黑曲霉J6解鉀條件優化

摘要 ［目的］探索黑曲霉J6對鉀礦粉的最佳解鉀條件。［方法］以查氏培養基為基礎，測定黑曲霉J6對鉀礦粉的解鉀量，通過單因素試驗和正交試驗對黑曲霉J6的解鉀發酵條件進行了優化。［結果］黑曲霉J6解鉀最佳培養基為2%可溶性淀粉、0.5%豆粕、0.003% FeSO4、0.008% ZnSO4；其解鉀的最佳培養條件為培養基初始pH 8.5、培養溫度32 ℃、培養時間28 d、接種量2.5%。［結論］該研究為有效利用微生物轉化低品位礦物鉀技術和生物鉀肥的生產提供了參考。

關鍵詞 黑曲霉；含鉀礦物；解鉀條件；優化；解鉀量

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of Potassium Dissolving Conditions of Aspergillus niger J6

YUE Dan-dan，WANG Xue-yan，YANG Wen-ling et al

（Hennan Academy of Science Institute of Biology Co.，Ltd.，Zhengzhou，Henan 450008）

Abstract ［Objective］To explore the optimal potassium dissolving conditions of Aspergillus niger J6 on potassium mineral powder.［Method］Based on Cha’s culture medium， the potassium dissolving capacity of A. niger J6 on potassium mineral powder was determined. The single-factor test and orthogonal design test were used to optimize the potassium dissolving fermentation conditions of A. niger J6. ［Result］The optimum potassium-dissolving medium for A. niger J6 was 2% soluble starch， 0.5% soybean meal， 0.003% FeSO4 and 0.008% ZnSO4.The optimal culture conditions for its potassium dissolution were an initial pH of 8.5， a culture temperature 32 ℃， a culture time of 28 days， and an inoculation amount of 25%.［Conclusion］ This study provides a reference for the effective utilization of microbial transformation technology for low-grade mineral potassium and the production of biological potassium fertilizer.

Key words Aspergillus niger;Potassium-containing minerals;Potassium dissolving condition;Optimization;Potassium dissolving capacity

土壤中鉀是促進作物生長和代謝的重要營養元素之一，是植物的重要組成成分。在植物生長發育過程中，鉀能增強作物的光合作用，提高光合產物的運輸能力，并參與了60種以上酶系統的活化以及碳水化合物的代謝和蛋白質的合成等過程，鉀還能增強作物抗逆能力和植物吸水保水能力，從而能提高作物的產量和品質。從植物營養角度可將鉀分為速效鉀、緩效鉀和礦物鉀，其中只有速效鉀是植物可吸收的鉀。一般土壤速效鉀含量為0.05%～0.15%，土壤中 90%～98%的鉀是以鉀礦石的形式存在于云母和長石等含鉀礦物的晶體結構中，只有經過漫長的風化過程，從晶格結構中釋放出來才能被作物吸收和利用［1］。我國富氮少磷缺鉀，鉀資源最少。目前，我國的肥料施用量已居世界第一，鉀肥進口量居世界第二。可溶性鉀礦資源僅占世界總量的2%左右，雖然可溶性鉀資源儲量很少，但是我國卻儲藏有含量豐富的低品位含鉀礦。有資料顯示，我國約70%的耕地缺鉀，約45%耕地嚴重缺鉀［2］。鉀肥供需矛盾日趨突出，因此，開發利用我國儲量巨大的低品位鉀礦資源意義重大。

利用微生物轉化礦物鉀是一項無污染、低成本、應用前景廣闊的技術，可有效緩解我國鉀肥緊缺的現狀。但微生物轉化礦物鉀的過程和影響因素多而復雜，對微生物轉化礦物鉀的作用機理研究則是改進生物轉化工藝和提高轉化效率的重要依據［3-4］。Yuan等［5］用4株真菌降解黑云母和蛭石，發現這4株真菌都能使金云母和蛭石中的鉀素釋放出來。潘牧［6］研究了一株嗜熱真菌對含鉀礦物的降解作用，結果表明在液體培養條件下，該菌株能有效降解礦物，釋放出活性鉀素。真菌對礦物風化釋放鉀能力較強，這可能是由于真菌是土壤微生物群落和堆肥發酵中最普遍也是最重要的微生物，真菌在生物轉化含鉀巖石方面的作用也越來越受到重視。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，是重要的工業發酵微生物，在生產工業酶、有機酸和次級代謝產物等方面應用廣泛，如生產淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸等，而且目前它被證明是一種良好的浸礦菌種，對鉀長石和磷灰石等有很強的風化效果［7-17］。胡婕等［13］研究指出在菌絲體與礦物間相互作用的界面上，可能發生很多能量與物質交換的化學反應，并提出真菌對礦物的風化作用機理包括菌絲體對礦物的吸附、包裹、吸收，菌體與礦物形成有機－礦物聚集體，菌絲體對礦物的蝕刻作用及其代謝產物對礦物的化學降解作用。該研究通過對黑曲霉J6解鉀培養基和培養條件的優化得出黑曲霉J6的最佳解鉀條件，從而為有效利用微生物轉化低品位礦物鉀技術和生物鉀肥的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源。黑曲霉J6是河南省微生物工程重點實驗室分離鑒定保藏的一株解鉀菌株。

1.1.2 培養基。

改良查氏培養基：（NH4）2SO4 0.300 g、Na2HPO4·12H2O 0.200 g、MgSO4 0.050 g、FeSO4·7H2O 0001 g、蔗糖3.000 g，超純水100 mL，pH 7.0。

PDA培養基：取去皮的馬鈴薯200.0 g，切成小塊加水1 000 mL，煮沸30 min濾去馬鈴薯塊將濾液補足至1 000 mL，加葡萄糖20.0 g，121 ℃，25 min滅菌。

1.1.3 試劑。

試驗所用的碳源、氮源、無機鹽及其他試劑均為國產分析純。

鉀礦石粉：試驗采用鉀長石成分分析標準物質，K2O、Al2O3和SiO2含量分別為 9.60%、18.63%和 6626%；粒度小于200目。

1.1.4 儀器與設備。

303A-1型恒溫培養箱，上海榮豐科學儀器有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY；原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-500DE臺式數控超聲波清洗器，東莞科橋超聲波設備有限公司；MP511酸度計，上海三信儀表廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備。

將保存好的J6菌株轉接在PDA平板上，30 ℃培養箱中培養2 d，待黑色孢子鋪滿整個平板即可用來制備孢子懸液。吸取5 mL PDA液體培養基沖洗黑色孢子，用細胞計數板確定孢子濃度在107。準確吸取2 mL孢子懸液接入100 mL PDA液體培養基中，30 ℃、180 r/min搖床培養24 h，作為種子液。

1.2.2 標準曲線的繪制。

準確稱取在110 ℃烘2 h的氯化鉀0.190 7 g，溶于超純水中并定容至1 000 mL，此溶液為含鉀100 μg/mL的鉀標準溶液。

準確吸取100 μg/mL的鉀標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻，即得0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL鉀標準系列溶液。用原子吸收火焰分光光度計進行測定，以鉀濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并計算線性回歸方程。

1.2.3 培養基優化。

1.2.3.1

不同碳源的優化。用葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、甘露醇、麥芽糖分別代替基礎培養基中的碳源，加入量為3%，基礎培養基中其他成分不變，加入1 g鉀礦石粉，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%（V∶V），30 ℃、180 r/min振蕩培養15 d。每個處理設 3個重復，測定菌液上清鉀含量，用1 mol/L乙酸銨超聲波振蕩30 min置換菌體中鉀，計算總解鉀量，所得數據應用SPSS 19.0進行單因素方差分析，得出最佳碳源。

1.2.3.2

不同氮源的優化。用蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、尿素、牛肉膏、豆粕分別代替培養基中的氮源，加入量為0.3%，基礎培養基中其他成分不變，加入1 g鉀礦石粉，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%（V∶V），30 ℃、180 r/min振蕩培養15 d。每個處理設 3個重復，測定菌液上清鉀含量，用1 mol/L乙酸銨超聲波振蕩30 min置換菌體中鉀，計算總解鉀量，所得數據應用SPSS 19.0進行單因素方差分析，得出最佳氮源。

1.2.3.3

無機鹽及無機鹽組合的優化。根據黑曲霉菌株的生長與發酵特性，選取Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+ 5種離子及其組合的硫酸鹽作為篩選因素，共設計12組無機鹽處理（Fe2+、Mg2+、Fe2++Mg2+、Fe2++Cu2+、Fe2++Zn2+、Fe2++Mn2+、Mg2++Cu2+、Mg2++Zn2+、Mg2++Mn2+、Fe2++Mg2++Cu2+、Fe2++Mg2++Zn2+、Fe2++Mg2++Mn2+）。在碳源、氮源優化的基礎上，各處理組分別添加總量為0.001%的上述12種處理的硫酸鹽（2種或3種無機鹽組合按質量平均分配），基礎培養基中其他成分不變，加入1 g鉀礦石粉，裝液量100 mL/250 mL，接種量為1%，30 ℃、180 r/min搖床培養15 d，每個處理設3個重復，測定菌液上清鉀含量，用1 mol/L乙酸銨超聲波振蕩30 min置換菌體中鉀，計算總解鉀量，所得數據應用SPSS 17.0進行單因素方差分析，得出最佳無機鹽或組合。

1.2.3.4

培養基正交試驗優化。篩選得到的培養基最佳碳源、最佳氮源、最佳無機鹽按L9（34）設計正交試驗，基礎培養基中其他成分不變，加入1 g鉀礦石粉，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%（V∶V），30 ℃、180 r/min振蕩培養15 d。每個處理設3個重復，測定總解鉀量，比較不同組合的總解鉀量，確定最佳培養基配方。

1.2.4 培養條件優化。

以優化的碳源、氮源及無機鹽配制培養基，進行最適培養溫度、培養時間、初始pH、接種量優化。培養溫度設置為25、30、35、40、45 ℃，培養時間設置為0、5、10、15、20、25、30、35 d，初始pH選取5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種量選取0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。

培養條件正交試驗中選用培養時間、培養溫度、初始pH、接種量4個因素設計4因素3水平正交試驗，采用L9（34）對菌株搖瓶發酵培養條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 培養基優化

2.1.1 碳源優化。

由圖1可知，利用可溶性淀粉為碳源時，J6的總解鉀量最高，并且與其他各碳源之間對黑曲霉J6總解鉀量的影響差異顯著（P＜0.05）。因此，選用可溶性淀粉作為碳源進行下一步試驗。

2.1.2 氮源優化。

從圖2可以看出，當大豆蛋白胨為氮源時，J6的總解鉀量最高，其次為豆粕，硫酸銨的總解鉀量最低，綜合考慮到經濟因素，選用豆粕作為氮源進行下一步試驗。

2.1.3 無機鹽優化。

由圖3可知，培養基中添加Fe2++Zn2+組合的硫酸鹽處理總解鉀量最高，Fe2++Mg2++Mn2+組合的總解鉀量最低，但Fe2++Zn2+組合除與Fe2++Mg2++Cu2+和Fe2++Mg2++Mn2+組合的硫酸鹽處理總解鉀量差異顯著（P<0.05）外，與其余各組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.1.4 培養基的正交試驗。

對碳源（可溶性淀粉）、氮源（豆粕）及2種無機鹽離子（Fe2+、Zn2+）的用量進行4因素3水平的正交試驗，結果如表1所示。從表1可以看出，各因素對黑曲霉J6總解鉀量的影響從大到小依次為氮源>Fe2+>碳源>Zn2+，最優培養基組合為2%可溶性淀粉、0.5%豆粕、0003% Fe2+、0.008% Zn2+。

2.2 培養條件優化

2.2.1 培養時間對黑曲霉J6總解鉀量的影響。

由圖4可知，隨著培養時間的增加，黑曲霉J6在高效解鉀培養基中的總解鉀量也隨之增加，黑曲霉J6在高效解鉀培養基中30 ℃、200 r/min振蕩培養30 d左右有最大的釋鉀量，由回歸曲線方程y=-25.161x2+1 456.9x可以求出：當培養時間為28.95 d時，方程有極大值（21 089.76），即最大釋鉀量為21 089.76 mg/L。

2.2.2 培養溫度對黑曲霉J6總解鉀量的影響。

由圖5可知，當培養溫度低于35 ℃時，隨著培養溫度的升高，黑曲霉J6在高效解鉀培養基中的總解鉀量也隨之增加，當溫度為35 ℃時，黑曲霉J6總解鉀量最高。當培養溫度高于35 ℃時，隨著培養溫度的升高，黑曲霉J6總解鉀量反而降低。

2.2.3 初始pH對黑曲霉J6總解鉀量的影響。

由圖6可知，當高效解鉀培養基pH為8.0時，黑曲霉J6在高效解鉀培養基中的總解鉀量最高，與其他各組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.2.4 接種量對黑曲霉J6總解鉀量的影響。

由圖7可知，當接種量為2.0%時，黑曲霉J6在高效解鉀培養基中的總解鉀量最高，與其他各組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.2.5 培養條件正交試驗。

從培養條件正交試驗結果及極差分析（表2）可以看出，影響黑曲霉J6解鉀培養條件的因素大小順序為D（接種量）＞C（培養時間）＞B（初始pH）＞A（培養溫度）。黑曲霉J6解鉀培養條件最佳組合為A1B3C1D3，即黑曲霉J6解鉀的最佳培養條件為培養基初始pH 8.5、培養溫度32 ℃、培養時間28 d、接種量2.5%。

3 討論與結論

利用微生物從鉀長石中獲得可供作物利用的有效鉀，具有能耗低、成本少、無污染和方法簡單等優勢，被認為是最有前途的鉀長石提鉀方法。巖石的微生物風化是一個多因素作用下的復雜過程，微生物可以通過機械作用、有機酸和胞外聚合物以及氧化還原作用等方式風化礦物，它們共同存在于微生物參與的礦物風化作用過程中，相互影響、共同作用。

黑曲霉是一種廣泛存在的腐生真菌，也是重要的工業發酵菌種。黑曲霉作為良好的浸礦菌種，對鉀長石有很強的風化效果。河南省微生物工程重點實驗室的黑曲霉菌種，生長速度快，產生的孢子極易在環境中存活。

該研究將實驗室保藏的黑曲霉進行了培養基及培養條件優化，使發酵液上清中鉀的含量比對照增加了15 000 mg/L。經單因子試驗和正交試驗，確定發酵培養黑曲霉J6解鉀最佳培養基為2%可溶性淀粉、0.5%豆粕、0.003% FeSO4、0008% ZnSO4，其解鉀的最佳培養條件為培養基初始pH 8.5、培養溫度32 ℃、培養時間28 d、接種量2.5%。該研究結果還表明在碳源優化試驗中，可溶性淀粉作為碳源時，總解鉀量最高，且與其他碳源相比差異顯著。在氮源優化試驗中，菌株在無機氮源中效果均較差，大豆蛋白胨中效果最好，豆粕其次，但豆粕具有廉價易得的優點，考慮其在工業生產的經濟因素，選用豆粕作為氮源。在無機鹽影響試驗中，Fe2++Zn2+組合的硫酸鹽處理總解鉀量最高，其機理有待進一步研究。在培養條件試驗中，隨著時間的增加，總解鉀量隨之增加，32 d后隨著時間增加總解鉀量反而降低，可能是菌體消耗的比分解的更多。

該試驗對黑曲霉菌株的培養條件只進行了搖瓶發酵的初步研究，旨在為其工業發酵提供參考。實際應用過程中，

多種因素都有可能對其解鉀效果有影響作用，需要進一步通過發酵罐試驗確定相應的發酵參數。下一步的工作將是菌肥的生產及大田試驗。

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