基于經皮冠狀動脈介入治療術后支架內再狹窄的免疫相關基因及免疫細胞浸潤的生物信息學分析

［摘 要］ 目的：篩選支架內再狹窄（ISR）中差異表達的免疫相關基因（DEIRGs），分析ISR中免疫細胞浸潤情況，并闡明ISR發生發展的機制。方法：由基因表達數據庫 （GEO） 下載GSE46560數據集樣本mRNA 基因表達數據，分為ISR 組與非ISR （non-ISR） 組。采用R 軟件“Limma”包篩選出差異表達基因（DEGs） 并與免疫相關基因（IRGs） 交集獲得ISR 中DEIRGs。采用R 軟件進行DEIRGs 的基因本體論（GO） 和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 富集分析，采用STRING 數據庫構建蛋白-蛋白互作（PPI） 網絡， 以Cytoscape 軟件可視化并計算核心基因（Hub 基因）。繪制Hub 基因的受試者工作特征（ROC） 曲線，計算ROC 曲線下面積（AUC），并評價其診斷價值。采用CIBERSORT 軟件分析ISR 中免疫細胞浸潤情況， Pearson 相關分析法分析免疫細胞間及其與關鍵基因之間的相關性。結果：共鑒定出331個DEGs（Plt;0. 05， | log2FC | gt;1），其中176個基因表達上調，155 個基因表達下調，獲得38 個DEIRGs。GO 功能富集分析，在生物過程（BP） 中DEIRGs主要富集在防御反應、免疫反應和免疫系統；在細胞組分（CC） 中DEIRGs 主要定位于胞外區和細胞質膜等；在分子功能（MF） 中主要參與調控信號受體結合和細胞因子受體活性等。KEGG 信號通路富集分析，ISR 中DEIRGs 主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B （PI3K-AKT） 和轉化生長因子β（TGF-β） 等信號通路。 PPI 網絡， 前10 位Hub 基因中 CD19 具有最高節點。 與 non-ISR 組比較，ISR 組樣本中 CD19 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 05）。 CD19 mRNA 表達的 ROC 曲線中 AUC 值為0. 92 （Plt;0. 05）。免疫細胞浸潤分析， 與non-ISR 組比較， ISR 組患者濾泡輔助性T 淋巴細胞（Tfh） 浸潤水平升高（Plt;0. 05）， 初始B 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、幼稚CD4+T 淋巴細胞和M0 巨噬細胞等浸潤水平升高， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， 記憶性B 淋巴細胞、活化性記憶CD4+T 淋巴細胞、調節性T 淋巴細胞、靜息性自然殺傷（NK） 細胞、活化性NK 細胞、單核細胞、靜息性肥大細胞和中性粒細胞等浸潤水平降低， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。Tfh 與M0 巨噬細胞和靜息肥大細胞等呈正相關關系（r=0. 88，Plt;0. 05；r=0. 68，Plt;0. 05），與單核細胞和中性粒細胞呈負相關關系 （r=-0. 49，Plt;0. 05；r=-0. 42，Plt;0. 05）。 結論：CD19可能通過調控PI3K-AKT 信號通路激活影響Tfh 和B 淋巴細胞，促進ISR 的發生發展。CD19 可作為診斷ISR的生物標志物。

［關鍵詞］ 支架內再狹窄； CD19； 差異表達免疫相關基因； 免疫浸潤； 生物標志物

［中圖分類號］ R392.12 ［文獻標志碼］ A

目前全球范圍內心血管疾病患病率處于持續上升階段，死亡率也居全球首位［1］。經皮冠狀動脈介入治療術（percutaneous coronary intervention，PCI） 是冠心病患者使用最廣泛的血運重建方式，但術后支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR） 的發生率為2%～10% ［2-4］。目前ISR 發生的機制尚不明確。研究［5-6］ 顯示：免疫炎癥在ISR 的發生發展中起重要作用，可能是導致PCI 術后ISR 形成的重要因素。RNA 測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術和生物信息學分析技術已成為研究基因交叉網絡及識別診斷生物標志物的重要方法，可用于探索ISR 可能的發病機制和新的治療靶點［7］。本研究篩選ISR 中差異表達的免疫相關基因（differentiallyexpressed immune-related genes， DEIRGs） 并分析ISR 中免疫細胞的浸潤情況，采用生物信息學方法和RNA-seq 技術探討免疫炎癥對ISR 發生發展的影響，為ISR 的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1. 1 數 據 來 源

由 基 因 表 達 綜 合 （GeneExpression Omnibus， GEO） 數據庫（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo） 下載ISR 微陣列數據集 GSE46560 的表達矩陣和平臺信息［8］。GSE46560 數據集來源平臺為GPL15207， 生物類型為人類， 時間為2018 年， 包含5 例 ISR 患者和6 例非ISR （non-ISR） 患者mRNA 表達數據， 分別為ISR 組和non-ISR 組。GSE46560 數據集樣本信息見表1。

1. 2 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選

對原始芯片數據進行歸一化處理后，采用R 軟件“Limma”包對2 組樣本基因進行差異表達分析。篩選標準為Plt;0. 05 和 | log2FC |gt;1。采用ggplot2 和pheatmap 程序包對篩選出的DEGs 進行可視化分析，繪制熱圖和火山圖。

1. 3 免疫相關基因（immune-related genes，IRGs）和 DEIRGs 獲取

由 ImmPort 數據庫 （https：//immport. niaid. nih. gov） 中獲取ISR 中IRGs。將DEGs 與IRG 取交集， 獲得ISR 中的DEIRGs， 并繪制韋恩圖。

1. 4 ISR中 DEIRGs基因本體論（Gene Ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書 （KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析

按照參考文獻 ［9］ 的方法，采用R 軟件ggplot2 （v3. 3. 0） 包、clusterProfifiler（v3. 14. 3） 包、org. Hs. eg. db （v3. 10. 0） 包和enrichplot （v1. 6. 1） 包對ISR 中的DEIRGs 進行GO 功能及KEGG 信號通路富集分析，并對分析結果進行可視化。

1. 5 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡構建及核心基因（Hub基因）篩選

將ISR中的DEIRGs 輸入STRING 數據庫（https：//string-db. org/），構建PPI 網絡，以置信度gt;0. 9 作為PPI 網絡構建的標準。按照參考文獻［10］ 的方法， 采用Cytoscape 軟件（v3. 9. 1） 對構建的PPI網絡進行可視化，并利用CytoHubba 插件計算Hub基因。

1. 6 ISR 中 DEIRGs基因表達量驗證和 Hub基因診斷價值評價

獲取GSE46560數據集中11個樣本中關鍵基因表達量，采用GraphPad Prism 繪制柱狀圖并進行可視化。采用GraphPad Prism 繪制Hub 基因的受試者工作特征（receiver operatingcharacteristic curve，ROC） 曲線，計算 ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC），并評估其診斷價值。

1. 7 免疫細胞浸潤分析

CIBERSORT算法是一種多功能的反卷積算法， 可進行免疫細胞浸潤分析。采用R 軟件 “CIBERSORT”包計算2 組樣本中22 種免疫細胞浸潤百分率。按照參考文獻［8］中的方法進行可視化。采用Pearson 相關分析法分析免疫細胞間及與關鍵基因之間的相關性。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 2組樣本 DEGs鑒定

GSE46560數據集中共獲得331 個DEGs，其中176 個基因表達上調，155 個基因表達下調。見圖1。

2. 2 DEIRGs篩選

由ImmPort數據庫獲取1 793個IRGs，將其與GSE46560 數據集中獲取的DEGs 取交集后獲得38 個DEIRGs。前10 位DEIRGs 分別為白細胞介素1 受體Ⅰ （interleukin-1 receptor Ⅰ ，IL-1R1）、 CC 基序趨化因子受體3 （C-Cchemokine receptor type 3， CCR3）、CD19、分泌性白細胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyteprotease inhibitor， SLPI）、干擾素α6 （interferonalpha-6，IFNA6）、腫瘤壞死因子受體超家族成員9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9）、酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）、白細胞介素 17 受體 A （interleukin-17receptor A， IL-17RA）、 白細胞介素 10 受體 B（interleukin-10 receptor B， IL-10RB） 和Ⅰ 型干擾素α 受體1 （interferon alpha receptor type 1，IFNAR1）。見圖2 和表2。

2. 3 DEIRGs GO 功能和 KEGG 信號通路富集分析

GO 功能富集分析結果顯示： 生物過程（biological process，BP） 中DEIRGs 主要富集于防御反應、免疫反應和免疫系統等； 細胞組分（cellular component， CC） 中DEIRGs 主要定位于胞外區和細胞質膜等； 分子功能（molecularfunction，MF） 中DEIRGs 主要參與調控信號受體結合和細胞因子受體活性等。KEGG 信號通路富集分析結果顯示：DEIRGs 主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/AKT） 信號通路、轉化生長因子β （transforming growth factor- β， TGF- β）信號通路和白細胞介素17 （interleukin-17，IL-17）信號通路等。見圖3。

2. 4 PPI 網 絡 構 建 及 Hub 基 因 篩 選

采 用CytoHubba 插件計算出前 10 位 Hub 基因， 包括CD19、IL-1R1、SYK、IL-17RA 和IFNAR1 等均具有較高節點。見圖4 和表3。

2. 5 Hub基因表達情況及診斷價值評價

與 non-ISR 組比較，ISR 組樣本中CD19 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 05）， CD19 mRNA 表達的ROC曲線中AUC 值為0. 92。見圖5。

2. 6 免疫細胞浸潤和相關性分析

2組樣本免疫細胞的組成以條形圖顯示。見圖6A。與non-ISR 組比較， ISR 組患者濾泡輔助性 T 淋巴細胞（T lymphocyte follicular helper，Tfh） 浸潤水平升高（Plt;0. 05），初始B 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、幼稚CD4+T 淋巴細胞和M0 巨噬細胞等浸潤水平升高， 但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， 記憶性B 淋巴細胞、活化性記憶CD4+T 淋巴細胞、調節性T 淋巴細胞、靜息性自然殺傷（natural killer，NK）細胞、活化性NK 細胞、單核細胞、靜息性肥大細胞和中性粒細胞等浸潤水平降低，但差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖6B。Pearson 相關分析結果顯示：Tfh 與M0 巨噬細胞和靜息肥大細胞呈正相關關系（r=0. 88，Plt;0. 05；r=0. 68，Plt;0. 05），與單核細胞和中性粒細胞呈負相關關系（r=-0. 49， Plt;0. 05； r=-0. 42， Plt;0. 05）。見圖6C。CD19 與Tfh 呈正相關關系（r=0. 65，Plt;0. 05）， 與γδT 細胞呈負相關關系（r=0. 02，P=0. 02）；SYK 與嗜酸性粒細胞及M2 巨噬細胞呈負相關關系（r=－0. 03， P=0. 03）； TNFRSF9與活化性記憶CD4+T 淋巴細胞呈正相關關系（r=0. 03，P=0. 03），與M2 巨噬細胞及嗜酸性粒細胞呈負相關關系（ r= － 0. 03， P=0. 03；r=－0. 03，P=0. 03）；CCR3 與M2 巨噬細胞2 及嗜酸性粒細胞呈正相關關系（r=0. 02，P=0. 02）；IL-17RA 與巨噬細胞及嗜酸性粒細胞呈負相關關系（r=－2. 9e-4， Plt;0. 01）； IFNA6 與記憶性B 淋巴細胞呈負相關關系（r=－6. 4e-3，Plt;0. 01）。見圖6D。

3 討 論

目前冠狀動脈造影是診斷ISR 病變及嚴重程度的金標準， 但該方法為有創操作， 面臨一定風險［12-13］。隨著藥物洗脫支架技術的引入和后續迭代，提高了PCI 治療的有效性和安全性，但ISR 的發病率和由ISR 產生的重復血運重建需求仍嚴重影響患者的預后［9］。因此，需闡明ISR 發生發展的機制并尋找有效的生物標志物，以降低PCI 術后ISR的發生。研究［14-17］ 顯示：C 反應蛋白和白細胞介素等免疫炎癥因子、T 淋巴細胞及B 淋巴細胞等免疫細胞對ISR 的發生發展起重要作用。此外， 目前RNA-seq 與生物信息學技術結合，已成為研究基因交叉網絡和識別候選生物標志物的重要技術，可用于探索ISR 可能的發病機制和新的治療靶點。

本研究通過GEO 數據庫，采用生物信息學技術分析ISR 中的免疫炎癥基因及免疫浸潤特征，結果顯示：篩選的DEIRGs 與ISR 的發生發展有密切關聯。脂質鏈酶10 （lipocalin 10， Lcn10）［18］、主要組織相容性復合體Ⅰ 類多肽相關序列A （majorhistocompatibility complex class Ⅰ polypeptiderelatedsequence A，MICA）［19］ 和白細胞介素17 受體E （interleukin-17 receptor E ，IL-17RE）［20］ 等可通過調控免疫炎癥參與ISR 的發生發展。研究［19］顯示：MICA 與各種炎癥和自身免疫性疾病有關，可作為評估急性心肌梗死等心血管疾病嚴重程度的指標。Lcn10 可能在心血管疾病發病機制中發揮關鍵作用［21-22］。

本研究結果顯示：DEIRGs 主要定位于胞外區和細胞質膜，可能通過參與PI3K/AKT 和TGF-β 等信號通路調控信號受體結合及細胞因子受體活性，參與防御反應和免疫反應等過程。PI3K/AKT 和TGF-β 等信號通路通過炎癥等途徑影響血管損傷后的新生內膜增生，進而影響ISR 的發生發展［14-17，23］。研究［24］ 發現：半夏可通過調控PI3K/AKT 信號通路，抑制炎癥反應和增加內皮祖細胞（endothelialprogenitor cells，EPCs） 百分率，進而減少動脈粥樣硬化大鼠頸動脈損傷后的新生內膜增生。PI3K/AKT 信號通路促進血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs） 的周期進展，并在損傷誘導的新生內膜增生和ISR 中起重要作用［25］。TGF-β1 可能參與誘導內膜增厚，在動脈血管損傷后，TGF-β1 上調導致各種下游途徑激活，進而刺激VSMCs 的增殖和遷移及局部細胞外基質蛋白的產生，導致ISR 的發生。抑制TGF-β1 活性可減少動脈血管損傷后的內膜增厚， 從而減輕ISR［26-27］。因此， DEIRGs 可能通過PI3K/AKT 和TGF- β 等信號通路調控免疫炎癥及PCI 術后的血管內新生內膜增生，進而影響ISR 的發生發展。

本研究結果顯示：CD19 具有最高節點，可作為Hub 基因。CD19 作為在B 淋巴細胞上表達的免疫球蛋白超家族的成員， 是 B 細胞抗原受體（B cell antigen receptor，BCR） 信號轉導的關鍵共受體， 可通過調控免疫炎癥促進ISR 的發生［28-29］。研究［30］ 顯示：PI3K 是CD19 下游的效應分子，二者結合促進了PI3K 信號通路的激活。CD19 與BCR 結合后，B 淋巴細胞中PI3K 信號通路的數量是未結合B 淋巴細胞中的10 倍［31］。繪制CD19 的ROC 曲線， 結果顯示： AUC 為0. 92， 提示CD19可作為診斷ISR 的生物標志物。KEGG 信號通路富集分析結果顯示： CD19 富集于PI3K/AKT 通路中，提示CD19 可能通過調控PI3K/AKT 信號通路促進ISR 的發生發展。

免疫細胞在ISR 的發生發展中起重要作用，免疫和炎癥反應在血管機械損傷前期即被激活，該過程通常伴隨多種細胞因子和炎癥介質的釋放，可誘導T 淋巴細胞（包括Tfh 細胞和CD8+T 淋巴細胞）、B 淋巴細胞和巨噬細胞等向損傷部位趨化、黏附、聚集或極化， 進而共同導致新生內膜的增生，最終形成ISR［32-33］。本研究結果顯示：與non-ISR 組比較，ISR 組患者Tfh 的免疫細胞浸潤水平升高。Tfh 細胞是為CD4+T 淋巴細胞亞群的特殊類型的輔助性T 淋巴細胞， 可促進B 淋巴細胞成熟，發揮免疫作用。研究［34］ 顯示：在ISR 小鼠模型中，Tfh促進ISR 的發生發展，而Tfh缺乏的小鼠ISR得到改善。PREITE 等［35］ 研究顯示：PI3K 的激活是Tfh 細胞發育所必需的條件， 選擇性消除PI3K募集的p85 結合位點突變可導致Tfh 細胞形成缺陷。

綜上所述， Hub 基因CD19 可能通過調控PI3K/AKT 信號通路的激活影響Tfh 和B 淋巴細胞，促進ISR 的發生發展。CD19 可作為診斷ISR 的生物標志物。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：馮玉飛參與研究設計、論文構思、數據分析和論文撰寫，金珊參與數據采集分析，王玉冰和魯印飛參與論文審閱，龐麗娟和劉克堅參與研究項目指導。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（82060054）；新疆生產建設兵團科技局財政科技計劃項目（2020BC003）；廣東省湛江市科技局科技發展基礎研究專題專項（2022A01028）；廣東省湛江市科技局疾病防治重點項目（2022A01103）；2022 年度湛江中心人民醫院院級高層次人才科研啟動經費項目（2022A15，2022A16）；石河子大學科研項目（ZZZC202022A）；新疆維吾爾自治區研究生教育創新計劃項目（XJ2022G110）；石河子大學第一附屬醫院博士基金項目（BS202205）