光交聯(lián)絲素蛋白生物3D打印墨水的研究進(jìn)展

摘要： 絲素蛋白具有生物相容性高、生物降解性可控及力學(xué)性能可調(diào)等優(yōu)異特性，是一種極具應(yīng)用潛力的生物3D打印墨水材料。基于光交聯(lián)反應(yīng)的生物材料加工技術(shù)具有條件溫和、高效可控等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前生物3D打印領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向。文章以墨水性能要求為主線，先從流變性能出發(fā)介紹了適合光交聯(lián)絲素蛋白生物3D打印的打印方式，再從光交聯(lián)反應(yīng)性出發(fā)討論了絲素蛋白的光敏改性方法及光誘導(dǎo)交聯(lián)機(jī)制，然后從生物相容性出發(fā)介紹了輻照光源與光引發(fā)劑的發(fā)展，總結(jié)了絲素蛋白及其與合成、天然高分子材料復(fù)配墨水在光交聯(lián)生物3D打印領(lǐng)域的應(yīng)用，并論述了光交聯(lián)絲素蛋白生物墨水在制備、發(fā)展方向和應(yīng)用過程中所面臨的挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵詞： 生物3D打印;絲素蛋白;光交聯(lián);生物墨水;流變性能

中圖分類號： TS141.8; TQ340.643

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號： 10017003（2024）08期數(shù)0050起始頁碼10篇頁數(shù)

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2024.08期數(shù).006（篇序）

收稿日期： 20231110;

修回日期： 20240618

基金項(xiàng)目： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（52103068）;浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY21E030019）;蘇州大學(xué)紡織行業(yè)絲綢功能材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（SDHY2234）

作者簡介： 潘小鵬（1999），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榻z蛋白生物材料。通信作者：黃益，副教授，yihuang@zstu.edu.cn。

生物3D打印基于增材制造原理，通過定位裝配含生物材料和細(xì)胞單元的生物墨水，以實(shí)現(xiàn)仿生功能組織或人工器官的快速成型，在生物醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域極具應(yīng)用前景。其中，生物墨水材料的選擇是滿足生物3D打印仿生結(jié)構(gòu)對生物安全性、精細(xì)度及穩(wěn)定性等要求的關(guān)鍵。理想的生物墨水不僅需要適宜的流變性以保證打印流暢性和結(jié)構(gòu)精細(xì)度［1-2］，同時需具備快速且充分的交聯(lián)反應(yīng)以保證打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和強(qiáng)度。此外，生物墨水材料良好的生物相容性和可調(diào)的生物降解性也是確保細(xì)胞增殖分化和組織再生的必要前提［3］。

絲素蛋白（Silk Fibroin，SF）是蠶絲經(jīng)溶解、透析制得的一種天然蛋白材料，經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)可獲得不同形態(tài)的生物功能材料，具有優(yōu)異的生物相容性、可調(diào)的機(jī)械性能等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。然而，常規(guī)的物理交聯(lián)（加熱、超聲等）、化學(xué)交聯(lián)（戊二醛、京尼平等）及生物酶催化交聯(lián)（酪氨酸酶、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶等［4-5］）方式，均難以兼顧生物3D打印對SF生物墨水交聯(lián)成型效率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及成型材料生物安全性等綜合要求［6］。

1 光交聯(lián)絲素蛋白生物墨水的性能要求

光交聯(lián)SF的凝膠化作用可快速固定其打印結(jié)構(gòu)，同時可避免因細(xì)胞沉積而導(dǎo)致的噴嘴堵塞和細(xì)胞分布不均等問題［7-9］。用于生物3D打印的光交聯(lián)SF墨水需滿足以下要求：1） 適宜的流變性能以保證細(xì)胞在SF墨水打印前、中、后的高存活率及打印流暢性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;2） 高效的光交聯(lián)反應(yīng)性以實(shí)現(xiàn)SF打印結(jié)構(gòu)的快速成型，并賦予其在體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度要求;3） 良好的生物相容性以使細(xì)胞在打印結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)附著、增殖、分化，同時植入后無先天性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

1.1 擠出式生物3D打印

擠出式生物3D打印是利用氣壓或機(jī)械力作用將生物墨水從噴嘴擠出，并在移動過程中層層堆疊進(jìn)而構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)的一種打印方式，需要對生物墨水的黏度、表面張力、剪切模量、施加壓力/剪切力、線性流動速度及噴嘴橫截面積等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確保連續(xù)墨水細(xì)絲的打印流暢性［10-12］。受絲素蛋白溶液本身流變學(xué)特性限制，純絲素蛋白生物墨水的擠出式生物3D打印極具挑戰(zhàn)，如圖1所示。當(dāng)前研究主要通過復(fù)配其他組分（明膠、海藻酸鈉等）提高SF溶液黏度并賦予其剪切稀化特性和觸變性［13］。光交聯(lián)技術(shù)多被用于提高打印后材料的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和穩(wěn)定性，即后固化交聯(lián)反應(yīng)（圖2）。經(jīng)后固化處理的打印材料，其黏彈性能與其力學(xué)性能直接相關(guān)，并被用于評估打印材料的應(yīng)用性能特征，如振幅掃描下的線性黏彈區(qū)反映了打印材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗形變能力;頻率掃描下的黏彈區(qū)反映了在不同時間尺度下材料的強(qiáng)度特性。

除此之外，黃益等［14］提出了一種適用于生物3D打印的原位光交聯(lián)技術(shù)，以克服純絲素蛋白溶液在擠出式打印中的流變學(xué)特性限制。該技術(shù)通過調(diào)控光交聯(lián)效率和水凝膠細(xì)絲擠出速率，使得絲素蛋白前驅(qū)液在透明噴嘴內(nèi)進(jìn)行原位光交聯(lián)固化，實(shí)現(xiàn)了純SF水凝膠細(xì)絲的連續(xù)加工，進(jìn)而構(gòu)建了無細(xì)胞的純SF三維結(jié)構(gòu)水凝膠支架。該技術(shù)對初始絲素蛋白溶液黏度、觸變性等要求較低，且具有連續(xù)化加工優(yōu)勢，但對輻照條件、擠出速率與交聯(lián)反應(yīng)速率的調(diào)控和同步適配性要求較高。

1.2 光固化式生物3D打印

光固化式生物3D打印是以光誘導(dǎo)生物墨水發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過控制高精度光源的點(diǎn)、線或面投影來實(shí)現(xiàn)生物墨水特定單層形狀的交聯(lián)固化，并通過平臺移動實(shí)現(xiàn)層層累積，主要類型包括：立體光刻（Stereolithography，SLA）技術(shù)和數(shù)字光處理（Digital Light Processing，DLP）技術(shù)，如圖3所示。與SLA的激光點(diǎn)光源技術(shù)不同，DLP技術(shù)使用對細(xì)胞生物相容性更好的可見光LED光源，且投影式面光源的應(yīng)用可顯著降低加工時間，有效避免細(xì)胞沉降，在絲素蛋白生物光固化3D打印中更具優(yōu)勢。由于光固化式生物3D打印屬于無噴嘴、非接觸式打印技術(shù)，因此生物墨水無需剪切稀化、觸變性等流變特性。為保證打印精細(xì)度，其墨水需具有較高的流動性，其黏度應(yīng)控制在較低范圍（1～300 mPa·s）［15-16］。對光固化過程中SF墨水流變特性的實(shí)時監(jiān)測可有效評估墨水的光交聯(lián)反應(yīng)動力學(xué)。在固定頻率和振幅的振蕩剪切過程中，

甲基丙烯酸酯改性絲素蛋白（Sil-MA）墨水材料的儲能模量G′會隨引發(fā)劑用量、光照強(qiáng)度、Sil-MA濃度等參數(shù)的增加而增大，意味著暴露在輻照光下的時間越長，Sil-MA墨水的光交聯(lián)程度越大，如圖4［17］所示。對光固化后SF凝膠材料的流變性能進(jìn)行測試，有助于了解水凝膠材料的物理性能和結(jié)構(gòu)信息，以評估其應(yīng)用性能。該測試可通過不同振幅或頻率下的振蕩試驗(yàn)來檢測評估，其中儲能模量G′、損耗模量G″和損耗因子tan δ分別表示SF水凝膠的彈性部分、黏性部分及兩者相對強(qiáng)弱。通過考察振幅掃描下的模量信息，可確定凝膠材料的線性黏彈區(qū)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。通過考察頻率掃描下的模量信息，可評估凝膠材料的交聯(lián)程度和使用壽命。此外，理論上凝膠點(diǎn)處tan δ與頻率無關(guān)，常用于確定溫敏凝膠材料的凝膠點(diǎn)溫度。類似地，對不同光固化時間下的凝膠材料進(jìn)行頻率掃描，也將有助于確定SF光固化墨水的凝膠轉(zhuǎn)變點(diǎn)。

1.3 多光子光刻式生物3D打印

多光子光刻（Multiphoton Lithography，MPL）技術(shù)可通過脈沖激光在限域空間中誘導(dǎo)材料的聚合交聯(lián)反應(yīng)直接寫入高分辨率的復(fù)雜3D微結(jié)構(gòu)。脈沖激光通過聚焦到含有光引發(fā)劑和光固化組分（即負(fù)性光致抗蝕劑）的溶液中，引起光引發(fā)劑發(fā)生多光子吸收進(jìn)而誘導(dǎo)光固化組分發(fā)生局部聚合或交聯(lián)。經(jīng)編程激光移動路徑可在空間分辨率低于50 nm情況下制備微小體積的復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)（組織工程支架、標(biāo)志性建筑和藝術(shù)的微型復(fù)制品）［18］。近年來，將這種微納米級加工技術(shù)與天然生物材料（蛋白質(zhì)、肽和DNA）相結(jié)合的研究受到關(guān)注。例如，生物相容的合成多功能團(tuán)單體（PEGDA）和光反應(yīng)性天然大分子（絲素蛋白）均可通過MPL技術(shù)實(shí)現(xiàn)高分辨率3D水凝膠微結(jié)構(gòu)的制備。此外，多光子光刻的墨水體系黏度一般較低，且黏度與光刻成型結(jié)構(gòu)厚度相關(guān)，通常在7～22 mPa·s［19］。

基于絲素蛋白自身的光耦合交聯(lián)特性，在優(yōu)選的光引發(fā)劑和激光光源下可通過MPL技術(shù)獲得具有良好生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度和光學(xué)透明度的絲素蛋白水凝膠微體系結(jié)構(gòu)。Dickerson等［20］以三聯(lián)吡啶釕Ru（bpy）2+3與過硫酸鉀為光引發(fā)劑，在配備100 mW飛秒固體激光器（780 nm）的納米3D打印機(jī)上實(shí)現(xiàn)了納米級拱橋結(jié)構(gòu)絲素蛋白光交聯(lián)水凝膠的3D打印，為微型尺寸絲素基生物傳感元件的開發(fā)提供了新的可能性。Sun等［21］以亞甲基藍(lán)為光引發(fā)劑，40 W白熾燈為輻照光源，通過非接觸和無掩模的飛秒激光直寫技術(shù)（Femtosecond Laser Direct Writing，F(xiàn)sLDW），實(shí)現(xiàn)了多種“模塊化”家蠶絲素蛋白墨水的多光子光刻（圖5）［21］。

2 絲素蛋白墨水的光交聯(lián)反應(yīng)及性能

生物墨水的光交聯(lián)成型是在光誘導(dǎo)條件下墨水由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z的過程，不僅影響生物墨水的流變性，而且決定打印結(jié)構(gòu)的物理機(jī)械性能。適當(dāng)?shù)?strong style="display:none;">13457660922d99c8dddf52c0deda67a3光交聯(lián)成型可以防止打印層坍塌，利于打印后結(jié)構(gòu)的保真度和完整性。若打印結(jié)構(gòu)交聯(lián)過弱，則打印結(jié)構(gòu)難以維持形狀穩(wěn)定，材料降解速率過快;反之，則會降低其吸液溶脹性和物質(zhì)交換速率，甚至影響細(xì)胞活力。因此，調(diào)控適宜的光交聯(lián)程度是平衡絲素蛋白交聯(lián)成型結(jié)構(gòu)與應(yīng)用性能的關(guān)鍵［22］。對于絲素蛋白生物墨水體系而言，通常需對絲素蛋白進(jìn)行光敏改性、引入光敏高分子材料或利用其自身的光化學(xué)反應(yīng)特性，在高效光源和光引發(fā)體系的作用下，誘導(dǎo)產(chǎn)生引發(fā)種并完成絲素蛋白大分子間的交聯(lián)成型。

2.1 絲素蛋白的光敏改性

為賦予絲素蛋白光聚合反應(yīng)能力，國內(nèi)外研究者主要采用含烯雙鍵光敏改性劑對絲素蛋白側(cè)鏈上的氨基、羥基或羧基進(jìn)行接枝改性，后經(jīng)光引發(fā)的自由基聚合反應(yīng)完成快速的交聯(lián)成型。適用于絲素蛋白的幾種典型光敏改性方法如圖6所示。

Bessonov等［23］選用甲基丙烯酸酐（MA）對絲素蛋白側(cè)鏈上的氨基進(jìn)行修飾以賦予其光聚合交聯(lián)性能，相較于乙醇誘導(dǎo)物理交聯(lián)絲素蛋白，MA修飾后的絲素蛋白在凝膠強(qiáng)度（480 kPa）和成型時間（10～20 min）上均具有顯著優(yōu)勢。然而，在SF接枝MA的反應(yīng)過程中會生成酸性副產(chǎn)物甲基丙烯酸，體系pH值的降低易導(dǎo)致絲素蛋白發(fā)生凝膠變性［24］。Kim等［17］選用甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）作為改性劑，通過GMA的環(huán)氧開環(huán)機(jī)制在絲素蛋白側(cè)鏈上引入甲基丙烯酰基，避免了酸性副產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，GMA還能與絲素蛋白分子中的羥基和羧基發(fā)生反應(yīng)，通過酯交換機(jī)制進(jìn)一步促

進(jìn)絲素蛋白的甲基丙烯酰化［25］。改性后的絲素蛋白溶液可作為打印墨水，在紫外光誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了高分辨、高穩(wěn)定性的三維結(jié)構(gòu)水凝膠。Zhou等［26］則利用異氰酸酯的親核加成反應(yīng)原理，以甲基丙烯酸異氰酸乙酯為改性劑對絲素蛋白側(cè)鏈上的氨基和羥基進(jìn)行改性，并與馬來酰化殼聚糖在紫外光誘導(dǎo)下共聚交聯(lián)得到適用于關(guān)節(jié)軟骨的復(fù)合凝膠支架材料。上述基于烯雙鍵自由基聚合的反應(yīng)方式，雖可實(shí)現(xiàn)改性絲素蛋白的快速交聯(lián)，但其自由基聚合交聯(lián)過程仍存在氧阻及反應(yīng)可控性問題［27］。為此，Hoorick等［28］將“點(diǎn)擊化學(xué)”引入改性絲素蛋白的光交聯(lián)反應(yīng)，通過降冰片烯結(jié)構(gòu)與巰基化交聯(lián)劑的邁克爾加成反應(yīng)實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。與常規(guī)的自由基聚合方式不同，基于巰基烯的邁克爾加成反應(yīng)不受氧阻影響，并可實(shí)現(xiàn)在溫和反應(yīng)條件下的快速交聯(lián)。上述光敏改性技術(shù)雖可滿足絲素蛋白實(shí)時交聯(lián)效率的要求，但仍存在接枝率、接枝分布等反應(yīng)可控性問題。

2.2 光誘導(dǎo)絲素蛋白的耦合交聯(lián)

將烯雙鍵等光敏基團(tuán)接枝于絲素蛋白氨基酸側(cè)基，可賦予絲素蛋白光聚合交聯(lián)性能。然而，絲素蛋白的光敏改性過程不可避免存在改性劑、催化劑等化學(xué)殘留，使光敏改性策略存在不同程度的生物相容性風(fēng)險(xiǎn)。絲素蛋白自身結(jié)構(gòu)中雖不具備可直接光聚合的光敏性基團(tuán)，但某些活性側(cè)基可通過光誘導(dǎo)下的氧化還原或自由基引發(fā)等方式原位產(chǎn)生自由基活性位點(diǎn)［29］，實(shí)現(xiàn)絲素蛋白的自交聯(lián)反應(yīng)。作為一種新型的絲素蛋白光誘導(dǎo)自交聯(lián)技術(shù)，其無需對絲素蛋白進(jìn)行光敏改性，從根本上避免了化學(xué)殘留和接枝可控性等問題。值得注意的是，由于絲素蛋白氨基酸側(cè)基的反應(yīng)活性有限，絲素蛋白的自交聯(lián)反應(yīng)通常需輔以高能紫外光或者高效光敏引發(fā)體系。此外，由于紫外光的輻射危害問題，近年來以可見光作為輻照光源，配合高效光敏引發(fā)體系的策略受到關(guān)注，如表1所示。

釕（Ⅱ）多吡啶配合物因其激發(fā)態(tài)壽命長、室溫穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于可見光催化領(lǐng)域。其中，將三聯(lián)吡啶釕Ru（bpy）2+3與過硫酸鉀（KPS）、過硫酸鈉（SPS）或過硫酸銨（APS）等氧化劑復(fù)合，可構(gòu)建可見光（400～550 nm）引發(fā)體系，誘導(dǎo)絲素蛋白的自交聯(lián)反應(yīng)。Huang等［37］研究了Ru（bpy）2+3/KPS作用下的絲素蛋白光誘導(dǎo)自交聯(lián)機(jī)理（圖7）。藍(lán)光（450 nm）誘導(dǎo)下，Ru（bpy）2+3吸收一定能量的光子躍遷至其激發(fā)態(tài)Ru（Ⅱ）*，后與過硫酸鹽氧化劑發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成具有強(qiáng)氧化性的Ru（bpy）3+3、SO-4·等。在上述強(qiáng)氧化性物質(zhì)的作用下，SF酪氨酸結(jié)構(gòu)的酚氧位、苯環(huán)鄰、間位可產(chǎn)生活性自由基，經(jīng)自由基間的耦合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)SF大分子間的共價交聯(lián)。此外，該課題組還發(fā)現(xiàn)當(dāng)Ru（bpy）2+3摩爾濃度（>0.05 mmol/L）過高時會產(chǎn)生“濾鏡效應(yīng)”，導(dǎo)致SF的光交聯(lián)效率下降［14］。

Cui等［38］將釕（Ⅱ）多吡啶配合物和過硫酸鈉（SPS）介導(dǎo)的絲素蛋白光交聯(lián)與辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫（H2O2）構(gòu)成的酶促交聯(lián)進(jìn)行了對比，結(jié)果表明以Ru（bpy）2+3為引發(fā)劑的快速光交聯(lián)可以控制絲素蛋白中β-折疊的形成，使打印結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能更加穩(wěn)定，而酶促交聯(lián)的絲素蛋白打印結(jié)構(gòu)易發(fā)生塌陷。同時，也有研究者指出釕多吡啶配合物/過硫酸鹽體系中未完全反應(yīng)的Ru（bpy）2+3和過硫酸鹽具有潛在的細(xì)胞毒性，需對其含量加以控制［39］。

核黃素（RF）即維生素B2，是一種廣泛存在于動植物中的天然維生素，其中黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是核黃素的兩種生物活性形式。由于FMN具有較高的水溶性，因此常作為水溶性光引發(fā)劑用于水凝膠材料的制備［40］。核黃素可作為單組分光引發(fā)劑誘導(dǎo)絲素蛋白酪氨酸側(cè)基發(fā)生自由基的耦合反應(yīng)，通過單線態(tài)氧氧化和直接氧化兩條路徑實(shí)現(xiàn)絲素蛋白的光誘導(dǎo)自交聯(lián)，如圖8［36］所示。

在單線態(tài)氧的氧化路徑中，光引發(fā)劑（PI）受到特定波長光的激發(fā)形成激發(fā)態(tài)（PI*），后與氧氣發(fā)生電子轉(zhuǎn)移生成單線態(tài)氧（1O2）和基態(tài)光引發(fā)劑（PI），單線態(tài)氧（1O2）和絲素蛋白分子上的酪氨酸殘基（TH）發(fā)生反應(yīng)生成酪氨自由基，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)二酪氨結(jié)構(gòu)的共價交聯(lián);而在直接氧化路徑中，激發(fā)態(tài)光引發(fā)劑（PI*）與絲素蛋白分子上的酪氨酸殘基（TH）進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，形成酪氨自由基（T·）和光引發(fā)劑自由基（PI-·），進(jìn)而耦合反應(yīng)生成二酪氨共價交聯(lián)結(jié)構(gòu)。雖然核黃素光引發(fā)劑具有良好的生物安全性，但由于其引發(fā)效率較低，往往需要較長時間（>30 min）才能完成絲素蛋白的凝膠化過程［35］，不利于其在生物3D打印中的應(yīng)用。針對單組分光引發(fā)劑引發(fā)效率低的問題，孫廣東等［36］將光敏增效劑二芳基六氟磷酸碘鎓鹽（DPI）分別與核黃素磷酸鈉（FMN）、姜黃素（CC）、樟腦醌（CQ）及曙紅Y（EY）組建4種雙組分高效藍(lán)光引發(fā)體系，光敏增效劑DPI的加入，可顯著提高二組分體系的光引發(fā)效率。這歸因于DPI在直接氧化路徑中不僅可將光引發(fā)劑自由基（PI-·）氧化成基態(tài)光引發(fā)劑（PI）再次進(jìn)入引發(fā)過程，減少對體系光引發(fā)劑的消耗，同時還可新增活性自由基（X·），顯著縮短了絲素蛋白的凝膠時間（約97 s）。

3 光交聯(lián)絲素蛋白墨水的生物相容性

生物相容性是評估打印結(jié)構(gòu)仿生能力的重要標(biāo)準(zhǔn)，要求生物墨水與負(fù)載細(xì)胞生存微環(huán)境盡可能相似，并在打印期間和打印后具有細(xì)胞活力，以使細(xì)胞在打印結(jié)構(gòu)中增殖、遷移、分化［9，41］。絲素蛋白本身具有良好的生物相容性，可在不引起免疫反應(yīng)的情況下與生物系統(tǒng)發(fā)生良好的信號傳遞作用。此外，絲素蛋白最終的降解產(chǎn)物是可被生物體吸收的氨基酸和寡肽，其豐富的側(cè)基種類可為細(xì)胞的識別、黏附提供位點(diǎn)，并促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化［42］。因此，光交聯(lián)絲素蛋白墨水體系潛在的生物相容性問題主要涉及輻照光源和光引發(fā)劑體系兩方面。

早期的光交聯(lián)技術(shù)主要采用紫外光作為輻射光源，雖然其交聯(lián)效率高，但高強(qiáng)紫外線（<365 nm）存在輻射和臭氧危害，亦可導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞失活。隨后，研究人員嘗試采用近紫外光區(qū)（395～405 nm）藍(lán)紫光作為DLP實(shí)時光固化或擠出式后固化的輻照光源，在保證交聯(lián)效率的同時極大改善了細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)。目前，更為安全的可見光（>405 nm）輻照光源，如450 nm的藍(lán)光LED、523 nm的綠光LED，成為3D生物打印領(lǐng)域新的發(fā)展方向［43］。

選擇與輻照光源相匹配的光引發(fā)劑是實(shí)現(xiàn)高效3D打印的關(guān)鍵因素之一。目前，在生物3D打印領(lǐng)域中較為常用的光引發(fā)劑2-羥基-4-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮（I2959）和苯基（2，4，6-三甲基苯甲酰基）磷酸鋰鹽（LAP）具有較好的水溶性和生物相容性，可適用于烯雙鍵改性絲素蛋白墨水的生物3D打印［9］。然而，這些引發(fā)劑的吸收光譜與可見光光源匹配性不佳，限制了其在可見光誘導(dǎo)絲素蛋白耦合交聯(lián)生物打印中的應(yīng)用。針對此問題，Xie等［44］開發(fā)了基于525 nm光源的旋轉(zhuǎn)投影式體積增材制造（VAM）系統(tǒng)，以Ru（bpy）2+3/SPS為可見光引發(fā)體系，實(shí)現(xiàn)了全絲綢（絲膠和絲素）和純絲素蛋白墨水的高效生物3D打印。打印的絲素蛋白螺紋釘支架具有良好的生物相容性、細(xì)胞整合和骨形成潛力。此外，盡管相較于Ru（bpy）2+3，RF表現(xiàn)出較低的光引發(fā)交聯(lián)效率，但仍被用作可見光引發(fā)劑誘導(dǎo)絲素蛋白光耦合交聯(lián)，通過DLP打印實(shí)現(xiàn)了高精細(xì)度（～200 μm）、可藥物遞送的絲素蛋白微針凝膠的生物3D打印［45］。

4 光交聯(lián)絲素蛋白生物墨水體系

生物墨水的組分設(shè)計(jì)是生物3D打印的關(guān)鍵，需要兼顧生物相容性、可打印性、機(jī)械性能等要求。然而，絲素蛋白雖具有優(yōu)異的生物相容性，但由于自身流變性能的限制，單一組分絲素蛋白墨水材料主要適用于投影式和光刻式3D打印。通過對絲素蛋白體系進(jìn)行改性或復(fù)配，可進(jìn)一步調(diào)控其打印流變性、光敏反應(yīng)性及成型結(jié)構(gòu)強(qiáng)度等性能，以滿足更多打印方式的要求。

4.1 單組分絲素蛋白

目前，研究者常采用化學(xué)改性方法對絲素蛋白進(jìn)行光敏接枝，以賦予其光交聯(lián)性能，進(jìn)而開發(fā)單組分光交聯(lián)絲素蛋白生物墨水。Hong等［46］選用甲基丙烯酸縮水甘油酯對絲素蛋白大分子中的氨基進(jìn)行接枝改性，反應(yīng)制備了適用于DLP生物3D打印的甲基丙烯酸化絲素蛋白（Silk-GMA）生物墨水，并對其在軟骨組織工程的應(yīng)用進(jìn)行了探索。研究表明，該生物墨水具有良好的生物相容性和機(jī)械性能，將負(fù)載軟骨細(xì)胞的Silk-GMA生物墨水通過DLP打印機(jī)打印成高精度的仿生氣管，并將其植入氣管損傷的家兔體內(nèi)可促進(jìn)缺損軟骨組織的再生。Ajiteru等［47］則將改性的Silk-GMA作為墨水材料開發(fā)了適用于DLP生物3D打印的磁性墨水。結(jié)果表明該磁性墨水具有較佳的可打印性和機(jī)械強(qiáng)度，且由該磁性墨水打印制備的生物反應(yīng)器可在磁場的作用下誘導(dǎo)小鼠成肌細(xì)胞分化。

相較于光敏改性絲素蛋白，光誘導(dǎo)耦合自交聯(lián)型絲素蛋白墨水多用于微結(jié)構(gòu)/精細(xì)結(jié)構(gòu)的生物3D打印。Applegate等［48］選用核黃素作為一種生物相容性良好的藍(lán)光引發(fā)劑，采用掩膜光刻法制備了高分辨率（50 μm）圖案化絲素蛋白水凝膠。該水凝膠可選擇性粘附至角膜上以改變眼球曲率，對于近視、圓錐角膜等眼部疾病具有無風(fēng)險(xiǎn)的視力矯正治療前景。Shina等［49］則將絲素蛋白溶液與0.5 mmol/L核黃素混合制備了用于DLP生物3D打印的墨水，并對投影圖像進(jìn)行灰度處理以消除打印結(jié)構(gòu)邊界處的混疊現(xiàn)象，最后通過可見光投影實(shí)現(xiàn)SF微針（～200 μm）的交聯(lián)成型。此外，通過新熒光峰的產(chǎn)生表征了輻照過程中二酪氨酸結(jié)構(gòu)的形成，且該結(jié)構(gòu)隨著絲素蛋白濃度的提高而增加。

4.2 絲素蛋白/合成高分子

絲素蛋白雖具有諸多優(yōu)良性能，但純絲素蛋白也存在力學(xué)性能差、降解速度快等問題，限制了其在生物醫(yī)用材料中的應(yīng)用。合成高分子材料具有種類豐富、機(jī)械性能可調(diào)、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，將其與絲素蛋白材料復(fù)合是改善或解決上述問題的有效策略。已用于光交聯(lián)絲素蛋白墨水材料的復(fù)配改性的合成高分子材料主要包括聚乙二醇（PEG）［50］、聚乙烯醇（PVA）［51］等。

聚乙二醇是由聚環(huán)氧乙烷與水通過加聚反應(yīng)制得，具有水溶性高、無毒、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，同時其易于化學(xué)修飾，可通過甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯進(jìn)行光敏接枝改性賦予其光交聯(lián)反應(yīng)性能。Kwak等［52］將四臂聚乙二醇與丙烯酰氯在室溫黑暗環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)后制得四臂聚乙二醇丙烯酸酯（PEG4A），然后將其與絲素蛋白復(fù)合開發(fā)了適于DLP生物3D打印的生物墨水，可用于人工皮膚的構(gòu)建。研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在該水凝膠結(jié)構(gòu)中顯示出很高的代謝活性，同時，該生物墨水在可見光輻照下會引發(fā)PEG4A與絲素蛋白形成一種互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠（圖9）。與純PEG4A水凝膠相比，絲素蛋白的添加不僅提高了SF/PEG4A水凝膠的生物相容性，而且可通過絲素蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)的形成進(jìn)一步提高SF/PEG4A復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能。

4.3 絲素蛋白/天然高分子

天然多糖高分子（透明質(zhì)酸鈉、海藻酸鈉、殼聚糖及纖維素等）和天然蛋白質(zhì)高分子（膠原、明膠和大豆蛋白等）均具有良好的生物相容性、生物降解性及來源廣泛等特點(diǎn)，將其與絲素蛋白復(fù)配開發(fā)生物墨水，一方面可豐富復(fù)合生物墨水的交聯(lián)方式，顯著提升其可打印性和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，另一方面也可較大程度地改善其生物相容性（圖10）。

天然高分子材料可通過氫鍵、范德華力等物理作用來調(diào)控絲素蛋白生物墨水的打印流變性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［53］。Dorishetty等［54］以Ru（bpy）2+3/APS作為光引發(fā)體系，制備了可光交聯(lián)的納米纖維素/絲素蛋白復(fù)合生物墨水，并對其流變性能和可打印性進(jìn)行了研究。通過擠出式3D打印和逐層光固化實(shí)現(xiàn)了納米纖維素/絲素蛋白復(fù)合水凝膠支架的構(gòu)建。研究表明，細(xì)菌纖維素（BC）、纖維素納米纖維（CNF）和纖維素納米晶（CNC）等不同類型納米纖維素可分別改善絲素蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能、生物相容性和可打印性，這對納米纖維素用于軟組織和硬組織的潛力提出了新的見解。

為進(jìn)一步改善絲素蛋白復(fù)合墨水的光交聯(lián)特性，改善打印材料的物理機(jī)械性能，研究者還對天然高分子進(jìn)行光敏改性，經(jīng)光交聯(lián)構(gòu)建雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)合凝膠體系。Kim等［55］將海藻酸鈉和絲素蛋白分別進(jìn)行酪氨改性和甲基丙烯酸改性，以RF/SPS為光引發(fā)體系，制備可光交聯(lián)的絲素蛋白/海藻酸鈉復(fù)合改性生物墨水。為調(diào)控復(fù)合生物墨水的可打印性，采用CaCO3和D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（GDL）作為離子交聯(lián)劑對復(fù)合生物墨水進(jìn)行預(yù)交聯(lián)。打印完成后，在444 nm可見光下對打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行光交聯(lián)后固化，可進(jìn)一步提高打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。研究表明，改性絲素蛋白用量的增加有利于改善復(fù)合生物墨水的細(xì)胞親和力，將負(fù)載NIH 3T3成纖維細(xì)胞的墨水打印成支架結(jié)構(gòu)培養(yǎng)7 d后，其負(fù)載細(xì)胞仍可表現(xiàn)出較高的細(xì)胞活力和增殖能力。

此外，基于酪氨酸殘基間的光誘導(dǎo)耦聯(lián)反應(yīng)，研究者開發(fā)出了可共價交聯(lián)的天然高分子/絲素蛋白復(fù)合生物墨水。黃益等［56］以天然明膠作為復(fù)合組分，一方面通過其增稠性和溫敏性調(diào)控絲素蛋白復(fù)合體系的打印流變性能，另一方面基于絲素蛋白和明膠氨基酸側(cè)基的光化學(xué)反應(yīng)特性，通過藍(lán)光誘導(dǎo)Ru（bpy）2+3/KPS引發(fā)絲素蛋白和明膠結(jié)構(gòu)上酪氨酸的耦合交聯(lián)，形成明膠/絲素蛋白共交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以提高支架的穩(wěn)定性。Dorishetty等［57］制備了大豆蛋白/絲素蛋白復(fù)合生物墨水用于擠出式生物3D打印。利用大豆蛋白和絲素蛋白大分子間的光誘導(dǎo)共交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步提高了大豆蛋白/絲素蛋白共交聯(lián)水凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。此外，復(fù)合體系中絲素蛋白的含量越高，水凝膠中成纖維細(xì)胞的活性越高。

5 結(jié) 語

光交聯(lián)技術(shù)與絲素蛋白快速成型相結(jié)合，顯著改善了絲素蛋白材料在生物3D打印應(yīng)用中的諸多技術(shù)瓶頸問題，尤其是近年來在絲素蛋白光誘導(dǎo)自交聯(lián)理論和技術(shù)上的探索和創(chuàng)新，為絲素蛋白在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的拓展應(yīng)用提供新的技術(shù)策略。盡管當(dāng)前對光交聯(lián)SF生物墨水的開發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)取得了諸多成果，但其臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用仍存在很多挑戰(zhàn)。首先，仍需深入研究并開發(fā)引發(fā)效率高、生物相容性好的新型光引發(fā)劑及其增效復(fù)配技術(shù);其次，絲素蛋白氨基酸側(cè)基的光化學(xué)反應(yīng)特性與自交聯(lián)理論仍需進(jìn)一步明晰，有利于提高光引發(fā)交聯(lián)效率，調(diào)控交聯(lián)結(jié)構(gòu)與性能;第三，開發(fā)隨時間或環(huán)境變化而改變自身結(jié)構(gòu)特性的“智能化”生物醫(yī)用材料，以滿足不同復(fù)雜應(yīng)用領(lǐng)域的多變需求。上述研究工作的開展與深入將為光交聯(lián)絲素蛋白三維成型提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用指導(dǎo)，并最終推動其在臨床醫(yī)學(xué)中的實(shí)際應(yīng)用。

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Research progress of photo-crosslinked silk fibroin 3D bioprinting ink

ZHANG Chi， WANG Xiangrong

PAN Xiaopeng1， L Lingling1， ZHANG Xu1， SUN Guangdong1，2， SHAO Min1， HUANG Yi1，3， SHAO Jianzhong1

（1a.College of Textile Science and Engineering; 1b.Engineering Research Center for Eco-Dyeing & Finishing of Textiles， Ministry of Education， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2.Sericulture and Tea Research Institute， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China; 3.China National Textile and Apparel Council Key Laboratory for Silk Functional Materials and Technology， Soochow University， Suzhou 215123， China）

Abstract： Based on the principle of additive manufacturing， the innovative technology， 3D bioprinting， can realize the rapid prototyping of bionic functional tissues or artificial organs by accurately positioning and assembling bioinks containing biological materials and cell units， bringing unprecedented opportunities to the medical field. Its application prospect is very broad， and it is expected to solve many medical problems and benefit human health. In the complex process of 3D bioprinting， the choice of bio-ink materials is crucial. It is the key to meeting the strict requirements of bio-safety， fineness and stability of 3D bioprinted bionic structures. Silk fibroin stands out as a potential biological 3D printing material due to its high biocompatibility， controllable biodegradability and adjustable mechanical properties and many other excellent properties. It is obtained by dissolving silk and dialysis， and then products that meet the requirements of different applications， such as hydrogels， films and sponges are prepared through physical or chemical crosslinking. Among the many cross-linking methods， compared with conventional physical cross-linking， thermochemical cross-linking and bioenzyme-catalyzed cross-linking， photocrosslinked fibroin hydrogel technology shows unique advantages. The photocrosslinked fibroin hydrogel technology has the characteristics of fast reaction rate， and can complete the crosslinking process in a short time， which greatly improves the work efficiency. Its conditions are milder and less damaging to biological materials and cells， helping to maintain their biological activity. At the same time， the spatiotemporal controllability makes it possible to precisely control the position and time of the crosslinking， thus achieving more fine and complex structures. In addition， the advantage of fewer by-products also reduces the potential harm to the environment and organisms. In this paper， the optical crosslinking technology of silk fibroin materials is the main line to carry out in-depth research and discussion. Based on rheological properties， the printing method suitable for photocrosslinked silk fibroin 3D printing was introduced. Through the in-depth analysis of the rheological properties of materials， the printing parameters can be optimized and the printing precision and quality can be improved. From the perspective of photocrosslinking reactivity， the photosensitive modification method of fibroin and the photoinduced crosslinking mechanism of fibroin were discussed， which is of great significance for understanding and mastering the photocrosslinking process and further improving and optimizing the technology. From the perspective of biocompatibility， the development of irradiation light source and photoinitiator was introduced. Good biocompatibility is an important prerequisite for the application of biological materials in the medical field， and the selection of appropriate irradiation light source and photoinitiator can guarantee this characteristic. Finally， the application of silk fibroin and its composite inks with synthetic and natural polymer materials in the field of photocrosslinked bioprinting was summarized， and the challenges in the preparation， development and application of photocrosslinked silk protein bioprinting were discussed.

Key words： 3D bioprinting; silk fibroin; photo-crosslinking; bioink; rheological properties