基于WGCNA的尿道下裂相關基因鑒定分析

[摘要]"目的"利用基因共表達權重網絡（weighted"gene"co-expression"network"analysis，WGCNA）探索與尿道下裂發病相關的潛在基因。方法"利用WGCNA算法將數據集GSE35034處理并構建基因共表達權重網絡，篩選出與尿道下裂相關性最高的模塊，通過基因本體論（gene"ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）對模塊中的基因進行富集分析。同時進行差異分析，篩選差異基因。將差異基因導入String數據庫，利用Cytoscape軟件，找出網絡中樞紐基因。將以上3"種方法的結果系統分析，篩選出交集中的核心基因。利用外部數據集對核心基因進行mRNA表達變化及受試者操作特征（receiver"operating"characteristic，ROC）曲線診斷驗證。結果"基于WGCNA方法得到15個共表達模塊。通過差異分析獲得了93個滿足條件的共同差異基因。通過Cytoscape軟件分析最終得到10個核心基因。最后3種方法得到2個交集基因：FBXL16、SYNDIG1。ROC曲線驗證了交集基因在尿道下裂患者與正常人中表達存在差異。結論"本研究通過WGCNA獲得了2個與尿道下裂具有顯著相關性的關鍵基因，可用于尿道下裂發病及治療的探索。

[關鍵詞]"尿道下裂；基因共表達權重網絡；差異分析；富集分析

[中圖分類號]"R726.9""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.14.002

Analysis"of"key"gene"related"to"hypospadias"based"on"gene"co-expression"weight"network"analysis

LIU"Xiaoya1，"CHANG"Mengmeng1，"MA"Wenyue1，"GAO"Hongjie2，"SUN"Fengyin1，3

1.Department"of"Pediatric"Surgery，"Qilu"Hospital"of"Shandong"University，"Jinan"250012，"Shandong，"China;"2.Department"of"Pediatrics，"Qilu"Hospital"of"Shandong"University，"Jinan"250012，"Shandong，"China;"3.Center"for"Post-Doctoral"Studies"of"Shandong"Qidu"Pharmaceutical"Co.，LTD，"Jinan"250012，"Shandong，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"potential"genes"associated"with"the"pathogenesis"of"hypospadias"using"weighted"Gene"co-expression"network"analysis"（WGCNA）."Methods"The"WGCNA"algorithm"was"used"to"process"the"hypospadias-related"dataset"GSE35034，"and"then"a"gene"co-expression"weight"network"was"constructed"to"screen"the"modules"with"the"highest"correlation"with"hypospadias，"and"the"genes"in"the"modules"were"enriched"and"detected"by"gene"ontology"（GO），"Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes"（KEGG）."Differential"analysis"was"also"performed"to"screen"out"differential"genes."The"differential"genes"were"imported"into"the"String"database."Using"Cytoscape"software，"the"hub"genes"in"the"network"were"identified."The"results"screened"by"the"above"threenbsp;methods"were"combined"and"analyzed，"and"the"core"genes"in"the"intersection"set"were"screened."Using"the"external"dataset"GSE121712，"the"core"genes"were"verified"by"mRNA"expression"changes"and"subject"work"characterization"receiver"operating"characteristic"（ROC）"curve"diagnosis."Results"Fifteen"co-expression"modules"were"obtained"based"on"the"WGCNA"method."Ninety-three"common"differential"genes""meeting"the"conditions"were"obtained"by"differential"analysis."Ten"core"genes"were"finally"obtained"by"Cytoscape"software"analysis."Finally"MEbrown"module，"differential"genes"and"the"10"core"genes"yielded"a"total"of"2"intersecting"genes："FBXL16"and"SYNDIG1."ROC"curves"verified"that"the"intersecting"genes"were"differentially"expressed"in"patients"with"hypospadias"versus"normal"subjects"."Conclusion"In"this"study，"two"key"genes"with"significant"correlation"with"hypospadias"were"obtained"by"WGCNA，"which"may"be"used"for"the"early"diagnosis"and"treatment"of"hypospadias"after"further"study.

[Key"words]"Hypospadias;"Weighted"gene"co-expression"network"analysis;"Differential"analysis;"Enrichment"analysis

尿道下裂是最常見的男性泌尿生殖系統畸形之一，但其發病機制仍不明確。近年來，隨著外科手術技術不斷進步，已出現多種手術方式，但治療效果仍不滿意；近幾十年來發病率有上升趨勢，因此人們對尿道下裂的發病原因也更加關注[1]。尿道下裂的遺傳易感性具有公認的家族性聚集性，患有尿道下裂的男孩的男性親屬更容易患這種疾病。當遺傳易感性與抗雄激素藥物暴露相結合時，基因和環境風險因素可能相互作用超過閾值，導致這種出生缺陷的發生[2]。因此，尿道下裂發育畸形和生殖疾病的發生，存在基因和環境的共同作用，并且攜帶遺傳易感基因合并環境內分泌干擾物的暴露可能是發病的主要原因。

在基因組時代，隨著高通量測序技術發展和基因表達數據庫的完善，為尿道下裂的病因學研究提供了新的途徑。基因表達數據庫（gene"expression"omnibus，GEO）是當今最全面的基因表達數據庫，目前儲存了高達208萬樣本的表達譜數據。本研究從GEO上選擇了包含3種人類包皮成纖維細胞基因表達譜的芯片，進行加權基因共表達網絡分析。

WGCNA是一種基于基因表達數據集檢測，研究高度相關基因簇的常用方法，通過構建基因表達網絡，篩選生物標志物或治療靶點[3-4]。WGCNA可根據基因表達模式將不同基因進行聚類，分析基因模塊與特定性狀之間的關系，篩選出有效生物標志物[5-6]。目前，WGCNA被廣泛用于疾病、生理學、藥物、進化和基因組的生物學研究[7]。

本研究擬通過對尿道下裂相關的基因表達數據分析整合后尋找出與尿道下裂發生相關的致病基因，為今后研究疾病的發病機制和靶向治療提供線索。

1""材料與方法

1.1""數據獲取

從GEO（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）數據庫中下載與尿道下裂有關的芯片包含表達數據及臨床信息（GSE35034）。其收錄了來自日本國家兒童健康與發展研究所的尿道下裂兒童患者（n=23，中位年齡2.3歲）接受外科手術治療的3種人類包皮成纖維細胞（human"foreskin"fibroblasts，hFFC）進行了全基因組篩選。用二甲基亞砜（dimethyl"sulfoxide，DMSO）作為對照，分別暴露于10nmol/L雙酚A（bisphenol"A，BPA）、0.01nmol/L17β-雌二醇（estradiol，E2）和1nmol/L"2，3，7，8-四氯二苯并對二英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）24h后測量來自尿道下裂患兒的3種hFFC的基因表達譜。所有樣本均采用Agilent-028004"SurePrint"G3"Human"GE平臺檢測。

1.2""WGCNA共表達模塊分析與功能富集分析

WGCNA是一種系統的生物學方法，常用于描述不同樣本之間的基因關聯模式[8]。使用“WGCNA”"R包構建共表達網絡[9]。選取合適軟閾值，并篩選出權重最大模塊。在WGCNA最佳模塊中選擇核心基因（Rgt;0.8，Plt;0.01），通過利用R的“clusterprofiler”包對模塊核心基因進行基因本體論（gene"ontology，GO）和基因和基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路功能富集，篩選出具有顯著富集的功能和信號通路。

1.3""篩選差異基因與核心基因

利用R語言的“Limma”包對GSE35034所有轉錄數據進行差異分析，獲取與尿道下裂發病相關的差異基因[10]。對E2、TCDD、BPA組數據篩選得到的差異表達基因取交集，獲得表達一致的差異基因。將差異基因輸入到String數據庫中，篩選并繪制蛋白質互作網絡（protein-protein"interaction"network，"PPI）圖[11]。使用Cytoscape軟件對網絡進行分析，選取連通性最高的前10個基因作為尿道下裂發病的樞紐基因。為使結果更為準確，將WGCNA核心模塊基因、共同差異基因及PPI網絡所篩選的基因，系統分析取其交集，篩選出重疊的關鍵基因。再對關鍵基因進行mRNA表達變化及受試者操作特征（receiver"operating"characteristic，ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（area"under"curve，AUC），診斷驗證。

1.4""統計學方法

本研究所有數據采用R軟件分析，差異分析采用貝葉斯算法，相關性分析采用皮爾遜相關性分析，兩組間的數據分析采用雙t檢驗，適當的時候用t檢驗，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""樣本預處理及基因共表達模塊的構建

對原始數據進行預處理，共獲得109"834個基因的表達數據。對樣本進行離群性檢驗，然后進行聚類分析。首先對軟閾值進行篩選，當軟閾值β設置為8時，樣本獨立性較高，且可獲得較好的連接關系。將基因動態切割，得到基因聚類樹（圖1）。再連鎖分層聚類合并，最終得到15個模塊，各模塊基因個數從110～357不等。

2.2""基因模塊與臨床性狀關聯分析

計算模塊的特征基因與樣本來源的皮爾遜相關系數，并考慮到相關系數和P值，r=0.72，P=0.008作為具有臨床意義的模塊。然后對其進行基因重要性及基因表達水平分析，并繪制散點圖分析模塊內基因是否符合線性（圖2）。

2.3""GO和KEGG富集分析

利用R的“clusterProfiler”包對選擇模塊基因進行GO和KEGG功能富集分析（圖3）。GO富集結

果顯示，模塊基因主要參與腎臟發育，生殖系統發育，促進脂質生物合成等過程。在KEGG通路方面，主要富集于一些與細胞增殖分化等有關調節，如癌癥通路，PI3K-Akt信號通路，蛋白質消化吸收，PPAR信號通路。

2.4""差異基因的PPI構建

從GEO數據庫分別獲得的E2、TCDD、BPA組數據，經過差異分析，得到滿足條件的差異基因，再將三組數據取交集共得到共同差異表達基因93個，其中上調基因"37個，下調基因56個，并用火山圖展示其表達的差異性（圖4）。

將篩選出的共同差異基因導入STRING，篩選條件設置為：置信度≥0.15，互作最大值等于0。之后把STRING的計算結果導入Cytoscape"軟件。應用cytoHubba插件篩選出節點打分排名前10的關鍵基因：CTNND2、SLITRK1、KCNF1、FAM107A、CTTNBP2、SCAMP5、TMEM132B、LAMP5、SYNDIG1、FBXL16。

2.5""關鍵基因表達驗證和ROC曲線分析

為進一步驗證核心分子準確性，對數據集中WGCNA核心模塊基因、共同差異基因及Cytoscape軟件所篩選的基因，整合分析，最后篩選出關鍵基因SYNDIG1和FBXL16為有效的生物標志物。

在數據集GSE121712中驗證所篩選的基因在尿道下裂患者與正常組表達存在差異（圖5），同時，ROC分析表明，發現SYNDIG1和FBXL16基因對于尿道下裂的存在具有較好的預測能力（圖6）。

3""討論

尿道下裂是一種男性常見生殖系統畸形，目前手術治療效果不滿意且術后并發癥多，因此早期診斷預防具有重要意義。目前公認的尿道下裂發病可能與基因、環境等多因素相關，但其詳細機制仍不明確。攜帶易感基因并存在環境內分泌干擾物暴露是其中一種較為合理的推論。本研究通過WGCNA方法，篩選與尿道下裂發病相關的基因，并進行了驗證分析。

通過基因共表達網絡，篩選出了與尿道下裂發病具有顯著相關性的棕色模塊。然后進行了功能富集分析。根據富集結果顯示，關鍵基因在生物學過程方面主要參與腎臟發育，泌尿系統發育和泌尿生殖系統發育；而在功能和信號通路方面，主要參與一些與細胞增殖分化等有關調節，如："PI3K-Akt信號通路，卵巢類固醇生成，PPAR信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路在先天性尿道下裂中發揮重要作用，PPAR信號通路與尿道發育相關[12-13]。相關研究表明，PI3K/Akt信號廣泛參與調節各種細胞過程，包括增殖、分化、存活、遷移和凋亡等；PI3K/Akt的激活可以減少雄激素受體介導的轉錄[14]。

同時本研究進行差異分析和PPI網絡構建，與棕色模塊聯合分析后，從中篩選出與尿道下裂生物發病過程最可能相關的兩個基因SYNDIG1和FBXL16。SYNDIG1即突觸分化誘導基因1，主要參與調控突觸后受體密度[15]。

FBXL16即F-box和富含亮氨酸重復蛋白16"，是一種F-box蛋白，參與幾乎所有生命活動的調節，如細胞周期、增殖和凋亡。有研究表明，FBXL16可能與泛素化、磷酸化有關，可以促進細胞增殖[16]。Sato等[17]的實驗也證明，FBXL16表達的缺失促進了細胞增殖。一項關于乳腺癌的研究中也發現FBXL16沉默抑制了細胞中p-AKT和p-mTOR的水平。FBXL16表達抑制乳腺癌上皮-間充質轉化和血管生成也被證實。FBXL16還被證明是心血管祖細胞分化抑制因子之一[18-20]。在胚胎發育過程中泌尿系統及原始血管系統均起源于中胚層。原始血管的形成與血島邊緣細胞向血管內皮細胞的分化有關。男性尿道則形成主要依賴于尿生殖竇的中下段，生殖結節演變為陰莖，左、右尿生殖褶在中線閉合并形成尿道海綿體部。FBXL16已被證實可以抑制心血管祖細胞分化。而類似的機制也可能發生于尿道溝閉合、尿道形成時。其具體機制仍有待進一步探索和實驗驗證。

綜上所述，本研究通過構建WGCNA構建共表達網絡，分析處理后發現了SYNDIG1和FBXL16兩個基因與環境共同作用后在尿道下裂生物發病過程中可能起著重要作用。其機制可能與PI3K/Akt/"mTOR信號通路相關。這些發現對于研究尿道發病機制，以及早期診斷、靶向治療有重要參考價值。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] VAN"D"Z"L"F，"VAN"R"I"A，"FEITZ"W"F，"et"al."Aetiology"of"hypospadias："A"systematic"review"of"genes"and"environment[J]."Hum"Reprod"Update，"2012，"18（3）："260–283.

[2] MANSON"J"M，"CARR"M"C."Molecular"epidemiology"of"hypospadias："Review"of"genetic"and"environmental"risk"factors[J]."Birth"Defects"Res.，"Part"A，"2003，"67（10）："825–836.

[3] WEI"J，"ZHANG"J，"WEI"J，"et"al."Identification"of"AGXT2，"SHMT1，"and"ACO2"as"important"biomarkers"of"acute"kidney"injury"by"WGCNA[J]."PLoS"One，"2023，"18（2）："e0281439.

[4] ZHANG"T，"WONG"G."Gene"expression"data"analysis"using"hellinger"correlation"in"weighted"gene"co-expression"networks"（WGCNA）[J]."Comput"Struct"Biotechnol"J，"2022，"20："3851–3863.

[5] MASON"M"J，"FAN"G，"PLATH"K，"et"al."Signed"weighted"gene"co-expression"network"analysis"of"transcriptional"regulation"in"murine"embryonic"stem"cells[J]."BMC"Genomics，"2009，"10："327.

[6] LIANG"W，"SUN"F，"ZHAO"Y，"et"al."Identification"of"susceptibility"modules"and"genes"for"cardiovascular"disease"in"diabetic"patients"using"WGCNA"analysis[J]."J"Diabetes"Res，"2020，"2020："4178639.

[7] TIAN"Z，"HE"W，"TANG"J，"et"al."Identification"of"important"modules"and"biomarkers"in"breast"cancer"based"on"WGCNA[J]."Onco"Targets"Ther，"2020，"13："6805–6817.

[8] WANG"Y，"ZHOU"W，"CHEN"Y，"et"al."Identification"of"susceptibility"modules"and"hub"genes"of"osteoarthritis"by"WGCNA"analysis[J]."Front"Genet，"2022，"13："1036156.

[9] LANGFELDER"P，"HORVATH"S."WGCNA："An"R"package"for"weighted"correlation"network"analysis[J]."BMC"Bioinf，"2008，"9："559.

[10] WEN"J，"REN"T，"ZHENG"J，"et"al."Identification"and"verification"of"pivotal"genes"promoting"the"progression"of"atherosclerosis"based"on"WGCNA[J]."Artif"Cells，"Nanomed，"Biotechnol，"2023，"51（1）："276–285.

[11] SZKLARCZYK"D，"GABLE"A"L，"NASTOU"K"C，"et"al."The"STRING"database"in"2021："customizable"protein-"protein"networks，"and"functional"characterization"of"user-"uploaded"gene/measurement"sets[J]."Nucleic"Acids"Res，"2021，"49（D1）："D605–d612.

[12] CHAO"C，"JIAN"Y"Y，"ZHAO"X"Y，"et"al."The"involvement"of"hsa_circ_0000417"in"the"development"of"hypospadias"by"regulating"AR[J]."Differentiation，"2020，"116："9–15.

[13] MANSOUR"M"M，"GOYAL"H"O，"BRADEN"T"D，"et"al."Activation"of"penile"proadipogenic"peroxisome"proliferator-"activated"receptor"gamma"with"an"estrogen："interaction"with"estrogen"receptor"alpha"during"postnatal"development[J]."PPAR"Res，"2008，"2008："651419.

（下轉第18頁）