靶向調控PTEN和PI3K對腎母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響

耿耿 鹿洪亭 李慶浩 明明

［摘要］ ?目的 ?探討靶向調控張力蛋白同源物（PTEN）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K）對腎母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響及其機制。

方法選取15例腎母細胞瘤患兒的術后腫瘤組織及癌旁正常組織，采用免疫印跡實驗及實時熒光定量PCR方法檢測組織中

PTEN和PI3K蛋白及mRNA的表達水平；將腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞分為對照組（A組，轉染NC siRNA及Flag空載體）、PTEN過表達組（B組，轉染NC siRNA及Flag-PTEN表達載體）、PI3K敲低組（C組，轉染siPI3K及Flag空載體）、聯合靶向組（D組，轉染siPI3K及Flag-PTEN）。采用免疫印跡實驗檢測各組轉染24 h后SK-NEP-1細胞中PI3K、蛋白激酶A（AKT）及磷酸化蛋白激酶A（p-AKT）的表達水平；采用CCK-8實驗檢測干預第24、48、72小時時SK-NEP-1細胞增殖情況；采用流式細胞術分析各組SK-NEP-1細胞轉染24 h后細胞凋亡率及細胞周期。

結果與癌旁正常組織相比，腎母細胞瘤腫瘤組織中PI3K蛋白及mRNA表達水平均顯著升高（t=22.862、7.098，P<0.05），PTEN蛋白及mRNA表達水平均顯著降低（t=25.634、8.379，P<0.05）；體外細胞實驗結果顯示，B、C、D組SK-NEP-1細胞中p-AKT蛋白水平明顯低于A組（t=8.386～11.900，P<0.05）；CCK-8實驗顯示，干預第48、72小時時，B、C、D組SK-NEP-1細胞吸光度值明顯低于A組（t=5.163～8.647，P<0.05），干預第72小時時，D組SK-NEP-1細胞吸光度值明顯低于B、C組（t=3.982、4.021，P<0.05）；B、C、D組SK-NEP-1細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于A組（t=4.673～9.563，P<0.05），D組SK-NEP-1細胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯高于B、C組（t=5.829～8.075，P<0.05）；B、C、D組SK-NEP-1細胞G1期細胞比例明顯高于A組（t=7.518～14.747，P<0.05），S期細胞比例明顯低于A組（t=8.029～13.451，P<0.05），D組SK-NEP-1細胞G1期細胞比例明顯高于B、C組（t=9.930、9.732，P<0.05），S期細胞比例明顯低于B、C組（t=10.281、9.927，P<0.05）。

結論相比于單一靶向PTEN或PI3K，聯合靶向調控PTEN和PI3K可更顯著抑制腎母細胞瘤細胞生長，促進腎母細胞瘤細胞凋亡，其作用機制可能與其抑制PI3K/AKT信號通路、阻斷細胞周期有關。

［關鍵詞］ ?Wilms瘤；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期；PTEN磷酸水解酶；磷酸肌醇3-激酶類

［中圖分類號］ ?R737.11

［文獻標志碼］ ?A

Effect of targeted regulation of phosphatase and tensin homolog and phosphatidylinositol 3-kinase on the proliferation and apoptosis of nephroblastoma cells

GENG Geng， LU Hongting， LI Qinghao， MING Ming

（Department of Pediatric Surgery， The Affiliated Taian City Central Hospital of Qingdao University， Taian 271000， China）?;

［ABSTRACT］?Objective?To investigate the effect and mechanism of targeted regulation of phosphatase and tensin homolog （PTEN） and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） on the proliferation and apoptosis of nephroblastoma cells.

Methods?Posto-perative tumor tissue and normal paracancerous tissue were collected from 15 children with nephroblastoma， and Western blotting and quantitative real-time PCR were used to measure the protein and mRNA expression levels of PTEN and PI3K in tissue. Nephroblastoma SK-NEP-1 cells were divided into control group （group A， transfected with NC siRNA and Flag empty vector）， PTEN overexpression group （group B， transfected with NC siRNA and Flag-PTEN expression vector）， PI3K knockdown group （group C， transfected siPI3K and Flag empty vector）， a nd combined targeting group （group D， transfected siPI3K and FLAG-PTEN）. Western blotting was used to measure the expression levels of PI3K， protein kinase A （AKT）， and phosphorylated AKT （p-AKT） in SK-NEP-1 cells at 24 h after transfection; CCK-8 assay was used to observe the proliferation of SK-NEP-1 cells at 24， 48， and 72 h of intervention; flow cytometry was used to observe apoptosis rate and cell cycle at 24 h after transfection.

Results

Compared with normal paracancerous tissue， nephroblastoma tumor tissue showed significant increases in the protein and mRNA expression levels of PI3K （t=22.862，7.098，P<0.05） and significant reductions in the protein and mRNA expression levels of PTEN （t=25.634，8.379，P<0.05）. The results of in vitro cell experiments showed that compared with group A， groups B， C， and D had a significantly lower protein expression level of p-AKT （t=8.386-11.900，P<0.05）. CCK-8 assay showed that groups B， C， and D had a significantly lower absorbance value of SK-NEP-1 cells than group A at 48 and 72 h of intervention （t=5.163-8.647，P<0.05）， and at 72 h of intervention， group D had a significantly lower absorbance value of SK-NEP-1 cells than groups B and C （t=3.982，4.021，P<0.05）. Groups B， C， and D had significantly higher early and late apoptosis rates of SK-NEP-1 cells than group A （t=4.673-9.563，P<0.05）， and group D had significantly higher early and late apoptosis rates of SK-NEP-1 cells than groups B and C （t=5.829-8.075，P<0.05）. Compared with group A， groups B， C， and D had a significantly higher proportion of SK-NEP-1 cells in G1 phase （t=7.518-14.747，P<0.05） and a significantly lower proportion of cells in S phase （t=8.029-13.451，P<0.05）， and compared with groups B and C， group D had a significantly higher proportion of SK-NEP-1 cells in G1 phase （t=9.930，9.732，P<0.05） and a significantly lower proportion of cells in S phase （t=10.281，9.927，P<0.05）.

Conclusion?Compared with the targeted regulation of PTEN or PI3K alone， the targeted regulation of PTEN and PI3K can significantly inhibit the growth of nephroblastoma cells and promote cell apoptosis， possibly by inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway and blocking cell cycle.

［KEY WORDS］?Wilms tumor; Cell proliferation; Apoptosis; Cell cycle; PTEN phosphohydrolase; Phosphatidylinositol 3-kinases

腎母細胞瘤又稱維爾姆斯瘤，是臨床常見的兒童腎臟惡性腫瘤，主要采用手術、放化療等綜合方案進行治療，但是少數患兒因對化療藥物不敏感，導致預后效果欠佳［1-3］。靶向基因治療的副作用相對較少，已有靶向治療腎母細胞瘤患兒的成功案例［4］，有望成為腎母細胞瘤一線治療方式。張力蛋白同源物（PTEN）基因是細胞內重要的抑癌基因，可以通過抑制磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶A（AKT）信號通路，影響細胞遷移、增殖以及分化等重要生理過程［5-11］，是當前腫瘤治療的熱門靶點。此前有研究發現，PTEN在腎母細胞瘤組織中表達水平顯著下調［12-13］，并且一些非編碼RNA可以通過對PI3K/AKT信號通路的調控而影響腎母細胞瘤的疾病進展［14］。但目前通過聯合靶向PTEN和PI3K是否能有效抑制腎母細胞瘤的生長仍缺乏直接的研究證據。鑒于此，本研究通過在腎母細胞瘤細胞中過表達PTEN同時敲低PI3K，探討聯合靶向調控腎母細胞瘤細胞中的PTEN及PI3K對腎母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響，以期為該腫瘤靶向藥物的研發提供新方向。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Lipofectamine 2000（美國賽默飛世爾科技公司）；組織總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒以及SYBR green qPCR試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；鼠源抗Flag抗體、PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT（S308）抗體和GAPDH抗體（美國CST公司），兔源抗PTEN抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；HRP偶聯抗小鼠IgG抗體、HRP偶聯抗兔IgG抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司］；CCK-8細胞增殖試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 細胞培養及分組

人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞購買于美國典型菌種保存中心，接種于6孔板中，加入完全培養基（DMEM高糖培養基中加入10%胎牛血清及1%青鏈霉素），置于37 ℃ 含體積分數0.05 CO2的培養箱中傳代培養。待培養至第2代時分為4組，對照組（A組）細胞轉染NC siRNA及Flag空載體，PTEN過表達組（B組）細胞轉染NC siRNA以及Flag-PTEN表達載體，PI3K敲低組（C組）細胞轉染siPI3K及Flag空載體，聯合靶向組（D組）細胞轉染siPI3K及Flag-PTEN。使用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染表達載體及siRNAs，轉染操作依照產品說明書進行。

1.3免疫印跡實驗檢測組織和細胞當中的PI3K、PTEN、Flag、AKT、p-AKT蛋白

收集2019年11月—2022年10月青島大學附屬泰安市中心醫院兒童外科收治的15例腎母細胞瘤患兒手術切除的腫瘤組織及癌旁正常組織，剪碎后加入PBS研磨，離心以后棄上清液，加入1～2 mL組織裂解液以后繼續研磨，待充分裂解后于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，獲得組織總蛋白。取轉染24 h后的A～D組SK-NEP-1細胞置于1 mL Ep管中，加入PBS 500 μL重懸，以2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，然后向其中加入500 μL RIPA細胞裂解液，置于冰上裂解30 min后，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，得到細胞總蛋白。采用BCA法檢測組織和細胞中的總蛋白濃度。從各組組織及細胞中選取30 μg的蛋白樣品進行加熱變性，SDS-PAGE電泳、轉膜并封閉。在裝有PVDF膜的容器中加入一抗及GAPDH抗體，4 ℃下孵育過夜，洗膜后加入對應的二抗， 室溫孵育1 h，最后加入化學發光底物，進行蛋白條帶成像。采用Image J軟件對圖像進行分析，以GAPDH作為內參，蛋白相對表達水平以目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值表示。實驗重復3次，結果取均值。

1.4實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測組織當中PI3K、PTEN mRNA的表達

取15例腎母細胞瘤患兒術后腫瘤組織及癌旁正常組織，采用Trizol法提取組織中總RNA，檢測RNA濃度與純度，引物名稱及其序列見表1。取0.5 μg總RNA，采用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，并以cDNA為模板進行RT-qPCR，每個樣品設置3個復孔，實驗重復3次，以GAPDH為內參，采用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.5 細胞增殖實驗

取轉染24 h后的A～D組SK-NEP-1細胞，待細胞處于對數生長期且生長狀態良好時，加入胰酶消化細胞，然后將消化好的細胞加入1 mL Ep管中，2 000 r/min離心3 min，棄上清液，以DMEM培養基重懸細胞后，接種于96孔板中，每孔2×105個細胞，置于37 ℃培養箱中培養。分別于接種后第24、48 和72小時時取出培養板，加入10 μL CCK-8反應液，于37 ℃下孵育4 h，采用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度值。實驗設置3個復孔，結果取均值。

1.6 細胞凋亡實驗

取轉染24 h后的A～D組SK-NEP-1細胞，棄去原培養基，用1 mL磷酸鹽緩沖液漂洗細胞1次，于37 ℃下用胰酶消化90 s，重懸細胞，收集至15 mL離心管中，4 ℃下1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細胞，加入5 μL FITC-Annexin V溶液及1 μL PI溶液，室溫避光染色15 min，使用流式細胞儀分析FITC和PI標記比例。采用FCSalyzer軟件分析流式細胞儀的數據，得到Q1～Q4四個象限，其中Q3象限為早期凋亡率，Q2象限為晚期凋亡率。實驗重復3次，結果取均值。

1.7 細胞周期檢測

取轉染24 h后的A～D組SK-NEP-1細胞，待細胞處于對數生長期且生長狀態良好時，加入胰酶消化細胞，然后將消化好的細胞加入1mL Ep管中， 2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，以500 μL磷酸鹽緩沖液漂洗細胞1次，2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，以體積分數0.70的乙醇（已于-20 ℃預冷）重懸細胞后，置于-20 ℃固定1 h。取出后再以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液漂洗2次后，棄上清液，加入500 μL磷酸鹽緩沖液重懸，加入1 μL PI溶液，避光染色5 min以后，使用流式細胞儀分析PI通道脈沖積分信號，并用Flowjo軟件Dean-Jett-Fox擬合模型計算S期細胞比例、G2/M期細胞比例及G1期細胞比例。實驗重復3次，結果取均值。

1.8 統計分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計分析，計量資料以 ±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。多組多時間點比較采用重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 ?果

2.1腎母細胞瘤患兒腫瘤組織和癌旁正常組織中PI3K、PTEN蛋白和mRNA表達水平

與癌旁正常組織相比，腎母細胞瘤腫瘤組織中PI3K蛋白及mRNA表達水平均顯著性升高（t=22.862、7.098，P<0.05），PTEN蛋白及mRNA表達水平均顯著降低（t=25.634、8.379，P<0.05），詳見表2。

2.2各組SK-NEP-1細胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平

免疫印跡實驗結果顯示，A～D組SK-NEP-1細胞中PI3K、p-AKT蛋白水平比較差異有顯著性（F=6.388、5.831，P<0.05），AKT蛋白水平比較差異無顯著性（P＞0.05）。與A組相比，B、C、D組中PI3K和p-AKT蛋白水平均明顯降低（t=5.677～11.900，P<0.05），與B、C組相比，D組PI3K和p-AKT蛋白水平明顯降低（t=3.786～4.321，P<0.05）。見表3。

2.3各組SK-NEP-1細胞中細胞增殖情況比較

重復測量設計的方差分析顯示，時間、組別及時間與組別交互作用均對SK-NEP-1細胞吸光度值有顯著影響

（F時間=464.912，F組別=25.201，F組別*時間=11.570，P<0.05）。單獨效應分析結果顯示，與第24小時相比，A～D組SK-NEP-1細胞吸光度值在干預的第48、72小時時均明顯升高（F=83.021～195.72）；干預第24小時時，A～D組吸光度值差異無顯著性（P＞0.05）；干預第48小時時，與A組相比，B、C、D組吸光度值均顯著降低（F=4.067，t=5.452～7.821，P<0.05）；干預第72小時時，與A組相比，B、C、D組吸光度值均顯著降低（F=29.003，t=5.163～8.647，P<0.05），與B、C組相比，D組吸光度值均顯著降低（t=3.982、4.021，P<0.05）。詳見表4。

2.4各組SK-NEP-1細胞凋亡情況比較

A～D組的SK-NEP-1細胞早期凋亡率分別為（1.76±0.21）%、（3.16±0.44）%、（3.02±0.27）%、（4.60±0.38）%，其晚期凋亡率分別為（1.38±0.18）%、（2.85±0.23）%、（2.77±0.20）%、（4.42±0.35）%。四組之間細胞早期凋亡率、晚期凋亡率比較差異有顯著性（F=11.665、8.854，P<0.05）。與A組相比，B、C、D組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯升高（t=4.673～9.563，P<0.05）；與B組、C組相比，D組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯升高（t=5.829～8.075，P<0.05）。

2.5各組SK-NEP-1細胞的細胞周期比較

細胞周期檢測結果顯示，A～D組SK-NEP-1細胞G1期細胞比例、S期細胞比例比較差異有顯著性（F=10.921、12.661，P<0.05），G2/M期細胞比例比較差異無顯著性（P＞0.05）。與A組相比，B、C、D組G1期細胞比例明顯升高（t=7.518～14.747， P<0.05），S期細胞比例明顯降低（t=8.029～13.451，P<0.05）；與B、C組相比，D組G1期細胞比例明顯升高（t=9.930、9.732，P<0.05），S期細胞比例明顯降低（t=10.281、9.927，P<0.05）。見表5。

3 討 ?論

目前，腎母細胞瘤確診后的治療仍以常規外科手術及術后放療和化療為主，盡管這些常規治療方案可以一定程度上提高患者的生存率，但手術創傷及化療藥物的不良反應會給患兒帶來極大痛苦［15］。由于腎母細胞瘤缺乏有效的早期診斷標記物，因此，探究腎母細胞瘤的早期診斷方式，尋找新的靶向干預策略成為當前該疾病研究的熱門方向。PTEN是重要的抑癌基因，許多泌尿系統腫瘤如前列腺癌、膀胱癌等的發生都伴隨PTEN基因的缺失或低表達，而PTEN低表達與腫瘤發生及不良預后均密切相關［5-10］。GRILL等［12］研究發現，與癌旁正常組織相比，腎母細胞瘤組織中PTEN表達及活性下降。CUI等［13］研究也發現低表達PTEN的腎母細胞瘤惡性程度更低，這些結果提示PTEN在腎母細胞瘤發生中應該發揮著比較重要的作用，因此通過過表達載體靶向上調PTEN的表達水平，對于PTEN低表達的腎母細胞瘤患者的治療可能有益。

PI3K/AKT信號通路是經典的被PTEN抑制的下游信號通路，PTEN低表達可能會引起PI3K、AKT的活性升高，進而促進細胞增殖、遷移［16-19］。PI3K由一個調節亞基（p85）以及一個催化亞基（p110）構成。胞外信號作用于受體酪氨酸激酶，進一步催化PI3K調節亞基磷酸化，激活的PI3K將細胞質膜上的PIP2轉變成為PIP3，PIP3進一步與AKT及磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶1（PDK1）的PH結構域結合，促使PDK磷酸化AKT。活化的AKT可進一步促進下游諸多信號分子如mTOR、p27、GSK3等蛋白的磷酸化，影響下游蛋白的生理活動［20-22］。PTEN可以將PIP2轉變成為PIP3，進而抑制PDK1對AKT的磷酸化［23］。因此，在細胞當中過表達PTEN或敲低PI3K都可以實現對PI3K/AKT信號通路的抑制作用。PI3K/AKT信號通路的激活可以使mTOR和GSK-3β等關鍵蛋白磷酸化，磷酸化的GSK-3β激酶活性受到抑制，進而促進β-catenin的激活并增強細胞周期關鍵蛋白如Cyclin D1的轉錄，促進細胞G1/S期轉化及細胞增殖，抑制細胞凋亡［24-25］。然而PI3K/AKT信號通路在腎母細胞瘤中的作用仍缺少研究，在過表達PTEN的同時抑制PI3K是否更能有效抑制腎母細胞瘤的增殖活性，尚待進一步研究。

為了驗證PTEN及PI3K是否在腎母細胞瘤組織中異常表達，本研究使用蛋白質免疫印跡實驗及RT-qPCR實驗對15例腎母細胞瘤患兒的腫瘤組織及癌旁正常組織中的PI3K、PTEN蛋白及mRNA表達水平進行了檢測，結果顯示，與癌旁正常組織相比，腎母細胞瘤腫瘤組織中PI3K蛋白及mRNA表達水平均顯著升高，PTEN蛋白及mRNA表達水平均顯著降低。該結果提示腎母細胞瘤腫瘤的發生可能與PI3K和PTEN表達異常有關。為了進一步研究PI3K和PTEN在腎母細胞瘤腫瘤發生發展中的作用，本研究又通過細胞轉染技術在腎母細胞瘤細胞中過表達PTEN以及敲低PI3K，觀察PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達水平的變化，結果顯示腎母細胞瘤細胞中過表達PTEN或敲低PI3K都抑制了p-AKT，但并不影響AKT蛋白的表達，且過表達PTEN并同時敲低PI3K的細胞中，p-AKT表達水平最低，這說明聯合靶向調控PTEN和PI3K能增強p-AKT表達下調，抑制PI3K/AKT信號通路。

隨后本研究對各組腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡及細胞周期等情況進行了分析，結果顯示，腎母細胞瘤細胞通過表達PTEN或敲低PI3K都可抑制細胞增殖，提高細胞早期凋亡率、晚期凋亡率，提高細胞周期中G1期細胞比例，降低細胞周期中S期細胞比例；另外本研究又對細胞進行了過表達PTEN的同時敲低PI3K的處理，發現相比單一靶向PTEN或PI3K，聯合靶向的細胞吸光度值、S期細胞比例顯著下降，早期凋亡率、晚期凋亡率、G1期細胞比例顯著升高。細胞增殖實驗中的吸光度值可反映細胞增殖活性，吸光度值越高代表增殖活性越強，所以該結果提示，聯合靶向調控PTEN和PI3K能增強抑制腎母細胞瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，阻斷細胞周期。聯合靶向調控PTEN和PI3K的細胞被阻斷在有絲分裂G1期，細胞周期的阻斷會減慢細胞的增殖，細胞無法通過細胞周期檢驗點則會激活細胞凋亡相關信號通路，進而引起細胞凋亡。

綜上所述，本研究初步揭示了靶向PTEN以及PI3K影響腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡的作用及其機制。相較于單一靶向PTEN或PI3K，聯合靶向調控PTEN和PI3K可更顯著抑制腎母細胞瘤細胞生長，促進腎母細胞瘤細胞凋亡，其作用機制可能與其抑制PI3K/AKT信號通路、阻斷細胞周期有關。后續的研究可以嘗試開發靶向調控PTEN和PI3K的病毒載體，為PTEN低表達的腎母細胞瘤患者的基因治療提供實驗數據參考。

倫理批準和知情同意： 本研究涉及的所有試驗均已通過泰安市中心醫院醫學倫理委員會的審核批準，文件號為（2019）倫審第（18）號。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明： 耿耿、李慶浩參與了研究設計；耿耿、鹿洪亭、明明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻］

［1］GROENENDIJK A， SPREAFICO F， DE KRIJGER R R， et al. Prognostic factors for wilms tumor recurrence： A review of the literature［J］. Cancers， 2021，13（13）：3142.

［2］ ZHAO Y X， CHENG H Y， SONG H C， et al. Duplex kidney complicated with preoperative inferior nephroblastoma rupture in children： A case report and literature review［J］. BMC Pe-

diatr， 2021，21（1）：441.

［3］ NELSON M V， VAN DEN HEUVEL-EIBRINK M M， GRAF N， et al. New approaches to risk stratification for Wilms tumor［J］. Curr Opin Pediatr， 2021，33（1）：40-48.

［4］ WANG J J， FAN S Q， FENG Y Q， et al. Antiangiogenic therapy for Wilms tumor in an adult and literature review［J］. Anticancer Drugs， 2019，30（6）：640-645.

［5］ ZHU J M， LIU B， WANG Z Y， et al. Exosomes from nicotine-stimulated macrophages accelerate atherosclerosis through miR-21-3p/PTEN-mediated VSMC migration and proliferation［J］. Theranostics， 2019，9（23）：6901-6919.

［6］ HOPKINS B D， HODAKOSKI C， BARROWS D， et al. PTEN function： The long and the short of it［J］. Trends Biochem Sci， 2014，39（4）：183-190.

［7］ LEE Y R， CHEN M， PANDOLFI P P. The functions and re-

gulation of the PTEN tumour suppressor： New modes and prospects［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2018，19（9）：547-562.

［8］ SKELTON P D， STAN R V， LUIKART B W. The role of PTEN in neurodevelopment［J］. Mol Neuropsychiatry， 2020，5（Suppl 1）：60-71.

［9］ MANOGARAN P， BEERAKA N M， PAULRAJ R S， et al. Impediment of cancer by dietary plant-derived alkaloids through oxidative stress： Implications of PI3K/AKT pathway in apoptosis， autophagy， and ferroptosis［J］. Curr Top Med Chem， 2023，23（10）：860-877.

［10］ HARA S， OYA M， MIZUNO R， et al. Akt activation in renal cell carcinoma： Contribution of a decreased PTEN expression and the induction of apoptosis by an Akt inhibitor［J］. Ann Oncol， 2005，16（6）：928-933.

［11］ ZHANG J H， YANG W M， ZHOU S W. Expression and significance of PTEN in bladder TransitionalCell carcinoma［J］. Chin Ger J Clin Oncol， 2005，4（4）：218-220.

［12］ GRILL C， GUELLY C， EBNER B， et al. Loss of PTEN/MMAC1 activity is a rare and late event in the pathogenesis of nephroblastomas［J］. Hum Pathol， 2010，41（8）：1172-1177.

［13］ CUI M Y， LIU W， ZHANG L J， et al. Over-expression of miR-21 and lower PTEN levels in wilms tumor with aggressive behavior［J］. Tohoku J Exp Med， 2017，242（1）：43-52.

［14］ DE S PEREIRA B M， MONTALVO DE AZEVEDO R， DA SILVA GUERRA J V， et al. Non-coding RNAs in Wilms tumor： Biological function， mechanism， and clinical implications［J］. J Mol Med， 2021，99（8）：1043-1055.

［15］ NJUGUNA F， MARTIJN H A， KUREMU R T， et al. Wilms tumor treatment outcomes： Perspectives from a low-income setting［J］. J Glob Oncol， 2017，3（5）：555-562.

［16］ XU Z R， HAN X， OU D M， et al. Targeting PI3K/AKT/mTOR-mediated autophagy for tumor therapy［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2020，104（2）：575-587.

［17］ NEPSTAD I， HATFIELD K J， GRNNINGSTER I S， et al. The PI3K-akt-mTOR signaling pathway in human acute myeloid leukemia （AML） cells［J］. Int J Mol Sci， 2020，21（8）：2907.

［18］ LIU R， CHEN Y W， LIU G Z， et al. PI3K/AKT pathway as a key link modulates the multidrug resistance of cancers［J］. Cell Death Dis， 2020，11（9）：797.

［19］ DUAN Y， HAYBAECK J， YANG Z H. Therapeutic potential of PI3K/AKT/mTOR pathway in gastrointestinal stromal tumors： Rationale and progress［J］. Cancers， 2020，12（10）：2972.

［20］ WANG L， WANG J， CHEN L. TIMP1 represses sorafenib-triggered ferroptosis in colorectal cancer cells by activating the PI3K/Akt signaling pathway［J］. Immunopharmacol Immunotoxicol， 2023，45（4）：419-425.

［21］ 熊艷，陳雨柔，王藝，等. PLOD2通過PI3K/AKT通路促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移［J］. 武漢大學學報（醫學版）， 2023，9（3）：304-309.

［22］ 葉雅麗，阮榮華，蔡莎莎，等. UBE2Q1靶向PI3K/AKT通路對胃癌細胞凋亡、增殖的影響［J］. 中國衛生檢驗雜志， 2022，32（9）：1080-1083.

［23］ XIANG H G， ZHANG J F， LIN C C， et al. Targeting autop-

hagy-related protein kinases for potential therapeutic purpose［J］. Acta Pharm Sin B， 2020，10（4）：569-581.

［24］ SATI I S E E， PARHAR I. MicroRNAs regulate cell cycle and cell death pathways in glioblastoma［J］. Int J Mol Sci， 2021，22（24）：13550.

［25］ KUMAR N， MANDAL C C. Cholesterol-lowering drugs on Akt signaling for prevention of tumorigenesis［J］. Front Ge-net， 2021，12：724149.

（本文編輯 耿波 厲建強）