（%）表示，比較做χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；相關性分析用Pearson 法；繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic, ROC）曲線。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 組織與癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF和CD105 mRNA相對表達量的比較

NSCLC 組織與癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF和CD105 mRNA 相對表達量的比較，差異有統計學意義（P<0.05）；與癌旁組織相比，NSCLC 組織的PEG3 表達降低，STMN1、VEGF 及CD105 表達升高。見表1。

2.2 NSCLC 組織及癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF及CD105陽性表達

NSCLC 組織的STMN1、VEGF 及CD105 陽性率分別為62.50%（60/96）、69.79%（67/96）、72.92%（70/96），癌旁組織的分別為5.21%（5/96）、10.42%（10/96）、13.54%（13/96），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=70.360， 70.450 和68.950， 均P=0.000）；NSCLC 組織高于癌旁組織。NSCLC 組織的PEG3 陽性率為8.33%（8/96），癌旁組織為73.96%（71/96），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=85.360，P=0.000），NSCLC 組織低于癌旁組織。見圖1。

圖1 NSCLC組織及癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF及CD105陽性表達 （免疫組織化學×400）

2.3 不同臨床病理特征NSCLC 患者的PEG3、STMN1 mRNA相對表達量的比較

不同年齡、性別及腫瘤類型NSCLC 患者的PEG3、STMN1 mRNA 相對表達量的比較，差異無統計學意義（P>0.05）。不同TNM 分期NSCLC 患者中，Ⅰ期20 例，Ⅱ期46 例，Ⅲ期30 例，PEG3 及STMN1 mRNA 相對表達量的比較，差異有統計學意義（P<0.05）。45 例有淋巴結轉移與51 例無淋巴結轉移NSCLC 患者的PEG3、STMN1 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）。不同分化程度NSCLC 患者中，高分化24 例，中分化38 例，低分化34 例，PEG3 及STMN1 mRNA 相對表達量的比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者的PEG3、STMN1 mRNA相對表達量的比較

2.4 NSCLC 組織的PEG3、STMN1 與VEGF 及CD105相關性

經Pearson 相關分析，NSCLC 組織的PEG3 與STMN1（r=-0.338，P=0.011）、與VEGF（r=-0.405，P=0.001）及CD105（r=-0.358，P=0.008）均呈負相關，NSCLC 組織的STMN1 與VEGF（r=0.305，P=0.028）及CD105（r=0.380，P=0.004）均呈正相關。見圖2。

2.5 PEG3、STMN1對NSCLC的診斷價值

PEG3 診斷NSCLC 的曲線下面積為0.750（95% CI：0.453，0.936）、敏感性為73.66%（95% CI：0.650，0.937）、特異性為79.62%（95% CI：0.590，0.956）；STMN1 診斷NSCLC 的曲線下面積為0.796（95% CI：0.540，0.942）、敏感性為80.30%（95% CI：0.744，0.978）、特異性為81.12%（95% CI：0.612，0.996）；PEG3+STMN1 聯合診斷的曲線下面積為0.935（95% CI：0.753，0.995）、敏感性為92.33%（95% CI：0.751，0.930）、特異性為77.12%（95% CI：0.735，0.948）。見表3 和圖3。

圖3 PEG3、STMN1診斷NSCLC的ROC曲線

表3 PEG3、STMN1對NSCLC的診斷價值分析

3 討論

NSCLC 是呼吸系統最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展涉及到致癌基因激活、抑癌基因缺失、環境及遺傳等因素，但隨著研究的深入，其生存率及治愈率未見明顯改善，因此，提高其診斷的準確性對改善患者預后有重要作用[10]。

PEG3 是1996 年外國學者KUROIWA 在母系及父系二體胚胎中發現的印跡基因[11]。PEG3 被鑒定為鋅指基因，參與多種信號通路表達進而調控機體代謝[11]。PEG3 可以調控Siah1 信號通路促進其從細胞漿至線粒體中移位，可以抑制Wnt 活性，提高抑癌基因p53 活性進而促進腫瘤細胞凋亡。國外學者研究表明，在PEG3 在腫瘤細胞中表達缺失的原因與啟動子甲基化及丟失雜合性相關[12]。STMN1 已經證實在卵巢癌及乳腺癌中呈高表達[13-14]，可作為細胞信號傳導分子在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。本研究結果表明，NSCLC 組織中PEG3 表達下調，STMN1 表達上調，并與患者TNM 分期及分化程度有關，前者同時與淋巴結轉移有關。PEG3 在NSCLC 組織表達下調，其表達缺失導致患者預后較差，推測其表達缺失后導致抑癌因子失活，可加快腫瘤細胞淋巴結轉移而降低患者生存期。有研究探討STMN1 與肺癌的關系，證實其在肺癌組織中高表達，與患者的性別、吸煙史、腫瘤病理等無關，但是與腫瘤分化程度相關[5]。本研究結果與之相似，均證實STMN1 作為致癌因子促進肺癌的發生、發展。STMN1 在肺腺癌中表達升高，并與患者分化程度相關，認為可以將其作為疾病診斷相關指標[15]。但是關于兩者與肺癌血管生成關系的研究較少，本文以此作為創新點，探討PEG3、STMN1 基因在NSCLC 組織的表達，及其與臨床病理特征的關系，以及與血管生成的相關性。

肺癌的發生、發展是一個多步驟過程，其中腫瘤微血管是腫瘤發生浸潤及轉移的主要過程，VEGF 及CD105 均為腫瘤血管生成的主要因子。VEGF 是促血管活性因子，與受體結合后可加快血管內皮細胞增殖而加快腫瘤血管新生[16]。CD105 又稱內皮糖蛋白，可在細胞膜上表達，轉化生長因子-β（transform growth factor-β, TGF-β）受體是其主要活性成分，具有加快血管生成的作用[17]。肺癌組織中VEGF 及CD105 均表達升高，且復發性肺癌患者中表達水平高于未復發患者，認為兩者均以調節相關信號通路加快腫瘤血管及淋巴結新生，進而加快腫瘤侵襲及轉移[18]。本研究結果表明，NSCLC 組織的STMN1、VEGF 及CD105 表達升高，PEG3 表達降低；PEG3 與VEGF 及CD105 均呈負相關，STMN1 與VEGF 及CD105 均呈正相關。這說明上調STMN1 表達可以增加肺癌組織的侵襲及轉移，而VEGF 及CD105 能夠為腫瘤細胞侵襲及轉移提供有利條件，NSCLC 組織的STMN1、VEGF 及CD105均可以加快腫瘤進程；上調PEG3 表達可以改善患者預后，降低腫瘤細胞侵襲及轉移，與VEGF 及CD105 呈負相關。目前，臨床上常見的肺癌標志物為血清學檢查，有CEA、CYFRA21-1、SCCA、NSE、 ProPR 等[4]。 其中， CEA、 CYFRA21-1、SCCA 主要用于小細胞肺癌檢測。但是這些指標在肺癌早期診斷中效果欠佳，敏感性和特異性均不高。近些年，隨著基因生物技術的發展，肺癌疾病發現多種基因活性發生改變，因此通過對異常基因進行針對性治療，對降低患者的病死率及提高診斷率意義重大[19]。本研究ROC 曲線分析結果表明，PEG3 對NSCLC 的診斷敏感性、特異性分別為73.66%、79.62%，STMN1 對NSCLC 的診斷敏感性、特異性分別為80.30%、81.12%，PEG3+STMN1聯合診斷的敏感性、特異性分別92.33%、77.12%，聯合診斷價值顯著提高。

綜上所述，NSCLC 組織PEG3 降低、STMN1 升高，與肺癌TNM 分期、分化程度有關，其可以加快腫瘤血管生成。PEG3+STMN1 聯合診斷有望于成為肺癌的新的診斷參考指標，有助于疾病的早期診斷和提高臨床療效。本研究的不足之處是本研究樣本量小，還需進一步更多研究證實本研究結論。