固相萃取結合液質聯用法快速篩查和分析生活飲用水中的56種抗生素

摘 要：目的：建立生活飲用中56種抗生素的固相萃取-液相色譜-串聯質譜分析方法。方法：將生活飲用水通過大容量采樣管連接到固相萃取柱上凈化，用C18柱梯度洗脫分離目標物，以乙腈和0.1%甲酸水為流動相，經電噴霧離子源電離，多反應監測模式串聯質譜檢測。結果：56種抗生素的最低檢測濃度為0.1～2.0 μg·L-1，在其線性范圍內的相關系數均大于0.995，3個濃度水平的加標回收率為63.3%～113.0%，相對標準偏差在3.1%～8.3%。結論：該方法前處理簡單、快速，適用于生活飲用水中多種抗生素的快速篩查和定量檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜；固相萃取；生活飲用水；大容量采樣管

Rapid Screening and Determination of 56 Antibiotics in Drinking Water by Solid-Phase Extraction Combined with UPLC-MS/MS

CHEN Kun， ZHONG Gemei， WEI Rirong， HUANG Jiangping， LEI Ningsheng， LIAO Yanhua*

（Guangxi Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530028， China）

Abstract： Objective： To develop a method for determination of 56 antibiotics in drinking water by solid -phase

extraction and UPLC-MS/MS. Method： Drinking water is connected to the solid phase extraction column for purification through a large-capacity sampling tube， target object were separated on C18 with gradient elution using acetonitrile-0.10% formic acid as mobile phase and detected by MS/MS using positive electrospray ionization under the multiple reaction monitoring. Result： The minimum detection of 56 antibiotics was 0.1～2.0 μg·L-1. The correlation coefficients in its linear range are over 0.995. The recovery rates of the 3 concentration levels were 63.3%～113.0% with the relative standard deviations of 3.1%～8.3%. Conclusion： The method has simple and rapid pretreatment， and is suitable for rapid screening and quantitative detection of multiple antibiotics in drinking water.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; solid-phase extraction; drinking water; large-capacity sampling tube

近年來，有關新型污染物的話題再次走入公眾視野，它被稱為“新型污染物”或“新興污染物”，它一般是指由人類活動造成，在城市污水、地表水、飲用水中被頻繁檢測出，但因其生產使用歷史相對較短或發現危害較晚，尚無法律法規和標準予以規定或規定不完善的污染物。目前，國內外廣泛關注的新型污染物主要包括國際公約管控的持久性有機污染物、內分泌干擾物、抗生素等。為加強新型污染物治理，切實保障生態環境安全和公眾健康，國家在2022年出臺了一系列行動方案[1-3]。抗生素為新型污染物中的一類，其被廣泛用于農業、畜禽水產養殖和人類衛生醫療領域的細菌感染治療[4-5]，主要通過藥企制藥廢水、醫院的醫療廢棄物不正當排放以及人體或動物和水產飼養用藥殘留排放進入水體和環境，從而產生污染。

現行的相關抗生素國家標準[6-7]分析方法主要是針對水產品和動物源性食品抗生素的檢測，新發布的GB/T 5750.8—2023[8]主要是針對生活飲用水中29種抗生素和10種降壓藥等個人護理用藥的檢測，國內暫無環境類標準；美國EPA 1694[9]標準方法中已有利用液相色譜-串聯質譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技術，采用同位素標識物為內標物定量測定環境樣品中的藥物及個人護理用品，檢測對象包括7種沙星類抗菌藥，6種大環內酯類和1種林可酰胺類抗生素。這些標準方法大多是針對化學結構相似的某一類抗生素的檢測[10-15]，

科研文獻[16-18]中雖有采用LC-MS/MS檢測水中多種抗生素的報道，但同時測定的抗生素種類和目標物數量涉及范圍和種類還不夠廣，且在多種抗生素的同時檢測過程中，鮮有文獻提及如何在復雜的譜圖中快速篩查出目標物。

水中抗生素含量低、干擾大，因此檢測時采用固相萃取前處理凈化分離和富集技術，將大體積水樣通過過柱的方式進行凈化富集，再結合具有高通量、高選擇性、高準確性及痕量分析能力的LC-MS/MS進行檢測。基于國內近年來食品安全風險監測物質、國內外文獻報道及管控目標物清單，本文建立了包括喹諾酮類、硝基咪唑類、大環內酯類、磺胺類在內的生活飲用水中56種抗生素的固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）結合LC-MS/MS快速篩查和分析檢測方法，為生活飲用水中新型污染物的監測提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑耗材

儀器：TM5500超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀（AB SCIEX 5500，新加坡）；氮吹儀（N-EVAP34美國路易公司）。

試劑耗材：HLB固相萃取小柱（6 mL/500 mg）、大容量采樣管（匹配6 mL SPE小柱，1/8in OD，1 mL，1支/包）、EDTA-2Na（分析純）、甲醇（色譜純，4 L/瓶）、乙腈（色譜純，4 L/瓶）、甲酸（色譜純，4 L/瓶）、標準品：25種磺胺類混標（LOT：2251860，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），9種大環內酯類抗生素混標（LOT：2253998，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），12種硝基咪唑混標（LOT：2101538，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），15種喹諾酮類（LOT：2201585，100 mg·L-1，溶劑為甲醇）購自上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別吸取以上混標1.00 mL用甲醇定容至

10 mL容量瓶中，制備成10.0 mg·L-1混合儲備液，保存于-20 ℃冰箱中。根據標準曲線濃度范圍依次用初始流動相逐級稀釋成系列標準曲線溶液。

1.3 分析步驟

采集1 L水樣于預先現場添加6 mg抗壞血酸的1 L的玻璃瓶中，使用0.45 μm濾膜抽濾。用（1+1）鹽酸溶液或氨水調節水樣的pH值，使水樣的pH值為3.5±0.5，再加入0.5 g EDTA，搖勻溶解；后將水樣通過大容量采樣管連接到預先用6 mL甲醇（色譜純）和6 mL水活化的HLB柱上，調節流速為5～8 mL·min-1，讓水樣連續自動輸入；上樣結束后用10 mL水淋洗小柱，負壓抽干HLB小柱，用6 mL甲酸/甲醇（1∶1 000）混合溶液洗脫樣品，洗脫液靠重力收集到15 mL離心管中，上述洗脫液在≤40 ℃水浴溫度下氮吹至近干，用1.00 mL初始流動相復溶，充分混勻后過0.22 μm濾膜至進樣瓶上機測定。

1.4 測定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（1.7 μm，100 ?，100 mm×2.1 mm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：3 μL；流動相及洗脫條件見表1。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子方式；檢測模式：多反應監測；離子源溫度：600 ℃；GS1：55 psi；GS2：50 psi；氣簾氣：35 psi；噴霧電壓：5 500 V；碰撞氣：6 psi；校準方法：質量軸自動調諧校準。其他條件見表2。

2 結果與分析

2.1 水樣pH值對回收率的影響

本文研究的化合物大多屬于酸堿兩性化合物，水樣pH值會影響其穩定性和存在形態，如在酸性條件下以質子狀態存在，在堿性條件下以游離分子狀態存在。在酸性條件下提取的文獻報道居多，因此本文比較了56種化合物在pH值為2、3、4、5、6條件下的回收率，硝基咪唑類結果回收率在75.3%～102.8%，表明硝基咪唑類化合物回收率良好，受水樣pH值影響較小。在接近中性條件下恩諾沙星、氧氟沙星、氟羅沙星回收率接近50%，水樣調節為酸性（pH值2～4）后，沙星類抗菌藥的回收率有了顯著提高，均達到75%以上。大環內酯類化合物受pH值影響較大，pH值為3～4時回收率在65%～105%；pH值為2時，除紅霉素外，大多數組分回收率顯著下降，這可能與強酸性條件下糖苷鍵水解有關；部分組分在接近中性條件下回收率下降明顯，泰樂菌素、交沙霉素的回收率不到50%。

2.2 儀器條件的優化

由于56種抗生素大多都是含氮化合物，易于質子化，在質譜電噴霧電離模式下易形成[M+H]正離子，且有較強的響應信號，通過針泵進樣優化母離子及各碎片離子參數，結合實際樣品各離子對基線、雜質干擾峰與響應信號的色譜圖，優化后各化合物的離子對信息如表2所示。

正離子模式下，乙腈-0.1%甲酸水流動相體系更有利提高各化合物組分離子化效率，使響應信號更高，峰形更尖銳。通過優化流動相的梯度洗脫條件，大多數有機化合物實現了基線分離，實現了對磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲異嘧啶，磺胺二甲異噁唑和磺胺二甲唑共4組磺胺類同分異構體的基線分離；對于部分未達到基本分離的極性相近的化合物，質譜檢測器的多離子反應監測模式也能進行準確定性定量分析，不影響分析結果。本文通過3輪抽提離子對完成了分析化合物的定性篩查，圖1為10 ng·mL-1分析化合物的色譜圖。

2.3 基質效應的影響

以水源水空白和末梢水空白為基質，按上述方法測定，添加標準系列濃度的56種抗生素標準溶液復溶氮吹后殘渣，繪制基質標準曲線，以之與溶劑（0.10%甲酸水∶乙腈=9∶1）配制的標準溶液響應值比較，用標準曲線斜率的比值評價基質效應的高低。結果顯示，56種化合物的基質標準曲線與溶劑標準曲線斜率比值在0.81～1.15，說明基質效應對定量結果的影響可以忽略，可避免每次實際樣品檢測至少要帶5個空白基質樣品同時測定用以配制基質曲線的麻煩，減少了檢驗工作量。

2.4 方法學評價

以空白水源水為基質，加入一定量的標準溶液，在優化的實驗條件下（pH值為3.5±0.5），以信噪比為10計算方法的最低檢測濃度（定量限）；根據化合物的最低檢測濃度，配制標準系列濃度上機測定，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程及相關系數；根據各化合物的線性范圍，設置低（0.2～5.0 μg·L-1）、中（5.0～20 μg·L-1）、高（20～100 μg·L-1）3個加標水平，按上述方法測定樣品，每個加標水平重復測定6份樣品，計算回收率和相對標準偏差，結果見表3。結果表明，56種抗生素的最低檢測濃度為0.1～2.0 μg·L-1，r均大于0.995，線性良好，低、中、高3個濃度水平的加標回收率為63.3%～113.0%，相對標準偏差在3.1%～8.3%，滿足檢測要求。

2.5 實際樣品檢測

利用本研究建立的方法對南寧市的3份末梢水、3份水源水和3份出廠水進行檢測，檢出抗生素7種，陽性樣品6份，檢出的抗生素主要是大環內酯和磺胺類抗生素，含量為0.2～5.8 μg·L-1，提示應加強監測。

3 結論

本研究建立的一種固相萃取結合UPLC-MS/MS快速測定方法能篩查生活飲用水中56種抗生素，涵蓋了喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類等人獸兩用藥物，可以應用于飲用水源抗生素污染調查和生活飲用水水質監測工作。

實驗室采用傳統的樣品過柱模式，工作不僅耗時費力還可能因為重復性勞動導致倦怠而發生操作失誤，影響結果準確性。本研究創新性地將樣品通過大容量采樣管連接到固相萃取柱上，通過壓差導流實現凈化處理半自動化操作，操作人員能夠輕松實現批次處理樣品，給未配置多通道全自動固相萃取的實驗室提供了一種連續上樣的操作模式，以低實驗成本提高了工作效率。本研究不僅通過對流動相條件的優化，達到對大部分目標化合物的基線分離，還創新性提出對56種抗生素的保留時間進行分類，通過3輪篩查，可以實現檢測數據的快速處理，大大提高實驗室批量數據處理能力的同時減少了失誤。

綜上，本文建立的固相萃取結合液質聯用法篩查生活飲用水中56種抗生素的方法，整個過程操作簡單，適應了現階段環境監測檢測高通量、操作時間短、定性定量準確等要求，值得在更多抗生素殘留的快速篩確證與定量檢測工作中推廣應用。

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基金項目：廣西醫藥衛生計劃課題（Z2015448）

作者簡介：陳琨（1982—），女，湖南邵陽人，碩士，副主任技師。研究方向：實驗室質量管理與理化檢驗。

通信作者：廖艷華（1978—），女，廣西宜州人，碩士，副主任技師。研究方向：理化檢驗。E-mail：1907430702@qq.com。