tNGS 技術在基層醫院感染早期精準診斷中的重要性

方 超

（江油市人民醫院呼吸內科，四川 江油 621700）

感染性疾病的發病率、死亡率均較高，直接威脅了人類的健康。目前針對感染性疾病管理策略的關鍵為進行病原體檢測，當前多種傳統診斷技術可應用于病原學診斷中。靶向基因測序（tNGS）技術在臨床病原學應用中，通過進行中樞神經系統感染、肺部感染的病原體檢測，為常見致病菌的診斷提供了一定可能。tNGS 是主要基于高通量測序（NGS）的靶向富集測序技術，tNGS 作為一種關鍵技術，主要通過對目標基因組區域（ROI）進行富集，來確保ROI 區域足夠的深度、覆蓋度，并進行目標病原體的識別。傳統方法整體檢測通量有限，通過對tNGS 技術進行應用，整體效果較好。

1 資料與方法

選取宏基因組下一代測序（mNGS） 檢測的肺泡灌洗液標本的檢測結果，做好實驗室檢測結果、臨床癥狀以及影像學檢查結果分析，并做好病理結果以及治療結果的對比分析。選取40 例惠普爾養障體陽性樣本，做好分析。11 例患者進行手術治療，2 例患者進行經支氣管鏡肺組織活檢術（TBLB），3 例患者進行經皮肺穿刺活檢術。

2 結果

11 例患者進行了手術治療，2 例患者進行了TBLB，3 例患者進行了經皮肺穿刺活檢術。10 例患者的組織病理學診斷結果為腫瘤；2 例患者的組織病理可見多核巨細胞，考慮為結核的可能性大；1 例患者的組織病理學行PAS及六胺銀染色呈陽性，考慮為隱球菌感染。根據組織病理學檢查結果，所有患者均未出現醫院死亡。

3 討論

基層醫院是守護人們健康的第一道防線，承擔著許多重要的醫療任務。然而，由于基層醫院醫療資源有限、醫療水平參差不齊，所以基層醫院感染的診斷和治療面臨著一定挑戰。感染性疾病的早期診斷對于及時采取有效治療至關重要，但傳統的感染診斷方法在準確性和靈敏度上存在局限性，容易導致漏診或誤診?；鶎俞t院醫療水平和設備設施相對落后，缺乏先進的診斷技術支持，限制了感染診斷的精準性和及時性。同時,由于基層醫院醫護人員的專業水平參差不齊，感染診斷能力高低不平，加大了診斷難度。另外，傳統的病原學檢測方法往往需要較長的時間才能得出結果，這在感染的早期診斷中顯得尤為不足。因此，迫切需要一種快速、準確、高通量的診斷技術來幫助基層醫院提高感染早期診斷的準確性和效率。tNGS 技術的出現為這一問題提供了解決方案，其具有對多種病原體同時檢測、快速診斷、高靈敏度和高特異性的優點，可幫助基層醫院及時鑒別感染病原體，指導臨床治療，降低感染對患者的危害。

tNGS 靶向富集策略中，雜交捕獲靶向測序利用探針富集目標片段，在進行液相雜交捕獲測序、堿基互補配對的同時，對DNA 文庫進行雜交富集，從而進行測序[1]。雜交捕獲測序一般是針對目標病原體、探針和精細化數據庫的構建。在建立多重PCR 引物進行擴增的同時獲得測序技術。一般適用于檢測幾十、幾千個位點，整體適用研究目標區域較小。對于較低模板的DNA，一般能夠產生足夠數量的擴增子，在明顯提升效率、節約時間的同時降低成本[2]。

tNGS 的技術優勢：第一，富集增加目標微生物檢測覆蓋，能夠提升可信度。tNGS 通過靶向富集目標序列，能夠提升對于微生物檢測的比例。tNGS 的靶向富集，在不去除宿主、提升檢測可信度的條件下，能夠提升微生物的對應序列數。第二，tNGS 能夠提升耐藥以及毒力基因檢測，可鑒別病原感染樣本中是否存在耐藥型別。目前主要難點為將耐藥基因、致病病原相結合，對于耐藥基因的復雜性需要進行致病菌的解讀。通過研究結核菌耐藥性基因改變的情況，可以得到精確的突變位點。tNGS 針對耐藥、毒力基因進行區域富集，以此來確保穩定地檢出。第三，tNGS檢測因目標病原體范圍較為明確，在簡化解讀流程的同時，還能使tNGS 數據庫聚焦多種病原體，并進行不同亞型的區分。tNGS 檢測作為依據已知病原設計的檢測，目前來說，其效果良好。

單核細胞增生李斯特氏菌作為革蘭陽性菌、兼性厭氧細菌，是常見的食源性致病菌。該病菌被攝入后會導致人、畜感染。單核細胞增生李斯特氏菌感染主要是受細菌菌株、宿主等免疫狀態的影響。盡管此種細菌引起的感染較為罕見，但感染后的癥狀比較嚴重。通過抗生素的應用，依照標準程序收集腦脊液，隨后進行儲存。研究表明，急性/亞急性腦膜炎在經磁共振、血培養提示中，腦脊液一般為陰性。通過對腦脊液進行鑒定、測序，其符合李斯特菌的讀數，同時成像雙相病程[3]。單核細胞增生李斯特氏菌感染的前驅癥狀主要表現為頭痛、惡心以及嘔吐，隨后可發展成為神經系統癥狀，嚴重時會出現呼吸衰竭，因此進行適當診斷、抗生素治療尤為重要。有研究通過明確中樞神經系統感染的致病微生物，使用生化、細胞學以及革蘭染色等檢測方法，在測序平臺進行測序的同時，擴增后使用基因分析儀進行測序分析，采用tNGS 共檢測到核酸序列數為57-2611 條，平均為60.21%。tNGS 在李斯特菌檢測中具有一定優勢，同時能夠識別出細菌病原體。當前遺傳性原發性免疫缺陷患者死亡的主要原因為病毒性肝炎，使用tNGS 進行深度測序分析，在獲得完整基因組的同時，顯示出高水平同源性，具有病原譜范圍明確、檢測精度高的優勢。目前tNGS 在疾病診斷中可用性不斷增加[4]。tNGS 技術的應用，可有效縮短診斷時間，提高病原菌的檢出率。通過對患者腦脊液樣本進行tNGS 檢測，可以在較短時間內獲得大量的DNA 序列信息，實現對病原體種類和數量的全面分析。與傳統方法相比，tNGS 技術不受病原體培養的限制，可以檢測到一些難以培養或未知的真菌種類，為醫生提供更全面的診斷依據。

受到人員、環境、患者等多重因素的影響，重癥監護室（ICU）是極易出現感染的場所之一，如在對患者進行操作時，操作不規范；未嚴格按照規范進行無菌操作；患者病情相對危重，侵入性傷口較多；患者在轉入重癥監護室時已伴有明顯的肺部感染。相關研究發現，感染作為影響重癥病房患者預后的危險因素，出現率相對較高，在延長患者住院時間的同時，還會導致患者的生存質量、生命安全受到影響。ICU 集中了不同病種、不同程度的感染，感染菌株常為多重耐藥菌株，是引起多系統器官衰竭及導致死亡的重要因素，因此在治療過程中，減少不良事件發生的同時，提高感染早期診斷的準確性和效率同樣重要。

面對頻發的新發傳染性疾病，以及逐年上升的微生物耐藥率等問題，快速、精準的病原診斷及其耐藥性評估尤為重要。tNGS 技術兼顧PCR 技術的靈敏性、時效性、特異性以及NGS 技術高通量的特點，實現了一次檢測僅需12 小時，可同時檢測數十種至數百種的病原及其相關的耐藥基因和毒力基因。此外，它還可以實現DNA和RNA 共檢測，且病原可細分至亞種或亞型，能夠快速、客觀地檢測臨床標本中不同類型的病原微生物，為病原學診斷提供了新的臨床選擇。

2021 年初，金域醫學聯合開發的tNGS 檢測項目正式為臨床提供檢測服務。同時，作為tNGS 病原檢測技術的領航者，金域醫學與金圻睿生物科技有限責任公司針對不同感染癥候群、不同標本類型開發了多種檢測產品，并為滿足不同地區的檢測時效性，在國內19 個省市區實現了本地化檢測，搭建起全國規模較大的tNGS 感染檢測中心。2022 年10 月，為保證多重呼吸道病原體核酸檢測結果的準確性，使其得到更好應用，上海市臨床檢驗中心開展多重呼吸道病原體核酸檢測室間質評活動，金域醫學基于tNGS 技術平臺開發的“呼吸道病原體靶向檢測153 項”和“呼吸道病原體靶向檢測95 項”檢測項目被納入其中。2023 年初，上海市臨床檢驗中心公布的2022 年調查計劃《多重呼吸道病原體核酸檢測》總體樣本結果，金域醫學（603882）滿分通過。這是國內室間質評活動首次對tNGS 病原體檢測項目進行質量評價，證實加強病原體檢測技術的研究和應用，對于感染性疾病的臨床診治具有重要的指導意義。

作為現階段常見的呼吸系統感染性疾病，肺部感染發病率較高，如果治療不及時將會出現呼吸衰竭，整體預后較差。在肺部感染的診斷中，細菌是常見的致病因子之一。傳統的細菌檢測方法需要較長的時間和較復雜的操作流程，限制了在基層醫院進行快速和準確的診斷，而利用tNGS 技術可以在較短的時間內對樣本中的細菌進行高通量、高靈敏度的檢測。tNGS 技術可以檢測到包括少量細菌在內的所有細菌種類，大大提高了感染早期診斷的準確性和敏感性。在真菌檢出方面，tNGS 技術能夠幫助醫生更快速、更準確地確定感染的真菌種類，為合理的抗真菌治療提供重要依據。傳統的真菌檢出方法往往需要培養和鑒定，耗時且有一定限制，而tNGS 技術可以在較短時間內獲得更全面的真菌信息，有助于及時有效地制定個體化的治療方案。基于這些優勢，tNGS技術在肺部感染細菌檢出中的應用前景十分廣闊，有望成為基層醫院感染診斷的重要工具。有研究報告指出，侵襲性肺曲霉菌?。↖PA）的感染性強、病死率高，診斷較為困難，患者進行常規抗感染治療效果不佳。在對患者進行支氣管灌洗的同時，使用tNGS 對支氣管肺泡灌洗液標本進行測試，在收到樣品后，tNGS 能夠檢測到煙曲霉的序列度數。研究中3 例患者給予伏立康唑抗真菌進行治療，經胸部CT 進行復查，病灶吸收明顯。IPA 目前發于血液系統惡性腫瘤患者，同時也是致命的真菌感染。因此早期進行肺曲霉菌的診斷具有一定的價值。tNGS 作為診斷免疫缺陷、功能受損的前景方法，pendleton 等通過使用基因組學進行呼吸道病原體的檢測，報告顯示對于相關間質性肺炎的患者，使用宏基因組測序能夠進行金黃色葡萄球菌的快速檢測。tNGS 在診斷肺炎病原體方面效果顯著[5]。

結核分枝桿菌作為肺部感染病原體的一個重要部分，結核病是肺部感染病原體授予的重要部分。肺結核是一種嚴重的傳染病，早期診斷和治療對于患者的生存和康復至關重要。傳統的結核菌培養和PCR 技術存在診斷時間長、假陽性率高等問題，而tNGS 技術可以同時檢測出多種病原體，提高了對結核感染的檢出率和準確性。因此，基層醫院在感染早期診斷中應用tNGS 技術，有助于及時發現結核感染，采取有效的治療措施，減少感染的傳播和疾病的惡化。一項回顧性研究表明，心臟手術期間暴露在污染加熱器冷卻裝置中的患者易受分枝桿菌嵌合體（M.chimaera）的感染，抗酸桿菌培養的診斷金標準通常需要侵入性取樣。研究人員使用NGS 方法檢測了10 名接受心臟手術患者的血漿，對標本進行抗酸桿菌培養[6]。接受血漿NGS 檢測的10 名患者中，9 人患有侵襲性疾病，檢查所需中位時間為4 d。在這些患者中，7 人首次獲得了M.chimaera 感染的病原學確認?？顾釛U菌培養呈陽性所需中位時間為20 d，確認M.chimaera 的中位時間為41 d，在該序列獲得的24 種抗酸桿菌血培養物中，只有4 種（17%）呈陽性。在這些患者中，90%接受了侵入性手術，只有5 名患者（50%）表現出分枝桿菌的增長。潛伏期和非特異性癥狀使感染M.chimaera的患者無法被輕易識別。因此，等離子NGS 可以比抗酸桿菌培養物更快，更準確地檢測奇異菌，這是一種有價值的新型診斷工具。同時，結核病耐藥性是世界上最大的健康問題之一[7]。遺傳敏感結核菌株和耐藥菌株分析表明，tNGS 通過估計的積極和消極預測值，檢測出了菌株抗性。研究人員從哈利姆大學醫學中心的臨床樣品中收集了36 株結核菌株，通過核酸提取、PCR 和基因測序、生物特征分析、估計預測值和統計分析得出結果，與耐藥性相關的突變有24 個，其中基因型和表型對二丙酰胺、利福平、乙胺丁醇一貫敏感，對鏈霉素和氨基霉素的反應較差。

綜上，tNGS 在臨床檢驗中越來越受關注，正被廣泛應用于呼吸系統感染、血流感染等臨床檢驗領域。早期進行tNGS 檢測，能夠有效提升診斷準確性，整體效果良好。