miR-487a 通過靶向調控TIA1 對胃癌腫瘤相關巨噬細胞M2 型極化的抑制作用

［摘 要］ 目的：探討微小RNA （miR） -487a對胃癌腫瘤相關巨噬細胞 （TAMs） M2型極化的抑制作用，并闡明其對胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法：分離和培養原發性胃癌患者胃癌組織TAMs 及癌旁組織來源的正常巨噬細胞（NTMs），體外誘導人單核細胞THP-1 分化為TAMs，將分化得到的M0、M1 和M2 型巨噬細胞經條件培養基（CM） 刺激培養24 h，分別獲取TAMs、M1-TAMs 和M2-TAMs。轉染TAMs， 分為空白組、inhibitor-NC 組、miR-487a inhibitor 組、miR-487ainhibitor+si-NC 組和miR-487a inhibitor+si-TIA1 組， 采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting法驗證轉染效率。將M2-TAMs與AGS細胞共培養，分為AGS組、AGS+inhibitor-NC組、AGS+miR-487a inhibitor 組、 AGS+miR-487a inhibitor +si-NC 組和 AGS+miR-487a inhibitor+si-TIA1 組，RT-qPCR 法檢測胃癌組織TAMs 和癌旁組織NTMs 及各組TAMs 中miR-487a 和T 淋巴細胞胞漿內抗原-1 （TIA1） mRNA 表達水平， Western blotting 法檢測胃癌組織TAMs 和癌旁組織NTMs 及各組TAMs 中TIA1 蛋白表達水平，流式細胞術檢測各組TAMs 中CD206 和CD163 水平，酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 法檢測各組TAMs 培養上清中白細胞介素10 （IL-10）、轉化生長因子β（TGF-β）、血管內皮生長因子A （VEGF-A） 和精氨酸酶1 （Arg-1） 水平，CCK-8 法檢測各組AGS細胞增殖活性， 細胞劃痕實驗檢測各組AGS 細胞遷移率， Transwell 實驗檢測各組AGS 細胞侵襲細胞數。結果：RT-qPCR法，與癌旁組織NTMs比較，胃癌組織TAMs中miR-487a表達水平明顯升高（Plt;0. 01），TIA1 mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與TAMs比較，M1-TAMs中miR-487a 表達水平明顯降低（Plt;0. 01），TIA1 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）；M2-TAMs 中miR-487a 表達水平明顯升高（Plt;0. 01），TIA1 mRNA表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；轉染后，與空白組和inhibitor-NC組比較，miR-487a inhibitor組細胞中miR-487a表達水平明顯降低（Plt;0. 01），提示細胞轉染成功。Westernblotting 法，與癌旁組織NTMs 比較，胃癌組織TAMs 中TIA1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與TAMs 比較，M1-TAMs 中TIA1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01），M2-TAMs 中TIA1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；共轉染后，與inhibitor-NC 組比較，miR-487a inhibitor 組細胞中TIA1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）；與miR-487a inhibitor+si-NC 組比較，miR-487a inhibitor+si-TIA1 組細胞中TIA1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）。流式細胞術，與空白組和inhibitor-NC 組比較，miR-487ainhibitor組細胞中CD206和CD163水平明顯降低（Plt;0. 01）；共轉染后，與inhibitor-NC組比較，miR-487ainhibitor 組細胞中CD206 和CD163 水平均明顯降低（Plt;0. 01）；與miR-487a inhibitor+si-NC 組比較，miR-487a inhibitor+si-TIA1 組細胞中CD206 和CD163 水平均明顯升高（Plt;0. 01）。ELISA 法， 與空白組和inhibitor-NC 組比較，miR-487a inhibitor 組TAMs 細胞培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和Arg-1 水平均明顯降低（Plt;0. 01）； 共轉染后， 與inhibitor-NC 組比較， miR-487a inhibitor 組TAMs細胞培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和Arg-1 水平均明顯降低（Plt;0. 01）；與miR-487a inhibitor+si-NC 組比較，miR-487a inhibitor+si-TIA1 組TAMs 細胞培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和Arg-1水平均明顯升高（Plt;0. 01）。CCK-8 法，與AGS 組比較，AGS+inhibitor-NC 組細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）； 與AGS+inhibitor-NC 組比較， AGS+miR-487a inhibitor 組細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）； 與AGS+miR-487a inhibitor+si-NC 組比較， AGS+miR-487a inhibitor +si-TIA1 組細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）。細胞劃痕實驗，與AGS 組比較，AGS+inhibitor-NC 組AGS 細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）；與AGS+inhibitor-NC 組比較，AGS+miR-487a inhibitor 組AGS 細胞遷移率明顯降低（Plt;0. 01）； 與AGS+miR-487a inhibitor+si-NC 組比較， AGS+miR-487a inhibitor+si-TIA1 組AGS 細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）。Transwell 實驗，與AGS 組比較，AGS+inhibitor-NC 組AGS 細胞侵襲細胞數明顯升高（Plt;0. 01）； 與AGS+inhibitor-NC 組比較， AGS+miR-487ainhibitor 組AGS 細胞侵襲細胞數明顯降低（Plt;0. 01）； 與AGS+miR-487a inhibitor+si-NC 組比較，AGS+miR-487a inhibitor+si-TIA1 組AGS 細胞侵襲細胞數明顯升高（Plt;0. 01）。結論：沉默miR-487a表達可通過靶向上調TIA1 抑制胃癌腫瘤相關巨噬細胞M2 型極化， 并抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

［關鍵詞］ 胃腫瘤； 微小RNA-487a； T 淋巴細胞內抗原1； 腫瘤相關巨噬細胞； M2 型極化

［中圖分類號］ R735.2 ［文獻標志碼］ A

胃癌是最為常見的惡性腫瘤之一，盡管胃癌的診斷方法和治療手段有較大進步，但胃癌患者的預后仍然較差， 5 年生存率不足30% ［1-3］。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages， TAMs）是一種腫瘤浸潤免疫細胞類型， 通常分為 M1 和M2 型2 種功能不同的巨噬細胞亞型，前者通常具有抗腫瘤功能，后者可促進腫瘤生長、侵襲、轉移和耐藥［4-6］。M1 和M2 巨噬細胞均具有高度的可塑性， 在腫瘤微環境改變或治療干預下可以相互轉化［7］。隨著TAMs 與惡性腫瘤之間的關系逐漸明確， TAMs 已成為癌癥治療的新的靶點［8］。微小RNA （microRNA， miRNA） 是一類小的非編碼RNA， 具有調節基因表達的作用， 在細胞增殖、分化、代謝和凋亡等多種生物過程中發揮重要作用［9］。研究［9-13］ 顯示： miRNA 在多種疾病和癌癥的進展過程中異常表達。本課題組前期研究［12-13］結果顯示： miR-487a 可以靶向T 淋巴細胞胞漿內抗原1 （T-lymphocyte intracyto plasmic antigen-1，TIA1） 促進胃癌細胞的生長， 并且 M2 巨噬細胞通過外泌體將miR-487a 轉移至胃癌細胞中進而促進胃癌的進展。但miR-487a 是否在胃癌TAMs 極化中發揮作用及TIA1 是否參與調控M2 型極化，還有待于進一步研究。本研究探討miR-487a 對胃癌TAMs M2 型極化的影響， 為胃癌治療提供依據。

1 材料與方法

1. 1 組織樣本來源

收集 2020 年 9 月—2021 年9 月于遵義醫科大學附屬醫院就診的14 例原發性胃癌患者胃癌組織（病理特征一致） 和配對癌旁正常胃組織（距癌組織邊緣gt;5 cm）。所有患者樣本使用方案均經遵義醫科大學醫學倫理委員會批準，倫理審批號：遵醫倫審［2019］ 1-020 號。

1. 2 細胞、主要試劑和儀器

人胃癌系 AGS細胞和巨噬細胞系THP-1 細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所。RPMI 1640 培養基和胎牛血清購自美國Invitrogen 公司， 反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司， Taqman PCR 試劑盒和實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司， TIA1 和 GAPDH 抗體購自美國 Abcam 公司，標記辣根過氧化物酶二抗購自北京中杉金橋公司，miR-487a inhibitor、 inhibitor-NC、 si-NC 和si-TIA1 質粒購自南京 Synthgene 公司，Lipofectamine 2000 購自美國Thermofisher 公司，CCK-8 試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，CD206 和CD163 抗體購自美國BD Biosciences 公司，白細胞介素（interleukin，IL） -10、轉化生長因子β （transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內皮生長因子A （vascular endothelial growthfactor-A， VEGF-A） 和精氨酸酶1 （arginase-1，Arg-1） 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbent assay， ELISA） 試劑盒購自美國eBioscience 公司。超凈工作臺（型號：Hfsafe-1500）購自蘇州凈化設備有限公司，倒置顯微鏡（型號：BM2100） 購自南京江南永新光學有限公司，暗盒（型號：Ⅱ型-X 射線） 購自浙江蔚藍醫療器械有限公司， PCR 擴增儀（型號： 5331） 購自德國艾本德公司， 酶標儀（型號： SYNERGY） 購自美國BioTek 公司。

1. 3 胃癌 TAMs分離

將胃癌組織和癌旁組織分別剪成體積約為 2 mm3 的碎塊，37 ℃下膠原酶消化30 min。使用70 μm 不銹鋼絲網過濾懸液，得到細胞懸液用磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline， PBS） 洗滌2 次，2 000 r·min－1 離心5 min，PBS 緩沖液重懸細胞， 采用密度梯度離心法分離巨噬細胞， 分別獲取胃癌組織來源的TAMs 和癌旁組織來源的正常巨噬細胞（normal tissuemacrophages，NTMs），保存細胞用于后續實驗。

1. 4 細胞培養和分化

AGS細胞和THP-1細胞均用含10% 滅活胎牛血清的RPMI 1640 培養基培養，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。將胃癌AGS細胞置于無血清RPMI 1640 培養基中培養24 h，收集上清， 經過 0. 45 μm 濾膜過濾獲取條件培養基（conditioned medium，CM）。體外培養人單核THP-1細胞，加入10 μg·L－1 佛波酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA），誘導24 h 分化為未分化的M0 型巨噬細胞；M0 型巨噬細胞中加入20 μg·L－1 γ 干擾素（interferon- γ， IFN- γ） 和10 μg·L－1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），誘導24 h 分化成M1 型巨噬細胞； 或加入 20 μg·L－ 1 IL-4 和20 μg·L－ 1IL-13 孵育培養24 h，分化成M2 型巨噬細胞。將分化得到的M0、M1 和M2 型巨噬細胞經過CM 刺激培養24 h， 分別獲取TAMs、M1-TAMs 和M2-TAMs。

1. 5 細胞轉染及分組

選取分化得到的胃癌組織TAMs 細胞，依照Lipofectamine 2000 說明書操作，將inhibitor-NC 和miR-487a inhibitor 分別轉染至TAMs 中， 再分別將si-NC 和si-TIA1 質粒分別共轉染至已轉染miR-487a inhibitor 的TAMs 及NTMs中， 分為inhibitor-NC 組、miR-487a inhibitor 組、miR-487a inhibitor+si-NC 組和miR-487a inhibitor+si-TIA1 組， 另設置空白組， 采用 RT-qPCR 和Western blotting 法驗證轉染效率。采用20 μg·L－1IL-4 和20 μg·L－1 IL-13 孵育24 h，誘導各組細胞向M2 型巨噬細胞分化。將誘導分化的各組TAMs 細胞通過Transwell 共培養體系與AGS 細胞共孵育24 h， 分 為 AGS 組、 AGS+inhibitor-NC 組、AGS+miR-487a inhibitor 組、 AGS+miR-487ainhibitor+si-NC 組和AGS+miR-487a inhibitor+si-TIA1 組。

1. 6 RT-qPCR法檢測胃癌組織TAMs和癌旁組織NTMs 及各組 TAMs 中 miR-487a 和 TIA1 mRNA表達水平

采用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，將其逆轉錄為cDNA。采用Taqman PCR 試劑盒，進行RT-qPCR 反應。miR-487a 引物序列： miR-487a 上游引物，5'-TTCGCACTGGATACGACAACTGG-3'， 下游引物， 5'-CGCTGGCAATCATACAGGGACATGTGCAGGGTCCGAGGT-3'； U6上游引物， 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 下游引物， 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、10 s，60 ℃、1 min，共 40 個循環。 TIA1 引物序列： TIA1 上游引物，5'-TCCCGCTCCAAAGAGTACATATGAG-3'，下游引物，5'-AAACAATTGCATGTGCTGCACTTTC-3'； GAPDH 上游引物， 5'-GATATTGTTGACATCAATGAC-3'，下游引物，5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。反應條件： 95 ℃預變性5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 個循環。分別以U6 和GAPDH 為內參，采用2－ΔΔCt 法計算各組細胞中miR-487a 和TIA1 mRNA表達水平。

1. 7 Western blotting法檢測胃癌組織TAMs和癌旁組織 NTMs 及各組 TAMs 中 TIA1 蛋白表達水平

收集各組細胞， 采用RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。各組取20 μg 蛋白進行電泳分離，并將蛋白轉至PVDF 膜。采用5% 脫脂奶粉封閉2 h， 加一抗TIA1 （1∶1 000） 和GAPDH （1∶ 1 000）， 4 ℃ 孵育輕搖過夜。加入二抗室溫孵育1 h，化學發光法檢測蛋白條帶，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 8 流 式 細 胞 術 檢 測 各 組 TAMs 中 CD206 和CD163水平

收集各組細胞，采用4%多聚甲醛固定10 min， PBS 緩沖液洗滌2 次， 加入0. 1%Triton 處理5 min，分別加入PE 標記的抗CD206 和FITC 標記的抗CD163 單抗處理細胞，于4 ℃避光孵育30 min， 流式細胞儀檢測各組細胞表面CD206 和CD163 水平。

1. 9 ELISA法檢測各組TAMs培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和 Arg-1水平

收集各組細胞培養基，1 000 g、4 ℃離心10 min，取離心上清。按照 ELISA 試劑盒說明書操作，檢測各組 TAMs 培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和Arg-1 水平。

1. 10 CCK-8法檢測各組 AGS細胞增殖活性

按“1. 5” 中分組， 轉染后的M2-TAMs 與AGS 細胞共孵育24 h， 提前4 h 向每孔中加入20 μL CCK-8溶液，4 h 后棄去培養液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），震蕩混勻，采用酶標儀檢測490 nm 波長處的吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞增殖活性。

1. 11 細胞劃痕實驗檢測各組 AGS 細胞遷移率

選取與 M2-TAMs 共培養 24 h 后的 AGS 細胞，以每孔2. 5×105 個細胞的密度接種至6 孔細胞培養板中， 待細胞融合度達到90% 時， 棄去培養基，加入不含血清的培養基，繼續培養24 h，待細胞融合度達到100%，使用移液槍槍頭對細胞進行劃痕操作， 光學顯微鏡觀察細胞劃痕并拍照。采用Image J 軟件計算0 和24 h 時的劃痕面積，計算各組細胞遷移率。細胞遷移率= （0 h 劃痕面積－24 h劃痕面積） /24 h 劃痕面積×100%。

1. 12 細胞侵襲試驗檢測 AGS 細胞侵襲細胞數

于含有Matrigel 基質涂層的Transwell 板上室中加入200 μL AGS 細胞懸液，含有2×104個AGS 細胞，下室分別加入含10%FBS 的500 μL 誘導分化后的M2-TAMs 細胞懸液，細胞密度為4×104 mL－1。培養箱共孵育24 h 后，甲醇固定細胞，以0. 4% 結晶紫染色。于光學顯微鏡下隨機選擇5 個區域進行計數，計算各組AGS 細胞侵襲細胞數。

1. 13 統計學分析

采用SPSS 22. 0統計軟件進行統計學分析。胃癌組織TAMs 和癌旁組織NTMs中miR-487a 及TIA1 mRNA 表達水平， 不同極化類型TAMs 中miR-487a 及TIA1 mRNA 表達水平，轉染后各組TAMs 中CD206 和CD163 水平， 各組TAMs 培養上清中IL-10、TGF- β、VEGF-A 和Arg-1 水平，各組AGS 細胞增殖活性、細胞遷移率和細胞侵襲數均符合正態分布且方差齊， 以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 胃癌組織 TAMs 和癌旁組織 NTMs 及各組TAMs中miR-487a和TIA1 mRNA表達水平

與癌旁組織NTMs （0. 99±0. 04 和0. 98±0. 04） 比較，胃癌組織TAMs 中miR-487a 表達水平（7. 65±2. 45） 明顯升高（Plt;0. 01），TIA1 mRNA 表達水平（0. 17±0. 09） 明顯降低（Plt;0. 01）。與TAMs（1. 01±0. 09 和1. 02±0. 09） 比較， M1-TAMs 中miR-487a 表達水平（0. 28±0. 04） 明顯降低（Plt;0. 01）， TIA1 mRNA 表達水平（7. 75±2. 10） 明顯升高（Plt;0. 01）； M2-TAMs 中miR-487a 表達水平（5. 11±0. 69） 明顯升高（Plt;0. 01）， TIA1mRNA 表達水平（0. 19±0. 07） 明顯降低（Plt;0. 01）。轉染后， 與空白組（1. 01±0. 07） 和inhibitor-NC 組（0. 98±0. 02） 比較， miR-487ainhibitor 組細胞中miR-487a 表達水平（0. 20±0. 03）明顯降低（Plt;0. 01）。提示miR-487a inhibitor 轉染成功。

2. 2 胃癌組織 TAMs 和癌旁組織 NTMs 及各組TAMs中 TIA1蛋白表達水平

與癌旁組織 NTMs（1. 05±0. 08） 比較， 胃癌組織TAMs 中TIA1 蛋白表達水平（0. 58±0. 08） 明顯降低（Plt;0. 01）。與TAMs （0. 42±0. 05） 比較，M1-TAMs 中TIA1蛋白表達水平（0. 99±0. 07） 明顯升高（Plt;0. 01），M2-TAMs 中TIA1 蛋白表達水平（0. 07±0. 05）明顯降低（Plt;0. 01）。共轉染后，與inhibitor-NC 組（0. 48±0. 03） 比較， miR-487a inhibitor 組細胞中TIA1 蛋白表達水平（0. 86±0. 04） 明顯升高（Plt;0. 01）； 與miR-487a inhibitor+si-NC 組（0. 85±0. 05） 比較，miR-487a inhibitor+si-TIA1 組細胞中TIA1 表達水平（0. 62±0. 04） 明顯降低（Plt;0. 01）。見圖1～3。

2. 3 各組TAMs中CD206和CD163水平

與空白組（76. 60%±0. 96% 和81. 38%±1. 40%） 和inhibitor-NC 組（76. 24%±1. 08% 和81. 13%±1. 88%） 比較，miR-487a inhibitor 組細胞中M2 巨噬細胞表面標志物CD206 和CD163 水平（56. 72%±1. 20% 和61. 83%±1. 52%） 明顯降低（Plt;0. 01）。共轉染后，與inhibitor-NC 組（77. 86%±1. 25% 和81. 76%±1. 15%） 比較， miR-487a inhibitor 組細胞中CD206 和CD163 水平（58. 13%±1. 34% 和62. 43%±1. 19%） 均明顯降低（Plt;0. 01）； 與miR-487a inhibitor+si-NC 組（58. 43%±1. 49% 和62. 53%±1. 42%） 比較， miR-487a inhibitor+si-TIA1 組細胞中CD206 和CD163 水平（73. 40%±1. 49% 和77. 96%±2. 22%） 均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖4 和5。

2. 4 各 組 TAMs 培 養 上 清 中 IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平

與空白組和inhibitor-NC組比較， miR-487a inhibitor 組TAMs 培養上清中M2巨噬細胞相關細胞因子IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1 水平均明顯降低（Plt;0. 01）。共轉染后，與inhibitor-NC 組比較，miR-487a inhibitor 組TAMs細胞培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和Arg-1水平均明顯降低（Plt;0. 01）； 與miR-487ainhibitor+si-NC 組比較， miR-487a inhibitor+si-TIA1 組TAMs 細胞培養上清中IL-10、TGF-β、VEGF-A 和 Arg-1 水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖6 和7。

2. 5 各組 AGS 細胞增殖活性

與 AGS 組比較，AGS+inhibitor-NC 組細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）。 與 AGS+inhibitor-NC 組 比 較，AGS+miR-487a inhibitor 組細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。與AGS+miR-487a inhibitor+si-NC 組比較， AGS+miR-487a inhibitor +si-TIA1 組細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）。見圖8。

2. 6 各 組 AGS 細 胞 遷 移 率

與 AGS 組 比 較 ，AGS+inhibitor-NC 組AGS 細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）。與AGS+inhibitor-NC 組比較，AGS+miR-487a inhibitor 組AGS 細胞遷移率明顯降低（Plt;0. 01）。與AGS+miR-487a inhibitor+si-NC組比較，AGS+miR-487a inhibitor+si-TIA1組AGS細胞遷移率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖9 和10。

2. 7 各組AGS細胞侵襲細胞數

與AGS組比較，AGS+inhibitor-NC 組AGS 細胞侵襲細胞數明顯升高（Plt;0. 01）；與AGS+inhibitor-NC組比較，AGS+miR-487a inhibitor 組AGS 細胞侵襲細胞數明顯降低（Plt;0. 01）；與AGS+miR-487a inhibitor+si-NC組比較，AGS+miR-487a inhibitor+si-TIA1組AGS細胞侵襲細胞數明顯升高（Plt;0. 01）。見圖11 和12。

3 討 論

TAMs 是參與腫瘤微環境形成的巨噬細胞，通常分為M1 和M2 型2 種巨噬細胞，其中M1 巨噬細胞是抗腫瘤細胞， M2 巨噬細胞可發揮促癌作用［14-15］。研究［8，16］ 顯示：M2 極化巨噬細胞對胃癌患者預后具有負向作用， 且胃癌細胞與TAMs 之間存在正反饋回路促進腫瘤進展。巨噬細胞極化是指巨噬細胞在單一時間點的激活狀態，由于巨噬細胞的可塑性，其極化狀態在腫瘤微環境改變或治療干預下可以相互轉化［7］。 因此， 靶向 TAMs 可作為一種新的癌癥治療策略， 包括限制單核細胞募集、靶向激活TAMs、將TAMs 重新編程為抗腫瘤活性及靶向TAMs 特異性標記物［7］。研究［17］ 顯示：硫酸葡聚糖通過干擾M2 型巨噬細胞極化抑制胃癌血管生成和侵襲。胃癌中過量的痤瘡丙酸桿菌通過Toll 樣受體4 （Toll-like receptors， TLR4） /磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B， AKT） 信號促進巨噬細胞 M2 極化， 促進腫瘤進展［18］。TAMs 現已成為胃癌治療新的靶點。

miRNAs 在細胞增殖、分化和凋亡等多種過程中發揮重要作用，并且在許多疾病和癌癥的進展過程中異常表達［9］。研究［19］ 顯示：胃癌外泌體衍生的miR-151-3p 可誘導M2 巨噬細胞極化，促進胃癌的生長。胃癌源性外泌體miR-519a-3p 通過誘導肝內M2 型巨噬細胞介導的血管生成促進肝轉移［20］。提示miRNAs 可在巨噬細胞M2 極化過程中發揮重要作用。TIA1 是一種RNA 結合蛋白， 可以調節RNA 代謝，在人體生理和病理過程中發揮重要作用［11，21］。研究［12］ 顯示： TIA1 在胃癌細胞中表達下調， 是胃癌中的腫瘤抑制基因。miR-487a 可以靶向TIA1， 在體內和體外促進胃癌細胞的生長。M2 巨噬細胞外泌體可將miR-487a 轉移到胃癌細胞中， 促進胃癌的進展［13］。但miR-487a 對胃癌TAMs M2 型極化的影響尚未完全闡明。本研究結果顯示： 胃癌組織分離培養得到的TAMs 中miRAGS487a 高表達，而TIA1 mRNA 和蛋白低表達。分化后的巨噬細胞經CM 刺激培養后， M1-TAMs 中miR-487a 低表達，TIA1 mRNA 和蛋白高表達，而在M2-TAMs 中則相反。通過下調miR-487a，細胞中M2 巨噬細胞表面標志物CD206 和CD163 水平降低， 細胞培養上清中 M2 巨噬細胞相關細胞因子IL-10、TGF-β、VEGF-A 和Arg-1 水平降低，M2 型極化被抑制。提示下調miR-487a 表達可以抑制胃癌TAMs 的M2 型極化表型。本研究結果顯示：沉默TIA1 基因可逆轉下調miR-487a 對胃癌TAMsM2 型極化表型的抑制作用。提示下調miR-487a 可以通過靶向上調TIA1 表達抑制胃癌TAMs M2 型極化。通過M2 型巨噬細胞與胃癌AGS 細胞共孵育，進一步研究下調miR-487a抑制胃癌TAMs M2型極化對胃癌 AGS 細胞的影響， 結果顯示： 下調miR-487a 抑制胃癌TAMs M2 型極化可以抑制胃癌AGS 細胞增殖活性、細胞遷移和侵襲能力， 沉默TIA1 基因可逆轉miR-487a 下調對胃癌AGS 細胞增殖活性、遷移和侵襲能力的抑制作用。

綜上所述， 沉默miR-487a 表達可通過靶向上調TIA1 表達抑制胃癌腫瘤相關巨噬細胞M2 型極化，并抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：曲顏參與實驗實施和論文撰寫，戴霖、王彪和阮篤激參與實驗實施、實驗數據分析及整理，鐘裕昌參與文獻檢索和論文修改， 楊雪峰參與文章實驗設計、論文修改和審校。

[參考文獻]

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[基金項目] 貴州省科技廳科技計劃項目（黔科合基礎〔2020〕1Y335）