NLRP3 炎癥小體在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻引起腎間質(zhì)纖維化中的作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白３ （NLRP3） 炎性小體在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻 （UUO） 模型腎間質(zhì)纖維化中的作用，并闡明其可能的作用機(jī)制。方法：健康雄性Wistar大鼠30 只隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=6） 和UUO 組（n=24），假手術(shù)組大鼠僅分離輸尿管不結(jié)扎，UUO 組分別于術(shù)后3、7 和14 d 處死大鼠， 并按照處理時(shí)間分為UUO 3 d 組（n=8）、UUO 7 d 組（n=8）和UUO 14 d 組（n=8）。HE 染色和Masson 染色觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)，試劑盒檢測(cè)各組大鼠腎組織中丙二醛（MDA） 水平、超氧化物歧化酶（SOD） 活性和羥脯氨酸（HYP） 水平，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠腎組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA） 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （TGF-β1） 蛋白表達(dá)水平，Western blotting法檢測(cè)各組大鼠腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：HE染色，UUO組大鼠出現(xiàn)明顯腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫和增寬，可見較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠HE 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分均明顯升高（Plt;0. 05）；與UUO 3 d 組和UUO 7 d 組比較，UUO 14 d 組大鼠HE 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分明顯升高（Plt;0. 05）。Masson 染色，UUO 組大鼠腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見明顯纖維組織增生；隨UUO 作用時(shí)間增加，大鼠部分腎小管消失，腎間質(zhì)明顯增寬，膠原沉積逐漸增多，皮髓交界處膠原沉積程度更加明顯。與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠Masson染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分均明顯升高（Plt;0. 05）；與UUO 3 d 組和UUO 7 d 組比較，UUO 14 d 組大鼠Masson 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分明顯升高（Plt;0. 05）。與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠梗阻側(cè)腎組織中MDA 水平均明顯升高（Plt;0. 05），SOD 活性明顯降低（Plt;0. 05）。與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠梗阻側(cè)腎組織中HYP 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與 UUO 3 d 組比較， UUO 14 d 組大鼠梗阻側(cè)腎組織中 HYP 水平明顯升高（Plt;0. 05）。免疫組織化學(xué)法，與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎組織中α-SMA 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）；與UUO 3 d 組和UUO 7 d 組比較，UUO 14 d組大鼠腎組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)組織中TGF-β1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）；與UUO 3 d 組比較， UUO 14 d 組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)組織中TGF- β1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。Western blotting 法，與假手術(shù)組比較，UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎組織中NLRP3 蛋白表達(dá)水平均明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：NLRP3炎癥小體在 UUO大鼠腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)制與氧化應(yīng)激增加和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平升高有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3； 氧化應(yīng)激； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； 單側(cè)輸尿管梗阻；腎間質(zhì)纖維化

［中圖分類號(hào)］ R692 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

腎纖維化是一種常見的病理過(guò)程，部分原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病可以繼續(xù)進(jìn)展至終末期腎臟疾病（end stage renal disease，ESRD）。腎纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前有效的治療方法較少，且僅可緩解患者的癥狀［1-4］。有多種因素可以促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展，如炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和免疫反應(yīng)等。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 （nucleotidecombined with structure of oligomerization domainreceptor protein 3， NLRP3） 炎癥小體在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究［5-6］ 顯示：在慢性腎臟病（chronic kidney disease， CKD） 或腎纖維化患者腎臟中NLRP3 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartute specificproteinase， Caspase） -1 蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示NLRP3 炎癥小體可能被激活并參與腎纖維化的調(diào)節(jié)。在NLRP3 激活過(guò)程中，其經(jīng)典或非經(jīng)典信號(hào)通路均可在機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部有害信號(hào)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。 本研究建立單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO） 大鼠模型，檢測(cè)NLRP3 蛋白表達(dá)水平， 探討腎組織氧化應(yīng)激和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 在NLRP3 炎癥小體促進(jìn)大鼠腎間質(zhì)纖維化中的作用，以期為腎間質(zhì)纖維化的臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

30只雄性成年Wistar 大鼠購(gòu)自北京斯貝福生物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK （京） 2019-0010， 體質(zhì)量為180～220 g。羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP） 試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smoothmuscle actin，α-SMA） 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TGF-β1 多克隆抗體和 NLRP3 單克隆抗體購(gòu)自上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgM 抗體、SP 免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，5- 溴-4- 氯-3- 吲哚- 磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate， BCIP） /硝基藍(lán)四唑（nitrotetrazolium blue chloride， NBT） 底物顯色試劑盒購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-ployacrylamide gelelectrophoresis， SDS-PAGE） 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模和分組

30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=6） 和UUO 組（n=24）。假手術(shù)組大鼠僅分離輸尿管不結(jié)扎， UUO 組分別于術(shù)后 3、7 和 14 d 處死大鼠， 并按照處理時(shí)間不同分為UUO 3 d 組（n=8）、 UUO 7 d 組（n=8） 和UUO 14 d 組（n=8）。按照參考文獻(xiàn)［7］ 中的方法制備各組大鼠模型。腹腔注射麻醉大鼠后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找左輸尿管，用4-0 號(hào)絲線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管以防逆行性感染，分層縫合關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組除結(jié)扎和剪斷輸尿管外，完成其他手術(shù)過(guò)程。各組大鼠分別于術(shù)后第3、7 和14 天處死，留取腎組織及血液標(biāo)本。取大鼠梗阻側(cè)腎臟， 部分置于 4% 多聚甲醛中固定，其余置于液氮中速凍后－80 ℃冰箱保存。

1. 3 HE染色和Masson染色觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)

將所有大鼠標(biāo)本按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法固定和包埋，腎組織切片厚度為2 μm，分別行HE 染色和Masson 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎小球和腎小管間質(zhì)組織病理形態(tài)表現(xiàn)。HE 染色和Masson 染色分別進(jìn)行半定量分析并計(jì)算各組大鼠腎間質(zhì)纖維化評(píng)分。隨機(jī)選取20 個(gè)互不重疊高倍（×200） 視野對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行半定量評(píng)估， 分值為0～4 分， 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： ① 腎小管無(wú)明顯改變，腎間質(zhì)中無(wú)或極少見炎癥細(xì)胞，無(wú)纖維化組織增生計(jì)為0 分；②腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮和變性，壞死較輕，呈灶性分布，腎間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)， 纖維化組織增生， 病變范圍lt;25%計(jì)為1 分；③腎小管上皮細(xì)胞中度萎縮和變性，壞死較輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化組織中度增生，病變范圍25%～49% 計(jì)為2 分；④腎小管上皮細(xì)胞萎縮和變性，壞死較重，呈片狀分布，大量彌散或聚集成灶的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)， 纖維化組織增生呈束狀、多灶或網(wǎng)狀成片，病變范圍50%～75% 計(jì)為3 分；⑤ 大面積病變， 病變范圍gt;75% 計(jì)為 4 分。 計(jì)算10個(gè)腎組織高倍（×200） 視野HE 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分，取平均值。隨機(jī)選取20 個(gè)互不重疊的高倍（×200） 視野，根據(jù)腎間質(zhì)藍(lán)色著色占全片的范圍分為 5 級(jí)，陰性為 0 分，微量著色lt;25% 為 1 分，輕度著色25%～49% （2 分），中度著色50%～75%（3 分），廣泛著色gt;75% （4 分）。計(jì)算10 個(gè)腎組織高倍（×200） 視野Masson 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分，取平均值。

1. 4 試劑盒檢測(cè)各組大鼠腎組織中 MDA 水平和SOD活性

取適量大鼠腎組織稱質(zhì)量，剪碎并勻漿，離心后取上清液，制成10% 和1% 勻漿，分別按MDA 和SOD 試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行操作，采用比色法檢測(cè)各組大鼠腎組織中MDA 水平和SOD活性。

1. 5 試劑盒檢測(cè)各組大鼠腎組織中HYP水平

稱取大鼠腎組織100～150 mg，置入試管中，加水解液混勻，沸水浴水解，調(diào)節(jié)pH 值，取適量水解液加活性炭混勻、離心，取1 mL 上清，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。采用分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)560 nm處吸光度（A） 值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組大鼠腎組織中HYP 水平。

1. 6 免 疫 組 織 化 學(xué) 法 檢 測(cè) 各 組 大 鼠 腎 組 織 中α-SMA和TGF-β1蛋白表達(dá)水平

石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2 處理后抗原熱修復(fù)，常規(guī)山羊血清封閉后，分別滴加一抗α-SMA （1∶100）和TGF-β1 （1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜。滴加二抗孵育， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 清洗，顯色，并采用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。采用半定量分析計(jì)算各組大鼠腎組織中α-SMA 和TGF-β1 蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)評(píng)分。隨機(jī)選取20 個(gè)互不重疊高倍（×200） 視野，根據(jù)腎間質(zhì)陽(yáng)性著色的范圍評(píng)分：陰性計(jì)為0 分，微量著色計(jì)為0. 5 分，輕度著色計(jì)為1 分，中度著色計(jì)為2 分，廣泛著色計(jì)為3 分。計(jì)算10 個(gè)高倍（×200）視野免疫組織化學(xué)評(píng)分，取平均值，以其代表α-SMA和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平。

1. 7 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平

稱取等量大鼠腎組織，加入裂解液裂解組織蛋白，組織勻漿，離心收集上清液。取100 μg 蛋白與上樣緩沖液混合后，100 ℃變性5 min， 取變性后NLRP3 蛋白進(jìn)行蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳， 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜， 4 ℃ 封閉過(guò)夜，分別與NLRP3 單克隆抗體（1∶1 000） 稀釋，山羊抗兔二抗孵育，堿性磷酸酶試劑盒顯色。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-tubulin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖像繪制。各組大鼠腎組織HE 染色和Masson 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分，各組大鼠腎組織中MDA 和HYP 水平及SOD 活性， TGF- β1、α-SMA 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，采用 Pearson 相關(guān)分析法分析各組大鼠腎組織中HYP 水平與 NLRP3 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)

HE染色結(jié)果顯示：UUO 組大鼠出現(xiàn)明顯腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫和增寬，可見較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠HE 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分均明顯升高（Plt;0. 05）；與UUO 3 d 組和UUO 7 d 組比較，UUO 14 d 組大鼠HE 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分明顯升高（Plt;0. 05）。Masson 染色結(jié)果顯示：UUO 組大鼠腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見明顯纖維組織增生；隨著UUO 作用時(shí)間增加，部分腎小管消失，腎間質(zhì)明顯增寬，膠原沉積逐漸增多，皮髓交界處膠原沉積程度更加明顯。與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠Masson 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分均明顯升高（Plt;0. 05）；與UUO 3 d組和UUO 7 d組比較，UUO 14 d 組大鼠Masson 染色腎間質(zhì)纖維化評(píng)分明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1 和表1。

2. 2 各組大鼠腎組織中 MDA 水平和 SOD 活性

與假手術(shù)組比較， UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠梗阻側(cè)腎組織中MDA 水平均明顯升高（Plt;0. 05）， SOD 活性明顯降低（Plt;0. 05）。UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎組織中MDA 水平和SOD 活性組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見表2。

2. 3 各組大鼠腎組織中 HYP 水平

與假手術(shù)組［ （0. 19±0. 07） mg·g－1］ 比較， UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠梗阻側(cè)腎組織中HYP 水平［ （0. 43±0. 15） mg·g－1、（0. 56±0. 19） mg·g－1 和（0. 63±0. 23） mg·g－1］ 均明顯升高（Plt;0. 05）。與UUO 3 d 組比較，UUO 14 d 組大鼠梗阻側(cè)腎組織中HYP水平明顯升高（ Plt;0. 05）。其余各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。

2. 4 各組大鼠腎組織中α-SMA和TGF-β1蛋白表達(dá)水平

α-SMA 蛋白主要表達(dá)于大鼠腎小管上皮細(xì)胞。假手術(shù)組大鼠腎組織中α-SMA 蛋白僅表達(dá)于腎血管平滑肌肌層，UUO 3 d 組大鼠腎組織中可見α-SMA 蛋白于腎間質(zhì)少量表達(dá)， UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎組織中α-SMA 蛋白表達(dá)逐漸增加，并廣泛分布于腎間質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞，呈廣泛彌漫分布。與假手術(shù)組比較， UUO 3 d 組、UUO 7 d組和UUO 14 d組大鼠腎組織中α-SMA 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）； 與UUO 3 d 組和UUO 7 d 組比較，UUO 14 d 組大鼠腎組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。假手術(shù)組大鼠腎小管間質(zhì)有少量TGF-β1 蛋白表達(dá)；與假手術(shù)組比較，UUO 3 d 組、UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)組織中TGF-β1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）； 與UUO 3 d 組比較，UUO 14 d 組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)組織中TGF- β1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。見圖2 和表3。

2. 5 各組大鼠腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較， UUO 3 d 組大鼠腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），UUO 7 d 組和UUO 14 d 組大鼠腎組織中NLRP3 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖3。

2. 6 各組大鼠腎組織中 HYP水平與 NLRP3蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：大鼠腎組織中HYP 水平與NLRP3 蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 453，Plt;0. 05）。

3 討 論

炎癥小體是由細(xì)胞質(zhì)傳感器、含有Caspase 激活和招募結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing aCARD， ASC） 或人細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白及pro-Caspase-1組成的多聚體復(fù)合物，在調(diào)節(jié)Caspase依賴的炎癥和細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用［8-9］。研究［10-12］ 發(fā)現(xiàn)： 炎癥小體在多種疾病中發(fā)揮重要作用，包括自身免疫性疾病、感染和非感染性疾病。同樣在腎臟疾病中， 炎癥小體參與腎臟的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病理改變和腎損傷，其在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［13］。研究［14-15］ 證實(shí)：NLRP3 是腎臟中最典型的炎癥小體，在多種腎臟疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用，并影響疾病的進(jìn)展。

UUO 模型是研究CKD 腎纖維化的常用模型，為分析腎纖維化分子和細(xì)胞作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)［16］。UUO 模型中， Caspase-1、 白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平升高，NLRP3 蛋白被激活； NLRP3 型基因敲除小鼠在UUO 術(shù)后腎小管損傷及纖維化程度較輕［5］。本研究結(jié)果顯示：UUO 組大鼠術(shù)后3 d 即可見梗阻側(cè)腎臟發(fā)生早期間質(zhì)纖維化損害的表現(xiàn)，且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，纖維化程度逐漸加重； HYP 水平明顯升高，腎間質(zhì)纖維化程度更加明顯； 腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA 蛋白表達(dá)水平明顯升高， 提示腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞增加；同時(shí)NLRP3蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示 NLRP3 炎癥小體可能被激活，并參與腎間質(zhì)纖維化的調(diào)節(jié)。

腎小管間質(zhì)損傷小鼠中NLRP3 炎性小體表達(dá)水平升高， 而腎小管上皮細(xì)胞缺氧時(shí)， 細(xì)胞中NLRP3 蛋白表達(dá)水平與Caspase-1 和ASC 蛋白表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性［17-18］。與高尿酸血癥大鼠腎上皮細(xì)胞中NLRP3/ASC 蛋白表達(dá)水平升高和腎上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究［19-21］ 結(jié)果一致。 高糖、 脂肪多糖和氧化應(yīng)激可促進(jìn) NLRP3 炎癥小體的組裝及激活［22-23］。 氧化應(yīng)激是由細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactiveoxygen species， ROS） 和其他自由基水平升高而引起的，部分氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)損傷線粒體或損害其功能， 如NADPH 氧化酶， 誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生并激活NLRP3 炎癥小體［24］。過(guò)量ROS 刺激炎癥小體，引起腎小管間質(zhì)嚴(yán)重?fù)p傷和細(xì)胞凋亡［19］。高尿酸水平通過(guò)線粒體損傷誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體激活，促進(jìn)ROS 水平升高［20］。尿酸激活的NLRP3-ASCCaspase-1 軸局部觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)， 導(dǎo)致高尿酸血癥性腎病和腎小管損傷［21］。本研究結(jié)果顯示：UUO 組大鼠術(shù)后細(xì)胞膜受到自由基損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化物標(biāo)志物MDA 水平明顯升高。機(jī)體重要的抗氧化酶SOD 活性在UUO 組大鼠術(shù)后3、7 和14 d 明顯降低，提示UUO 組大鼠術(shù)后有大量ROS 產(chǎn)生。UUO 組大鼠術(shù)后7 和14 d NLRP3 蛋白表達(dá)水平明顯升高，UUO 模型大鼠腎小管間質(zhì)損傷和腎間質(zhì)纖維化程度與大鼠梗阻術(shù)后持續(xù)時(shí)間有關(guān)。上述結(jié)果提示NLRP3 蛋白表達(dá)水平與氧化應(yīng)激程度和腎纖維化進(jìn)展有密切關(guān)聯(lián)。

研究［25］ 發(fā)現(xiàn)：腎成纖維細(xì)胞中的NLRP3 蛋白可能通過(guò)TGF-β 信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化。NLRP3 蛋白與TGF- β 誘導(dǎo)的上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化及UUO 后腎纖維化有關(guān)［5，26］。NLRP3 炎癥小體可以影響TGF-β信號(hào)通路，并獨(dú)立于Caspase-1、IL-1β和IL-18 信號(hào)通路， 進(jìn)而激活受體調(diào)節(jié)型 Smads（receptor-regulated Smads， R-Smads）。NLRP3 還可通過(guò)TGF-β1/Smad 信號(hào)在心臟成纖維細(xì)胞中調(diào)控線粒體ROS 水平，TGF-β 誘導(dǎo)的纖維化信號(hào)在NLRP3 缺陷成纖維細(xì)胞中明顯減弱［27］。本研究結(jié)果顯示：UUO 組大鼠術(shù)后3、7 和14 d 腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)中TGF-β1 蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示TGF-β1 蛋白表達(dá)水平升高與NLRP3 炎癥小體激活并促進(jìn)UUO 致腎間質(zhì)纖維化作用有關(guān)。

綜上所述，NLRP3 炎癥小體在UUO 大鼠腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，氧化應(yīng)激增加和TGF-β1蛋白表達(dá)水平升高與NLRP3 炎性小體的激活密切相關(guān)，抑制或阻斷NLRP3 炎癥小體激活對(duì)于預(yù)防和治療腎臟疾病具有重要的臨床意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：阮穎新參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)整理和論文撰寫，賈俊亞參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和病理閱片分析，武占飛參與動(dòng)物模型制作， 商文雅參與動(dòng)物組織標(biāo)本處理和病理制片，張鵬宇參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和論文審校。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ BLACK L M， LEVER J M， AGARWAL A. Renalinflammation and fibrosis： a double-edged sword［J］.J Histochem Cytochem， 2019， 67（9）： 663-681.

［2］ HUMPHREYS B D. Mechanisms of renal fibrosis［J］.Annu Rev Physiol， 2018， 80： 309-326.

［3］ ZHOU T， LUO M C， CAI W， et al. Runt-relatedtranscription factor 1（ RUNX1） promotes TGF-β-inducedrenal tubular epithelial-to-mesenchymal transition（EMT） and renal fibrosis through the PI3K subunitp110δ［J］. EBioMedicine， 2018， 31： 217-225.

［4］ HUANG R S， FU P， MA L. Kidney fibrosis： frommechanisms to therapeutic medicines ［J］. SignalTransduct Target Ther， 2023， 8（1）： 129.

［5］ VILAYSANE A， CHUN J， SEAMONE M E， et al.The NLRP3 inflammasome promotes renal inflammationand contributes to CKD［J］. J Am Soc Nephrol， 2010，21（10）： 1732-1744.

［6］ KE B， SHEN W， FANG X D， et al. The NLPR3inflammasome and obesity-related kidney disease［J］.J Cell Mol Med ， 2018， 22（1）： 16-24.

［7］ 阮穎新， 張鵬宇， 林 珊， 等. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑參與單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化［J］. 中華腎臟病雜志， 2011， 27（5）： 357-362.

［8］ HORTELANO S， GONZáLEZ-COFRADE L，CUADRADO I， et al. Current status of terpenoids asinflammasome inhibitors ［J］. Biochem Pharmacol，2020， 172： 113739.

［9］ ZHANG W J， LI K Y， LAN Y， et al. NLRP3Inflammasome： a key contributor to the inflammationformation［J］. Food Chem Toxicol， 2023， 174： 113683.

［10］LIN C， JIANG Z X， CAO L， et al. Role of NLRP3inflammasome in systemic sclerosis［J］. Arthritis ResTher， 2022， 24（1）： 196.

［11］POTERE N， DEL BUONO M G， CARICCHIO R，et al. Interleukin-1 and the NLRP3 inflammasomein COVID-19： Pathogenetic and therapeuticimplications［J］. EBioMedicine， 2022， 85： 104299.

［12］ALLOATTI G， PENNA C， COMITà S， et al.Aging， sex and NLRP3 inflammasome in cardiacischaemic disease［J］. Vascul Pharmacol， 2022， 145：107001.

［13］BRAGA T T， FORESTO-NETO O， CAMARA N O S.The role of uric acid in inflammasome-mediated kidneyinjury［J］. Curr Opin Nephrol Hypertens， 2020， 29（4）：423-431.

［14］ARANDA-RIVERA A K， SRIVASTAVA A， CRUZGREGORIOA， et al. Involvement of inflammasomecomponents in kidney disease［J］. Antioxidants， 2022，11（2）： 246.

［15］HUANG G Z， ZHANG Y D， ZHANG Y Y， et al.Chronic kidney disease and NLRP3 inflammasome：Pathogenesis， development and targeted therapeuticstrategies［J］. Biochem Biophys Rep， 2023， 33： 101417.

［16］ARANDA-RIVERA A K， CRUZ-GREGORIO A，APARICIO-TREJO O E， et al. Redox signalingpathways in unilateral ureteral obstruction （UUO）-induced renal fibrosis［J］. Free Radic Biol Med， 2021，172： 65-81.

［17］WU M， HAN W X， SONG S， et al. NLRP3 deficiencyameliorates renal inflammation and fibrosis in diabeticmice［J］. Mol Cell Endocrinol， 2018， 478： 115-125.

［18］KIM Y G， KIM S M， KIM K P， et al. The role ofinflammasome-dependent and inflammasomeindependentNLRP3 in the kidney［J］. Cells， 2019，8（11）： 1389.

［19］MISHRA S R， MAHAPATRA K K， BEHERA B P，et al. Mitochondrial dysfunction as a driver of NLRP3inflammasome activation and its modulation throughmitophagy for potential therapeutics［J］. Int J BiochemCell Biol， 2021， 136： 106013.

［20］ZHUANG Y B， YASINTA M， HU C Y， et al.Mitochondrial dysfunction confers albumin-inducedNLRP3 inflammasome activation and renal tubularinjury［J］. Am J Physiol Renal Physiol， 2015， 308（8）：F857-F866.

［21］WU Y S， HE F， LI Y Q， et al. Effects of Shizhifang onNLRP3 inflammasome activation and renal tubular injuryin hyperuricemic rats ［J］. Evid Based ComplementAlternat Med， 2017， 2017： 7674240.

［22］FENG H， GU J L， GOU F， et al. High glucose andlipopolysaccharide prime NLRP3 inflammasome viaROS/TXNIP pathway in mesangial cells［J］. J DiabetesRes， 2016， 2016： 6973175.

［23］LIU H X， ZHAO L， YUE L， et al. Pterostilbeneattenuates early brain injury following subarachnoidhemorrhage via inhibition of the NLRP3 inflammasomeand Nox2-related oxidative stress［J］. Mol Neurobiol，2017， 54（8）： 5928-5940.

［24］梁文杰， 畢建成， 許慶友. NLRP3炎癥小體在慢性腎臟病的表達(dá)及中藥的干預(yù)機(jī)制［J］. 中藥藥理與臨床，2016， 32（3）： 208-211.

［25］ANDERS H J， SUAREZ-ALVAREZ B，GRIGORESCU M， et al. The macrophage phenotypeand inflammasome component NLRP3 contributes tonephrocalcinosis-related chronic kidney diseaseindependent from IL-1-mediated tissue injury［J］. KidneyInt， 2018， 93（3）： 656-669.

［26］WANG W J， WANG X Y， CHUN J， et al.Inflammasome-independent NLRP3 augments TGF- βsignaling in kidney epithelium［J］. J Immunol， 2013，190（3）： 1239-1249.

［27］BRACEY N A， GERSHKOVICH B， CHUN J， et al.Mitochondrial NLRP3 protein induces reactive oxygenspecies to promote Smad protein signaling and fibrosisindependent from the inflammasome［J］. J Biol Chem，2014， 289（28）： 19571-19584.

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFF0216502）；天津市衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（專科） 建設(shè)項(xiàng)目（TJYXZDXK-071C）