tNGS 技術(shù)在基層醫(yī)院感染早期精準(zhǔn)診斷中的重要性

方 超

（江油市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 江油 621700）

感染性疾病的發(fā)病率、死亡率均較高，直接威脅了人類(lèi)的健康。目前針對(duì)感染性疾病管理策略的關(guān)鍵為進(jìn)行病原體檢測(cè)，當(dāng)前多種傳統(tǒng)診斷技術(shù)可應(yīng)用于病原學(xué)診斷中。靶向基因測(cè)序（tNGS）技術(shù)在臨床病原學(xué)應(yīng)用中，通過(guò)進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、肺部感染的病原體檢測(cè)，為常見(jiàn)致病菌的診斷提供了一定可能。tNGS 是主要基于高通量測(cè)序（NGS）的靶向富集測(cè)序技術(shù)，tNGS 作為一種關(guān)鍵技術(shù)，主要通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因組區(qū)域（ROI）進(jìn)行富集，來(lái)確保ROI 區(qū)域足夠的深度、覆蓋度，并進(jìn)行目標(biāo)病原體的識(shí)別。傳統(tǒng)方法整體檢測(cè)通量有限，通過(guò)對(duì)tNGS 技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用，整體效果較好。

1 資料與方法

選取宏基因組下一代測(cè)序（mNGS） 檢測(cè)的肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，做好實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果、臨床癥狀以及影像學(xué)檢查結(jié)果分析，并做好病理結(jié)果以及治療結(jié)果的對(duì)比分析。選取40 例惠普爾養(yǎng)障體陽(yáng)性樣本，做好分析。11 例患者進(jìn)行手術(shù)治療，2 例患者進(jìn)行經(jīng)支氣管鏡肺組織活檢術(shù)（TBLB），3 例患者進(jìn)行經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)。

2 結(jié)果

11 例患者進(jìn)行了手術(shù)治療，2 例患者進(jìn)行了TBLB，3 例患者進(jìn)行了經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)。10 例患者的組織病理學(xué)診斷結(jié)果為腫瘤；2 例患者的組織病理可見(jiàn)多核巨細(xì)胞，考慮為結(jié)核的可能性大；1 例患者的組織病理學(xué)行PAS及六胺銀染色呈陽(yáng)性，考慮為隱球菌感染。根據(jù)組織病理學(xué)檢查結(jié)果，所有患者均未出現(xiàn)醫(yī)院死亡。

3 討論

基層醫(yī)院是守護(hù)人們健康的第一道防線，承擔(dān)著許多重要的醫(yī)療任務(wù)。然而，由于基層醫(yī)院醫(yī)療資源有限、醫(yī)療水平參差不齊，所以基層醫(yī)院感染的診斷和治療面臨著一定挑戰(zhàn)。感染性疾病的早期診斷對(duì)于及時(shí)采取有效治療至關(guān)重要，但傳統(tǒng)的感染診斷方法在準(zhǔn)確性和靈敏度上存在局限性，容易導(dǎo)致漏診或誤診。基層醫(yī)院醫(yī)療水平和設(shè)備設(shè)施相對(duì)落后，缺乏先進(jìn)的診斷技術(shù)支持，限制了感染診斷的精準(zhǔn)性和及時(shí)性。同時(shí),由于基層醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員的專(zhuān)業(yè)水平參差不齊，感染診斷能力高低不平，加大了診斷難度。另外，傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法往往需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能得出結(jié)果，這在感染的早期診斷中顯得尤為不足。因此，迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、高通量的診斷技術(shù)來(lái)幫助基層醫(yī)院提高感染早期診斷的準(zhǔn)確性和效率。tNGS 技術(shù)的出現(xiàn)為這一問(wèn)題提供了解決方案，其具有對(duì)多種病原體同時(shí)檢測(cè)、快速診斷、高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，可幫助基層醫(yī)院及時(shí)鑒別感染病原體，指導(dǎo)臨床治療，降低感染對(duì)患者的危害。

tNGS 靶向富集策略中，雜交捕獲靶向測(cè)序利用探針富集目標(biāo)片段，在進(jìn)行液相雜交捕獲測(cè)序、堿基互補(bǔ)配對(duì)的同時(shí)，對(duì)DNA 文庫(kù)進(jìn)行雜交富集，從而進(jìn)行測(cè)序[1]。雜交捕獲測(cè)序一般是針對(duì)目標(biāo)病原體、探針和精細(xì)化數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。在建立多重PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)獲得測(cè)序技術(shù)。一般適用于檢測(cè)幾十、幾千個(gè)位點(diǎn)，整體適用研究目標(biāo)區(qū)域較小。對(duì)于較低模板的DNA，一般能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的擴(kuò)增子，在明顯提升效率、節(jié)約時(shí)間的同時(shí)降低成本[2]。

tNGS 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：第一，富集增加目標(biāo)微生物檢測(cè)覆蓋，能夠提升可信度。tNGS 通過(guò)靶向富集目標(biāo)序列，能夠提升對(duì)于微生物檢測(cè)的比例。tNGS 的靶向富集，在不去除宿主、提升檢測(cè)可信度的條件下，能夠提升微生物的對(duì)應(yīng)序列數(shù)。第二，tNGS 能夠提升耐藥以及毒力基因檢測(cè)，可鑒別病原感染樣本中是否存在耐藥型別。目前主要難點(diǎn)為將耐藥基因、致病病原相結(jié)合，對(duì)于耐藥基因的復(fù)雜性需要進(jìn)行致病菌的解讀。通過(guò)研究結(jié)核菌耐藥性基因改變的情況，可以得到精確的突變位點(diǎn)。tNGS 針對(duì)耐藥、毒力基因進(jìn)行區(qū)域富集，以此來(lái)確保穩(wěn)定地檢出。第三，tNGS檢測(cè)因目標(biāo)病原體范圍較為明確，在簡(jiǎn)化解讀流程的同時(shí)，還能使tNGS 數(shù)據(jù)庫(kù)聚焦多種病原體，并進(jìn)行不同亞型的區(qū)分。tNGS 檢測(cè)作為依據(jù)已知病原設(shè)計(jì)的檢測(cè)，目前來(lái)說(shuō)，其效果良好。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌作為革蘭陽(yáng)性菌、兼性厭氧細(xì)菌，是常見(jiàn)的食源性致病菌。該病菌被攝入后會(huì)導(dǎo)致人、畜感染。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌感染主要是受細(xì)菌菌株、宿主等免疫狀態(tài)的影響。盡管此種細(xì)菌引起的感染較為罕見(jiàn)，但感染后的癥狀比較嚴(yán)重。通過(guò)抗生素的應(yīng)用，依照標(biāo)準(zhǔn)程序收集腦脊液，隨后進(jìn)行儲(chǔ)存。研究表明，急性/亞急性腦膜炎在經(jīng)磁共振、血培養(yǎng)提示中，腦脊液一般為陰性。通過(guò)對(duì)腦脊液進(jìn)行鑒定、測(cè)序，其符合李斯特菌的讀數(shù)，同時(shí)成像雙相病程[3]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌感染的前驅(qū)癥狀主要表現(xiàn)為頭痛、惡心以及嘔吐，隨后可發(fā)展成為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)呼吸衰竭，因此進(jìn)行適當(dāng)診斷、抗生素治療尤為重要。有研究通過(guò)明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病微生物，使用生化、細(xì)胞學(xué)以及革蘭染色等檢測(cè)方法，在測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序的同時(shí)，擴(kuò)增后使用基因分析儀進(jìn)行測(cè)序分析，采用tNGS 共檢測(cè)到核酸序列數(shù)為57-2611 條，平均為60.21%。tNGS 在李斯特菌檢測(cè)中具有一定優(yōu)勢(shì)，同時(shí)能夠識(shí)別出細(xì)菌病原體。當(dāng)前遺傳性原發(fā)性免疫缺陷患者死亡的主要原因?yàn)椴《拘愿窝祝褂胻NGS 進(jìn)行深度測(cè)序分析，在獲得完整基因組的同時(shí)，顯示出高水平同源性，具有病原譜范圍明確、檢測(cè)精度高的優(yōu)勢(shì)。目前tNGS 在疾病診斷中可用性不斷增加[4]。tNGS 技術(shù)的應(yīng)用，可有效縮短診斷時(shí)間，提高病原菌的檢出率。通過(guò)對(duì)患者腦脊液樣本進(jìn)行tNGS 檢測(cè)，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的DNA 序列信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體種類(lèi)和數(shù)量的全面分析。與傳統(tǒng)方法相比，tNGS 技術(shù)不受病原體培養(yǎng)的限制，可以檢測(cè)到一些難以培養(yǎng)或未知的真菌種類(lèi)，為醫(yī)生提供更全面的診斷依據(jù)。

受到人員、環(huán)境、患者等多重因素的影響，重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）是極易出現(xiàn)感染的場(chǎng)所之一，如在對(duì)患者進(jìn)行操作時(shí)，操作不規(guī)范；未嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行無(wú)菌操作；患者病情相對(duì)危重，侵入性傷口較多；患者在轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室時(shí)已伴有明顯的肺部感染。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，感染作為影響重癥病房患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，出現(xiàn)率相對(duì)較高，在延長(zhǎng)患者住院時(shí)間的同時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量、生命安全受到影響。ICU 集中了不同病種、不同程度的感染，感染菌株常為多重耐藥菌株，是引起多系統(tǒng)器官衰竭及導(dǎo)致死亡的重要因素，因此在治療過(guò)程中，減少不良事件發(fā)生的同時(shí)，提高感染早期診斷的準(zhǔn)確性和效率同樣重要。

面對(duì)頻發(fā)的新發(fā)傳染性疾病，以及逐年上升的微生物耐藥率等問(wèn)題，快速、精準(zhǔn)的病原診斷及其耐藥性評(píng)估尤為重要。tNGS 技術(shù)兼顧PCR 技術(shù)的靈敏性、時(shí)效性、特異性以及NGS 技術(shù)高通量的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了一次檢測(cè)僅需12 小時(shí)，可同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種至數(shù)百種的病原及其相關(guān)的耐藥基因和毒力基因。此外，它還可以實(shí)現(xiàn)DNA和RNA 共檢測(cè)，且病原可細(xì)分至亞種或亞型，能夠快速、客觀地檢測(cè)臨床標(biāo)本中不同類(lèi)型的病原微生物，為病原學(xué)診斷提供了新的臨床選擇。

2021 年初，金域醫(yī)學(xué)聯(lián)合開(kāi)發(fā)的tNGS 檢測(cè)項(xiàng)目正式為臨床提供檢測(cè)服務(wù)。同時(shí)，作為tNGS 病原檢測(cè)技術(shù)的領(lǐng)航者，金域醫(yī)學(xué)與金圻睿生物科技有限責(zé)任公司針對(duì)不同感染癥候群、不同標(biāo)本類(lèi)型開(kāi)發(fā)了多種檢測(cè)產(chǎn)品，并為滿足不同地區(qū)的檢測(cè)時(shí)效性，在國(guó)內(nèi)19 個(gè)省市區(qū)實(shí)現(xiàn)了本地化檢測(cè)，搭建起全國(guó)規(guī)模較大的tNGS 感染檢測(cè)中心。2022 年10 月，為保證多重呼吸道病原體核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使其得到更好應(yīng)用，上海市臨床檢驗(yàn)中心開(kāi)展多重呼吸道病原體核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，金域醫(yī)學(xué)基于tNGS 技術(shù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)的“呼吸道病原體靶向檢測(cè)153 項(xiàng)”和“呼吸道病原體靶向檢測(cè)95 項(xiàng)”檢測(cè)項(xiàng)目被納入其中。2023 年初，上海市臨床檢驗(yàn)中心公布的2022 年調(diào)查計(jì)劃《多重呼吸道病原體核酸檢測(cè)》總體樣本結(jié)果，金域醫(yī)學(xué)（603882）滿分通過(guò)。這是國(guó)內(nèi)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)首次對(duì)tNGS 病原體檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，證實(shí)加強(qiáng)病原體檢測(cè)技術(shù)的研究和應(yīng)用，對(duì)于感染性疾病的臨床診治具有重要的指導(dǎo)意義。

作為現(xiàn)階段常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)感染性疾病，肺部感染發(fā)病率較高，如果治療不及時(shí)將會(huì)出現(xiàn)呼吸衰竭，整體預(yù)后較差。在肺部感染的診斷中，細(xì)菌是常見(jiàn)的致病因子之一。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間和較復(fù)雜的操作流程，限制了在基層醫(yī)院進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的診斷，而利用tNGS 技術(shù)可以在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)樣本中的細(xì)菌進(jìn)行高通量、高靈敏度的檢測(cè)。tNGS 技術(shù)可以檢測(cè)到包括少量細(xì)菌在內(nèi)的所有細(xì)菌種類(lèi)，大大提高了感染早期診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。在真菌檢出方面，tNGS 技術(shù)能夠幫助醫(yī)生更快速、更準(zhǔn)確地確定感染的真菌種類(lèi)，為合理的抗真菌治療提供重要依據(jù)。傳統(tǒng)的真菌檢出方法往往需要培養(yǎng)和鑒定，耗時(shí)且有一定限制，而tNGS 技術(shù)可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得更全面的真菌信息，有助于及時(shí)有效地制定個(gè)體化的治療方案。基于這些優(yōu)勢(shì)，tNGS技術(shù)在肺部感染細(xì)菌檢出中的應(yīng)用前景十分廣闊，有望成為基層醫(yī)院感染診斷的重要工具。有研究報(bào)告指出，侵襲性肺曲霉菌病（IPA）的感染性強(qiáng)、病死率高，診斷較為困難，患者進(jìn)行常規(guī)抗感染治療效果不佳。在對(duì)患者進(jìn)行支氣管灌洗的同時(shí)，使用tNGS 對(duì)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試，在收到樣品后，tNGS 能夠檢測(cè)到煙曲霉的序列度數(shù)。研究中3 例患者給予伏立康唑抗真菌進(jìn)行治療，經(jīng)胸部CT 進(jìn)行復(fù)查，病灶吸收明顯。IPA 目前發(fā)于血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，同時(shí)也是致命的真菌感染。因此早期進(jìn)行肺曲霉菌的診斷具有一定的價(jià)值。tNGS 作為診斷免疫缺陷、功能受損的前景方法，pendleton 等通過(guò)使用基因組學(xué)進(jìn)行呼吸道病原體的檢測(cè)，報(bào)告顯示對(duì)于相關(guān)間質(zhì)性肺炎的患者，使用宏基因組測(cè)序能夠進(jìn)行金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。tNGS 在診斷肺炎病原體方面效果顯著[5]。

結(jié)核分枝桿菌作為肺部感染病原體的一個(gè)重要部分，結(jié)核病是肺部感染病原體授予的重要部分。肺結(jié)核是一種嚴(yán)重的傳染病，早期診斷和治療對(duì)于患者的生存和康復(fù)至關(guān)重要。傳統(tǒng)的結(jié)核菌培養(yǎng)和PCR 技術(shù)存在診斷時(shí)間長(zhǎng)、假陽(yáng)性率高等問(wèn)題，而tNGS 技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)出多種病原體，提高了對(duì)結(jié)核感染的檢出率和準(zhǔn)確性。因此，基層醫(yī)院在感染早期診斷中應(yīng)用tNGS 技術(shù)，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染，采取有效的治療措施，減少感染的傳播和疾病的惡化。一項(xiàng)回顧性研究表明，心臟手術(shù)期間暴露在污染加熱器冷卻裝置中的患者易受分枝桿菌嵌合體（M.chimaera）的感染，抗酸桿菌培養(yǎng)的診斷金標(biāo)準(zhǔn)通常需要侵入性取樣。研究人員使用NGS 方法檢測(cè)了10 名接受心臟手術(shù)患者的血漿，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行抗酸桿菌培養(yǎng)[6]。接受血漿NGS 檢測(cè)的10 名患者中，9 人患有侵襲性疾病，檢查所需中位時(shí)間為4 d。在這些患者中，7 人首次獲得了M.chimaera 感染的病原學(xué)確認(rèn)。抗酸桿菌培養(yǎng)呈陽(yáng)性所需中位時(shí)間為20 d，確認(rèn)M.chimaera 的中位時(shí)間為41 d，在該序列獲得的24 種抗酸桿菌血培養(yǎng)物中，只有4 種（17%）呈陽(yáng)性。在這些患者中，90%接受了侵入性手術(shù)，只有5 名患者（50%）表現(xiàn)出分枝桿菌的增長(zhǎng)。潛伏期和非特異性癥狀使感染M.chimaera的患者無(wú)法被輕易識(shí)別。因此，等離子NGS 可以比抗酸桿菌培養(yǎng)物更快，更準(zhǔn)確地檢測(cè)奇異菌，這是一種有價(jià)值的新型診斷工具。同時(shí)，結(jié)核病耐藥性是世界上最大的健康問(wèn)題之一[7]。遺傳敏感結(jié)核菌株和耐藥菌株分析表明，tNGS 通過(guò)估計(jì)的積極和消極預(yù)測(cè)值，檢測(cè)出了菌株抗性。研究人員從哈利姆大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的臨床樣品中收集了36 株結(jié)核菌株，通過(guò)核酸提取、PCR 和基因測(cè)序、生物特征分析、估計(jì)預(yù)測(cè)值和統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果，與耐藥性相關(guān)的突變有24 個(gè)，其中基因型和表型對(duì)二丙酰胺、利福平、乙胺丁醇一貫敏感，對(duì)鏈霉素和氨基霉素的反應(yīng)較差。

綜上，tNGS 在臨床檢驗(yàn)中越來(lái)越受關(guān)注，正被廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)感染、血流感染等臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域。早期進(jìn)行tNGS 檢測(cè)，能夠有效提升診斷準(zhǔn)確性，整體效果良好。