組蛋白乙酰化對A549和BEAS-2B細胞哮喘易感基因ADAM33的影響

［摘要］ 目的： 研究丁酸鈉、曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）及腺病毒E1A相關的300 kD蛋白（adenoviral E1A binding protein of 300 kD，P300）介導的組蛋白乙酰化在人非小細胞肺癌A549細胞及人支氣管上皮BEAS-2B細胞中對哮喘易感的解整合素金屬蛋白酶33（a disintegrin and metalloproteinase 33，ADAM33）基因表達的影響。方法： 將A549細胞及BEAS-2B細胞分別分為丁酸鈉對照組（雙蒸水處理）和1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組，TSA對照組（0.1%二甲基亞砜處理）和0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組，按照組別分別予以相應處理；另將BEAS-2B細胞分為對照組（轉染P300突變質粒）和P300組（轉染P300表達質粒）；采用雙熒光素酶報告基因法分析ADAM33啟動子活性的變化，實時熒光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）檢測ADAM33 mRNA表達，蛋白質印跡法檢測ADAM33蛋白表達。結果： 在人非小細胞肺癌A549細胞中，與對照組相比，1 mmol/L丁酸鈉組及0.2 μmol/L TSA組ADAM33基因啟動子活性明顯降低（Plt;0.01）；在BEAS-2B細胞中，與對照組相比，1 mmol/L丁酸鈉組及0.2 μmol/LTSA組ADAM33基因啟動子活性、mRNA及蛋白相對表達水平明顯降低（Plt;0.05或Plt;0.01）。加大丁酸鈉、TSA藥物濃度，ADAM33表達無顯著差異。在人支氣管上皮BEAS-2B細胞中，與對照組相比，P300組ADAM33啟動子活性、mRNA和蛋白相對表達水平明顯降低（Plt;0.05）。結論： 丁酸鈉、TSA通過組蛋白乙酰化降低人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33表達，P300通過組蛋白乙酰化降低人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33表達。

［關鍵詞］ 哮喘；解整合素金屬蛋白酶33；丁酸鈉；曲古抑菌素A；人支氣管上皮BEAS-2B細胞

［中圖分類號］ R725.6

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）03-0242-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230013

［引用格式］郝忠分，杜娟，芮菲菲，等. 組蛋白乙酰化對A549和BEAS-2B細胞哮喘易感基因ADAM33的影響［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（3）： 242-247，253.

Effect of histone acetylation on asthma susceptibility gene ADAM33 in A549 and BEAS-2B cells

HAO Zhongfen1， DU Juan1， RUI Feifei2， HANG Yun1， TANG Chenlu1， LI Zhang1， SHU Jin1

（1. Department of Pediatrics， the Fourth Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001; 2. Department of Neonatal， Changzhou Maternal and Child Health Hospital， Changzhou Jiangsu 213000， China）

［Abstract］ Objective： To evaluate the effects of histone acetylation mediated by sodium butyrate， trichostatin A （TSA） and adenoviral E1A binding protein of 300 kD （P300） on the expression of a disintegrin and metalloproteinase 33 （ADAM33）， one of asthma susceptible genes， in human non-small cell lung cancer A549 cells and human bronchial epithelial BEAS-2B cells. Methods： Human non-small cell lung cancer A549 cells and human bronchial epithelial BEAS-2B cells were divided into sodium butyrate control group （double distilled water treatment） and 1， 2.5， 5 mmol/L sodium butyrate groups， TSA control group （0.1% dimethyl sulfoxide treatment） and 0.2， 0.4， 0.8 μmol/L TSA groups， respectively. BEAS-2B cells were divided into P300 control group （transfected with P300 mutant plasmid） and P300 group （transfected with P300 expressing plasmid）. These cells were treated respectively according to the groups. The ADAM33 promoter activity was analyzed by dual luciferase reporter method， the expression of ADAM33 mRNA was detected by quantitative real time-PCR （qRT-PCR）， and the expression of ADAM33 protein was detected by Western blotting. Results： In human non-small cell lung cancer A549 cells， compared with the control group， ADAM33 promoter activity was significantly decreased in 1 mmol/L sodium butyrate group and 0.2 μmol/L TSA group （Plt;0.01）. In human bronchial epithelial BEAS-2B cells， compared with the control group， the activity of ADAM33 gene promoter， mRNA and protein expression levels was greatly decreased in 1 mmol/Lsodium butyrate group and 0.2 μmol/L TSA group （Plt;0.05 or Plt;0.01）. There was no significant difference in ADAM33 expression when increasing the concentration of sodium butyrate and TSA. In BEAS-2B cells， compared with the control group， the promoter activity， mRNA and protein expression levels of ADAM33 in P300 group were markedly decreased （Plt;0.05）. Conclusion： Sodium butyrate and TSA decreased ADAM33 expression in human non-small cell lung cancer A549 cells and human bronchial epithelial BEAS-2B cells through histone acetylation， while P300 decreased ADAM33 expression in human bronchial epithelial BEAS-2B cells through histone acetylation.

［Key words］ asthma; a disintegrin and metalloproteinase 33 （ADAM33）; sodium butyrate; trichostatin A; human bronchial epithelial BEAS-2B cells

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的異質性疾病，是兒童時期最常見的慢性呼吸系統疾病［1］。研究發現，哮喘是受遺傳和環境因素共同作用的復雜異質性疾病，其中表觀遺傳在哮喘的發生過程中起重要作用［2］。解整合素金屬蛋白酶33（a disintegrin and metalloproteinase 33，ADAM33）表達與哮喘嚴重程度、呼吸功能下降以及氣道超敏反應等相關，是哮喘易感基因［2-3］。目前關于哮喘易感基因ADAM33在表觀遺傳方面的研究主要集中于DNA甲基化［4-5］。組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACi）參與組蛋白乙酰化修飾，其調控紊亂導致基因表達失控，進而引起自身免疫性疾病、炎癥性疾病和腫瘤等多種疾病的發生［6-7］。研究發現，HDACi可緩解與哮喘相關的氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑，可治療哮喘［8］。Peng等［9］研究發現，晚期糖基化終產物可通過抑制HDAC1蛋白表達預防甲苯二異氰酸酯誘導的氣道炎癥；另有研究發現，采用高度選擇性Sirt2抑制劑AGK2治療哮喘小鼠可減輕由嗜酸性粒細胞導致的炎癥［10］；采用HDAC8抑制劑PCI-34051干預哮喘小鼠可減輕哮喘的氣道高反應和炎癥［11］。丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸類HDACi，可廣泛抑制Ⅰ類HDAC和Ⅱa類HDAC活性，對多種疾病具有很強的抗炎活性，例如，Islam等［12］研究發現，在小鼠卵蛋白氣溶膠激發前1 h通過鼻內途徑給藥丁酸鈉，可抑制支氣管肺泡灌洗液中基質金屬蛋白酶2和9活性。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是氧肟酸類HDACi，可抑制Ⅰ、Ⅱ類HDAC，其可降低促炎細胞因子IL-12分泌，增加抗炎細胞因子IL-10分泌［13］。腺病毒E1A相關300 kD蛋白（adenoviral E1A binding protein of 300 kD，P300）是多細胞真核生物中調節增強子的主要HAT，通過乙酰化組蛋白致染色質重塑進而影響多種基因的轉錄表達，參與細胞生長、增殖和凋亡等，并且與炎癥、癌癥、心臟肥大和遺傳性疾病相關［14］。目前關于組蛋白乙酰化修飾是否參與調控哮喘易感基因ADAM33尚不清楚。因此，本研究擬通過采用丁酸鈉、TSA及P300處理人非小細胞肺癌A549細胞和人正常支氣管上皮BEAS-2B細胞，觀察其對ADAM33啟動子活性、mRNA及蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞為江蘇大學第四附屬醫院實驗室保存。P300表達質粒（有P300活性）及P300突變質粒（無P300活性）由英國癌癥研究所Joan Boyes教授惠贈。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、內參照熒光素酶報告基因質粒（pRL-TK）、熒光素酶報告基因（pGL3-Basic）載體購自美國Promega公司；引物由上海英駿生物有限公司合成。含有ADAM33基因啟動子序列的熒光素酶報告質粒（pGL3-1880/+73）由江蘇大學第四附屬醫院實驗室構建［15］。RPMI-1640培養基、DMEM、胎牛血清購自美國Gbico公司；胰酶購自美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TSA購自美國Mce公司；丁酸鈉購自碧云天生物科技有限公司；轉染試劑LipofectamineTM3000和Trizol購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海澤邁生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Millipore公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗人ADAM33抗體購自南京Bioworld Technology公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人非小細胞肺癌A549細胞用5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）以及鏈霉素（100 μg/mL）的高糖DMEM，人支氣管上皮BEAS-2B細胞系用5 mL含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）以及鏈霉素（100 μg/mL）的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，待細胞密度達80%～90%時進行傳代，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組和處理 將人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞分別分為丁酸鈉對照組和1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組，TSA對照組和0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組，丁酸鈉對照組予以雙蒸水處理，TSA對照組予以0.1% DMSO處理，其余組分別予以對應濃度的丁酸鈉和TSA處理。另將人支氣管上皮BEAS-2B細胞分為對照組和P300組，分別轉染P300突變質粒和P300表達質粒。

1.2.3 細胞轉染 將人非小細胞肺癌A549細胞或人支氣管上皮BEAS-2B細胞分別接種于96孔板培養，待細胞密度達70%～90%時進行轉染，配制液體A：5 μL培養基+0.2 μL Lipofectamine 3000試劑，充分混勻；液體B：5 μL培養基+100 ng質粒DNA（轉染pGL3-1880/+73質粒需額外加入4 ng pRL-TK質粒）+0.2 μL P3000TM試劑，將A液與B液混勻，室溫靜置5 min，加入96孔板內繼續培養24 h。每次轉染3個復孔，實驗重復3次。6孔板、12孔板轉染所用試劑同比增加。

1.2.4 雙熒光素酶基因報告分析檢測ADAM33啟動子活性 將人非小細胞肺癌A549細胞、人支氣管上皮BEAS-2B細胞分別接種于96孔板，分別轉染pGL3-Basic質粒、pGL3-1880/+73質粒，轉染方法同“1.2.3”，24 h后按照雙熒光素酶基因報告分析試劑盒說明進行熒光強度檢測。棄培養基，PBS洗滌2次，加入細胞裂解液室溫振蕩15 min，待細胞裂解后加入相應的反應試劑，在Glomax多功能生物與化學發光檢測儀上進行檢測螢火蟲熒光素酶活性強度A值與海腎熒光素酶活性強度B值，A值/B值為熒光素酶相對活性，即ADAM33啟動子活性。將轉染了pGL3-1880/+73質粒的人支氣管上皮BEAS-2B細胞培養24 h后按照“1.2.2”分組加入相應丁酸鈉、TSA，將P300對照組人支氣管上皮BEAS-2B細胞共轉染pGL3-1880/+73質粒、P300突變質粒，P300組人支氣管上皮BEAS-2B細胞共轉染pGL3-1880/+73質粒、P300表達質粒，轉染方法同“1.2.3”，24 h后行熒光強度檢測。

1.2.5 qRT-PCR檢測ADAM33 mRNA表達 取“1.2.2”BEAS-2B細胞，接種于12孔板，待細胞生長密度達70%～80%時，予以相應處理24 h；按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，行qRT-PCR。ADAM33上游引物：5′-TTGAC-TCGGCACCGAAACTT-3′，下游引物：5′-TCAGCGCC-ACCTGAATGTC-3′，以GAPDH作為內參基因。qRT-PCR組成體系（20 μL）：PCR SYBR Green 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水7.2 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火/延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt計算ADAM33 mRNA相對表達量。實驗重復3次，并將結果進行統計分析。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測ADAM33蛋白表達 取“1.2.2”人支氣管上皮BEAS-2B細胞，接種于6孔板，待細胞生長密度達70%～80%時，予以相應處理48 h；采用RIPA裂解液于冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度；每條泳道上樣100 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE分離總蛋白，75 V電泳25 min；待Marker條帶分開后，120 V電泳50 min；250 mA轉膜120 min，將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉2 h；TBST洗滌3次，每次10 min；加入對應的兔抗人ADAM33抗體（1∶1 000）、GAPDH（內參，1∶2 500），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次；加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫孵育2 h；TBST洗滌3次；采用ECL化學發光試劑進行曝光處理，根據Image J軟件進行條帶光密度測量。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計分析，定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丁酸鈉和TSA對人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞ADAM33啟動子活性的影響

雙熒光素酶基因報告分析結果顯示，與轉染pGL3-Basic質粒相比，轉染pGL3-1880/+73質粒后，人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33啟動子活性明顯升高（Plt;0.01）。見圖1。在人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞中，與對照組相比，1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組ADAM33啟動子活性均明顯降低（P均lt;0.01），與1 mmol/L丁酸鈉組相比，2.5、5 mmol/L丁酸鈉組ADAM33啟動子活性明顯降低（Plt;0.05），但2.5、5 mmol/L丁酸鈉組間ADAM33啟動子活性差異無統計學意義（Pgt;0.05）。在人非小細胞肺癌A549細胞中，與對照組相比，0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33啟動子活性均明顯降低（P均lt;0.01），與0.2 μmol/L TSA組相比，0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33啟動子活性均明顯降低（P均lt;0.05），但0.4、0.8 μmol/L TSA組間ADAM33啟動子活性差異無統計學意義（Pgt;0.05）；在人支氣管上皮BEAS-2B細胞中，與對照組相比，0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33啟動子活性明顯下降（Plt;0.01），0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組間ADAM33啟動子活性差異無統計學意義（Pgt;0.05）。見圖2。

2.2 丁酸鈉和TSA對人支氣管上皮BEAS-2B細胞ADAM33 mRNA和蛋白表達的影響

qRT-PCR和蛋白質印跡結果顯示，在人支氣管上皮BEAS-2B細胞中，與對照組相比，1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組ADAM33 mRNA和蛋白相對表達水平明顯降低（Plt;0.05或Plt;0.01），但1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組間ADAM33 mRNA和蛋白相對表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33 mRNA和蛋白相對表達水平明顯降低（Plt;0.05或Plt;0.01），與0.2 μmol/L TSA組相比，0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33 mRNA相對表達水平均明顯下降（P均lt;0.05），但0.4、0.8 μmol/L TSA組間ADAM33 mRNA相對表達水平無明顯差異（P＞0.05），0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組間ADAM33蛋白相對表達水平無明顯差異（P＞0.05）。見圖3、圖4。

2.3 P300對人支氣管上皮BEAS-2B細胞ADAM33啟動子活性、mRNA及蛋白表達的影響

結果顯示，在人支氣管上皮BEAS-2B細胞中，與對照組相比，P300組ADAM33啟動子活性、mRNA和蛋白相對表達水平均明顯降低（P均lt;0.05）。見圖5、圖6。由此提示，P300可能從轉錄水平下調ADAM33表達。

3 討論

ADAM33在人體各組織均有表達，包括人非小細胞肺癌A549細胞及人支氣管上皮BEAS-2B細胞；其中，人非小細胞肺癌A549細胞作為工具細胞，可用于雙熒光素酶基因檢測技術檢測基因啟動子活性，但mRNA及蛋白表達檢測通常需要使用功能細胞，如人支氣管上皮BEAS-2B細胞，故本實驗采用人非小細胞肺癌A549細胞及人支氣管上皮BEAS-2B細胞研究丁酸鈉及TSA對ADAM33基因啟動子活性的影響，使用人支氣管上皮BEAS-2B細胞檢測ADAM33 mRNA及蛋白表達。

本研究發現，低劑量（1 mmol/L）丁酸鈉以及低劑量（0.2 μmol/L）TSA即可致人非小細胞肺癌A549細胞中ADAM33基因啟動子活性以及人支氣管上皮BEAS-2B細胞ADAM33啟動子活性、mRNA和蛋白表達明顯降低。與1 mmol/L丁酸鈉組相比，2.5、5 mmol/L丁酸鈉組ADAM33啟動子活性明顯降低，但2.5、5 mmol/L丁酸鈉組間ADAM33啟動子活性無明顯差異，由此表明，丁酸鈉對ADAM33啟動子活性的影響可能與濃度相關，至于2.5、5 mmol/L丁酸鈉組間ADAM33啟動子活性差異不大，考慮可能系藥物濃度差不足所致。另外，與對照組相比，1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組ADAM33 mRNA及蛋白表達明顯降低，但1、2.5、5 mmol/L丁酸鈉組間ADAM33 mRNA及蛋白表達無明顯差異，表明丁酸鈉濃度增加對ADAM33 mRNA及蛋白表達影響不大，可能系基因轉錄表達過程復雜，丁酸鈉對其中各種組蛋白及轉錄因子的乙酰化程度不同，從而導致一種動態平衡。另外，在人非小細胞肺癌A549細胞中，與0.2 μmol/L TSA組相比，0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33啟動子活性明顯降低，但0.4、0.8 μmol/L TSA組間無明顯差異性；在人支氣管上皮BEAS-2B細胞中，0.2、0.4、0.8 μmol/L TSA組間ADAM33啟動子活性、蛋白表達無明顯差異性，但相較于0.2 μmol/L TSA組，0.4、0.8 μmol/L TSA組ADAM33 mRNA表達明顯降低，與0.2 μmol/L TSA組相比，0.4、0.8 μmol/L TSA組mRNA有差異，而蛋白無差異，猜測可能與TSA對基因轉錄以及翻譯過程中所涉及的轉運RNA及核糖體RNA的乙酰化相關，在基因轉錄翻譯過程中涉及多種轉運RNA，同一種密碼子可能涉及多種轉運RNA，而TSA對不同的轉運RNA的乙酰化程度可能不同。根據目前的實驗結果尚不能明確細胞中ADAM33表達降低與TSA濃度呈相關性，但可以證實的是，TSA可抑制人非小細胞肺癌A549細胞及人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33表達。丁酸鈉和TSA都是常見的HDACi，可使機體內組蛋白或轉錄因子等呈乙酰化狀態，參與基因的表達。本研究結果表明丁酸鈉、TSA可下調ADAM33啟動子活性、mRNA和蛋白表達，但尚不能明確呈濃度相關性。

研究發現，HDACi-丙戊酸鈉可降低哮喘易感基因人血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）啟動子活性和mRNA表達水平［16］。采用HDACi-TSA治療哮喘小鼠模型，結果發現TSA可抑制哮喘易感基因黏蛋白5AC表達，表明組蛋白乙酰化修飾在調控黏蛋白5AC基因表達中起重要作用［17］。本課題組前期發現轉錄因子GATA3上調ADAM33表達［15］，另有研究發現，轉化生長因子-β通過染色質修飾下調正常和哮喘成纖維細胞中ADAM33 mRNA表達［18］；此外，ADAM33基因低甲基化可增加患者過敏性鼻炎的風險［6］。本研究發現丁酸鈉、TSA參與的乙酰化下調人非小細胞肺癌A549細胞及人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33基因表達，提示HDACi可能通過抑制ADAM33表達在哮喘中發揮作用。

P300是機體常見的一種HAT，可轉移乙酰基至賴氨酸殘基，參與生理過程中不同基因的轉錄調控［19］。P300對基因表達的確切作用尚有爭議，例如，研究發現，在成骨細胞中，通常認為P300是轉錄因子（如Runt相關轉錄因子2）的激活因子，以促進成骨基因表達［20-21］；另有研究表明，P300可下調人黏蛋白5AC基因啟動子活性、mRNA和蛋白的表達，在哮喘中發揮作用［22］。通過既往研究，我們發現P300通常是一類輔激活因子，促進基因表達，但針對部分炎癥及免疫方面的基因則可表現為抑制作用。本研究結果顯示，P300抑制人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33表達，表明P300在ADAM33的轉錄調控中可能作為抑制因子起作用。P300對不同基因調控機制不同，這可能與乙酰化是一個復雜而動態的過程相關，P300對不同細胞中不同基因的乙酰化位點不同，乙酰化程度不同，從而導致P300對不同基因可能表現為不同的效應。

綜上所述，丁酸鈉、TSA通過組蛋白乙酰化降低人非小細胞肺癌A549細胞和人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33表達，P300通過組蛋白乙酰化降低人支氣管上皮BEAS-2B細胞中ADAM33表達。丁酸鈉、TSA為兩種不同類型的HDACi，本研究中采用的丁酸鈉、TSA都屬于非選擇性抑制劑，然而HDAC分型很多，在哮喘中部分亞型活性升高，部分亞型活性降低［23］，關于組蛋白乙酰化在哮喘發病機制中的具體作用有待進一步研究。

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［收稿日期］ 2023-01-10" ［編輯］ 劉星星

［基金項目］鎮江市重點研發計劃社會發展項目（SH2018078）

［作者簡介］郝忠分（1993—），女，碩士研究生；束進（通訊作者），主任醫師，E-mail： zjshujin@163.com