蘭科植物共生真菌研究進展

楊文宏 黃杏娥 王玲 郭承剛 湯王外 和壽星

摘要 蘭科植物種子體積微小且無胚乳，數量巨大，通常一顆蒴果內有上萬粒種子。自然狀態下蘭科植物種子萌發所需的營養只有依賴共生真菌菌絲侵入才能獲得，因此高度依賴于共生真菌。蘭科共生真菌促進蘭花原球莖、幼苗生長發育、幫助根系吸收水分和營養物質。從國內外蘭科植物共生真菌的分離鑒定、種類、多樣性和專一性、共生萌發以及應用前景等方面進行綜述，進一步為研究蘭科植物種子萌發、野生資源的保護與利用、選育新品種、蘭花種植產業化以及次生代謝藥物研發提供理論依據和參考。

關鍵詞 蘭科植物；共生真菌；多樣性和專一性；種子萌發

中圖分類號 S 682.31? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）12-0025-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.006

Research Progress of Symbiotic Fungi in Orchidaceae

YANG Wen-hong，HUANG Xing-e，WANG Ling et al

（Institute of Alpine Economic and Botany，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Lijiang，Yunnan 674199）

Abstract Orchidaceae are small in size and have no endosperm.Usually，there are tens of thousands of seeds in a capsule.The nutrients required for the germination of orchid seeds in the natural state can only be obtained by relying on the invasion of symbiotic fungal hyphae，so they are highly dependent on symbiotic fungi.Orchidaceae symbiotic fungi promote the growth and development of orchid protocorm and seedlings，and help roots absorb water and nutrients.This paper reviews the isolation and identification，species，diversity and specificity，symbiotic germination and application prospects of symbiotic fungi in orchids at home and abroad，which will further provide theoretical basis and reference for the study of orchid seed germination，protection and utilization of wild resources，breeding of new varieties，industrialization of orchid planting and development of secondary metabolic drugs.

Key words Orchidaceae;Symbiotic fungi;Diversity and specificity;Seed germination

基金項目 云南省科技廳基礎研究計劃項目（202101BC070003）； 云南省財政廳項目（530000210000000017045）。

作者簡介 楊文宏（1987—），男，云南麗江人，助理研究員，碩士，從事花卉資源及遺傳育種研究。*通信作者，副研究員，從事蘭花品種選育研究。

收稿日期 2023-08-31

蘭科植物是被子植物最大的科之一，全球約有蘭科植物899屬27 801種，其分布于大部分陸生生態系統，熱帶及亞熱帶雨林是其主要分布地區，溫帶地區也常有分布；蘭科植物花型優美、花色豐富、花香怡人，具有極高的觀賞價值，此外，部分蘭科植物還是傳統中藥，具有較高的藥用價值［1］。蘭科植物種子體積微小且無胚乳，數量巨大，通常一顆蒴果內有上萬粒種子［2］。自然狀態下蘭科植物種子萌發所需的營養只有依賴共生在菌絲侵入才能獲得，以及蘭科植物正常生長、開花結果等的過程大部分都有真菌參與共生，因此蘭科植物是與真菌形成共生關系的植物［3-4］，而共生真菌泛指生活或特定階段生活在植物組織內并對該植物組織不造成明顯病害的微生物，包括菌根菌與潛伏性病原菌［5］。自從蘭花種子促萌發真菌發現以來，國內外學者在對蘭科種子促萌發真菌的分離篩選、特異性、共生機制研究等方面做了大量研究，對保護和利用蘭科資源發揮了重要作用。該研究從國內外蘭科植物共生真菌的分離鑒定、共生真菌種類、共生真菌多樣性和專一性以及共生萌發等方面進行綜述，旨在進一步為研究蘭科植物種子萌發、野生資源的保護與利用、選育新品種以及蘭花種植產業化研發提供理論依據和參考。

1 共生真菌的分離及鑒定

1.1 共生真菌分離

蘭科植物是與真菌共生的植物，根據蘭科共生真菌研究方法的發展歷程，結合鑒定結果的準確性與高效性，其研究方法主要分成傳統研究法和分子生物學方法。傳統研究法包含單菌絲團分離法、原生境種子誘捕技術和實驗室播種誘捕技術。單菌絲團分離法是指經過表面消毒后，組織塊細胞中菌絲團得到分離，利用顯微鏡選取獨立菌絲團并接種在培養基表面，適宜溫度、光照條件下培養并觀察，如伍建榕等［6］利用該方法從云南怒江、保山、大理等蘭花主要分布區蘭花植株根部分離得到184個真菌菌株；袁莉杭等［7］從野生春蘭（Cymbidium goeringii）菌根共分離到6株真菌菌株；宋新月等［8］從云南和廣西兩地的竹葉蘭根、莖及葉片等部位中共分離出16株內生真菌。原生境種子誘捕技術是指裝袋后的蘭科植物種子放置回蘭科植物生長的環境中進行萌發試驗，然后再從原球莖中分離內生菌［9］；姜昊穎［10］利用原生境種子誘捕技術，獲得了大量華石斛的原球莖，并初步得到自然狀態下其種子萌發所得原球莖數量極低，原生境人工播種顯著提高原球莖的萌發數的規律；孫曉穎等［11］在帶葉兜蘭生境內采用原地共生萌發技術，獲得了2株自然萌發的小幼苗，并分離出有效的種子萌發共生菌。實驗室播種誘捕技術是指在實驗室條件下將原生境中枯枝落葉、土壤等作為種子萌發環境進行萌發試驗，通過分離純化得到原生環境中幫助種子萌發的真菌。此技術不僅有效將萌發真菌進行分離，而且研究蘭科植物種子共生萌發更加方便簡潔［12］。

1.2 共生真菌鑒定

共生真菌分離出來后要對其進行鑒定，主要有形態學和分子生物學兩種鑒定方法。形態學鑒定就是利用顯微鏡觀察菌絲和菌落的形態特征、細胞核計數以及菌絲隔膜超微結構。20世紀80年代末，Moore［13］通過菌絲隔膜超微結構觀察，得到了蘭科共生絲核菌屬以外的角菌根菌屬（Ceratorhiza）、念珠菌根菌屬（Moniliopsis）、瘤菌根菌屬（Epulorhiza）3個新屬；Senthilkumar等［14］報道，蘭科菌根復雜菌絲結構可以用丫啶橙為染料進行熒光顯微照相并且效果很好；Meloille等［15］利用多種熒光染料結合激光掃描共聚焦顯微技術在熊果苷和蘭花中得到菌根結構的三維圖像。伍建榕等［6］從蘭花根中分離到的真菌，根據菌絲特征、菌落形態、產孢結構以及孢子形態等分為18類，分別屬于木霉屬、絲核菌屬、團絲核菌屬、毛殼菌屬、束格孢屬、鐮刀菌屬、枝頂孢屬、蘭科絲核菌類、絲孢綱的其他屬等。顏容等［16］通過對獨花蘭菌根分離以及觀察菌根的基本結構，獲得屬于擔子菌和有絲孢菌在內的共36個菌株，鐮刀菌屬為優勢種屬；胡陶等［17］對5種中國蘭屬植物共生真菌分離、觀察其菌絲隔膜超微結構，最終將得到的共生真菌歸類到無性態的瘤菌根菌屬真菌。

形態學鑒定的方法很難將內生真菌鑒定到種水平，容易造成鑒定結果不準確。因此得借助分子生物學技術來實現鑒定結果的準確性，隨著分子生物學的發展，多種分子標記技術以及rDNA序列分析越來越廣泛地運用于菌根真菌鑒定和比較。Shan［18］由香港不同點的4種陸生蘭科植物根中分離得到21個絲核菌樣菌株；通過菌絲細胞核數、培養形態、隔孔超微結構和rDNA片段的RAPD分析表明，這些菌株大多與角擔菌屬和膠膜菌屬相關。李潞濱等［19］利用rDNA-ITS技術對4種不同地理分布和生態型中國蘭屬植物進行分離，得到12株共生瘤菌根菌（Epulorhiza）。董芳［20］對野生春蘭根部分離到的8種菌株及實驗室保藏的9個菌株利用rDNA-ITS技術進行鑒定，分別隸屬鐮孢屬、毛殼菌屬、角菌根菌屬、曲霉屬、傘狀霉屬、絲葚霉屬、交鏈孢屬、青霉屬、束絲菌屬9個屬。田凡等［21］將硬葉兜蘭菌根中分離到的29株菌根真菌進行rDNA-ITS序列分析共鑒定出23個屬，為瘤菌根菌屬、栓菌屬、膠膜菌屬、小脆柄菇屬、附毛菌屬、絲核菌屬、鐮刀菌屬、擬迷孔菌屬、毛殼屬、擬層孔菌屬、側耳屬、彎孢聚殼屬、輪枝菌屬等，然而分離得到的菌株大部分都屬于膠膜菌屬和瘤菌根菌屬。馮曉曉等［22］從盆距蘭（Gastrochilus calceolaris）、貝母蘭（Coelogyne cristata）、隔距蘭（Cleisostoma linearilobatum）、毛蘭（Eria）和萬代蘭（Vanda）的根、莖、葉分離得到172株內生真菌，用rDNA-ITS技術鑒定為盤菌亞門的4綱11目29屬，以肉座菌目、炭角菌目和格孢腔菌目真菌的相對頻率較高。

2 共生真菌的多樣性及專一性

通過形態學與分子生物學的鑒定，蘭科植物內生真菌尤其是菌根真菌最為豐富多樣，如胡陶［23］對蘭屬植物菌根真菌AFLP聚類分析發現，蘭屬植物菌根真菌的多樣性同時受種類、生境和生態類型3個方面因素的影響，云南地區附生蘭中分離的菌株多樣性最低，受生境因素和生態類型因素的影響最大，地生類型的春蘭分離所得的菌根真菌也表現出較低的多樣性；不同類別的蘭科植物處在不同生長時期過程中所需的菌根真菌也是不相同的，如侯天文等［24］在研究四川黃龍溝地區蘭科菌根真菌多樣性時，觀察到蘭科植物生長季節與菌根真菌的多樣性變化密切相關。繆福俊等［25］對生長在迪慶州的5種杓蘭屬植物共生真菌進行多樣性分析，結果顯示菌根真菌在杓蘭屬植物中具有很高的多樣性，rDNA ITS序列克隆數量多達388個。研究表明，蘭科植物菌根真菌中角擔菌科和膠膜菌科真菌是其中的優勢種群，絕大多數蘭科植物共生萌發真菌都屬于絲核菌類真菌，然而這類蘭科植物的生活型主要為附生和地生型［26］。

Curtis［27］較早地對蘭科植物共生菌根真菌專一性進行研究，結果表明從生長在北美不同地區的蘭科植物菌根真菌分離中得到同一或相近地區的蘭科植物中具有相同的菌根真菌。Masuhara等［28］提出，蘭科植物能與特定真菌形成菌根的條件是在相同原生環境下。共生真菌具有專一性，不同類型的共生真菌參與種子萌發的不同生長階段［29］，在野生狀態下大多數蘭科植物種子的萌發均需特定的真菌參與［30］，如角擔菌科多為小斑葉蘭（Goodyera repens）種子的共生真菌，絲核菌屬多為綬草（Spiranthes sinensis）種子和山蘭（Oreorchis patens）根系的共生真菌［31-33］。蠟殼菌屬、膠膜菌屬以及角擔菌屬是現階段能夠與蘭科植物形成共生關系的菌根真菌［34］。

3 蘭科植物種子共生萌發

蘭科植物種子與萌發菌共同培養，實現其種子萌發的方式稱為共生萌發，20世紀初Bernard最先展開了真菌和蘭花種子萌發關系的研究，其利用純化的真菌侵染種子后萌發狀況良好且能夠形成幼苗。同時其明確指明，在自然條件下，蘭花種子只有被適合的真菌侵染后才能成功萌發［20］。20世紀80年代末徐錦堂等通過天麻（Gastrodia elata）種子的培養，在原球莖中共分離到12種萌發真菌可供天麻種子生長萌發，其中紫萁小菇（Mycena osmundicola）為代表的菌株效果最好［35］。郭順星等［36］采用種子伴菌播種方法，觀察記錄得到鐵皮石斛（Dendrobium officinale）種子萌發率達64％，羅河石斛（D.lohohense）種子萌發率達20％，而無伴菌播種的無種子萌發。共生菌蘭小菇是墨蘭（Cymbidium sinense）菌根分離得到，通過其侵染葉片獲得菌葉來充當培養天麻、石斛等12種蘭科藥用和觀賞植物的種子培養基，結果顯示該真菌有助于提高天麻、報春石斛（D.primulinum）、密花石斛（D.densiflorum）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、長蘇石斛（D.brymerianum）萌發率，而不能夠促進墨蘭種子的萌發［37］。楊友聯等［38］通過分離獲得獨蒜蘭（Pleione bulbocodioides）菌根真菌并將其與種子進行共生培養發現，GN21、GN23和GN24等3種菌株能有效促進種子萌發，而有GN21菌株共生的種子萌發率最高且顯著高于對照組；同時發現相同蘭科植物中分離出不同的菌根真菌絕大多數屬于同一個屬，它們當中一部分對種子萌發有顯著的促進作用，一部分沒有促進作用，相反會使原球莖產生病斑甚至使其死亡。郭仕壇等［39］將2種春蘭和墨蘭根部分離到的菌根真菌CLB111、MLX102與其大雪蘭（C.mastersii）種子共生萌發，結果表明對其種子有明顯的促進作用，萌發率與對照均達到極顯著差異。

4 蘭科植物共生真菌的應用前景

蘭科植物種子必需營養物質含量較低，內部物質獲取的機會少、效率低，還需要在共生真菌的異養影響下萌發［40］；除此之外，蘭科共生真菌促進蘭花原球莖、幼苗生長發育；與蘭花根系共生提供水分和多種營養物質并促進生長開花；增強植株抗病能力抑制病原菌的生長，并幫助植物抵御病害；共生真菌可以改善土壤質量和結構形成土壤菌根，增加土壤的保水性和通氣性，提高土壤的肥力從而提升蘭科植物生長環境［5］。因此，共生真菌可以廣泛應用到蘭科植物的育種、繁育、種植和蘭花產業化、規模化發展中。蘭科植物不僅極具觀賞價值而且藥用價值也極為豐富，蘭科植物共生真菌可產生多種生物活性物質，具有潛在的藥物開發價值和前景，有研究報道，霍山石斛內生菌次生代謝產物豐富多樣，包含黃酮、生物堿、氨基酸、環二肽、核苷酸、降甾醇類化合物，具有抑制腫瘤生長、有促進細胞凋亡和抑制毒素活性等作用［41］；此外，天麻內生菌在蜜環菌的混菌體系中次生代謝產物主要為蒽醌類化合物，此類化合物具有抗癌、抗菌、抗病毒、抑制中樞神經和cAMP磷酸二酯酶等生物活性［42-43］。

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