凡納濱對蝦大棚循環水養殖中后期底泥菌群多樣性及結構分析

摘要 ［目的］對凡納濱對蝦大棚循環水養殖中后期底泥菌群多樣性及結構進行分析。［方法］在凡納濱對蝦大棚循環水養殖50、65、80、95、110 d時采集蝦塘底泥樣品，利用16S rRNA高通量測序技術分析其水體環境中微生物群落結構特征及多樣性。［結果］養殖中后期，以變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優勢菌，二者相對豐度分別在50、65 d時達到最高（分別為84.96%、38.08%）；屬水平上，養殖中期以遠洋桿菌屬（Pelagibacter）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、紅桿菌科未分類屬為優勢屬，養殖后期（95、110 d）以α-變形菌綱的遠洋桿菌屬（Pelagibacter）為共同的優勢類群，且110 d時其相對豐度高達41.02%；80 d時，無明顯優勢屬。Shannon-Wiener多樣性指數隨養殖時間的延長呈先升后降的趨勢，80 d時Shannon-Wiener多樣性指數達到最高（7.24）。通過主成分分析和聚類分析發現，80和95 d時采集的樣品菌群多樣性相似性最高；其余時間點樣品菌群多樣性無明顯差異。［結論］該研究結果表明循環水養殖系統可以優化凡納濱對蝦養殖水體微生物菌群環境，改善水體菌群結構及多樣性，對于凡納濱對蝦實際養殖生產具有重要的指導作用。

關鍵詞 凡納濱對蝦；循環水養殖；多樣性；菌群結構

中圖分類號 S931 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0097-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Diversity and Structure Analysis of Microbial Flora in Bottom Mud During the Middle and Late Stages of Culture in the Greenhouse Recycling Water Aquaculture of Litopenaeus vannamei

YOU Jiu-ju， XIA Feng-feng， WANG Lei-fei et al

（Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan，Zhejiang 316021）

Abstract ［Objective］ To analyze the diversity and structure of sediment microbial flora in the middle and later stages of greenhouse recirculating-water aquaculture of Litopenaeus vannamei. ［Method］ The sediment samples were collected from the pond of L. vannamei on the 50， 65，80，95 and 110 days in the greenhouse recirculating-water aquaculture of L. vannamei. The characteristics and diversity of microbial communities in water environment were analyzed by using 16S rRNA high-throughput sequencing technology. ［Result］ In the middle and late stages of breeding， Proteobacteria and Bacteroidetes were the main dominant bacteria， and the relative abundance reached the highest values （84.96% and 38.08%） at 50 and 65 d respectively. At the level of the genus， Pelagibacter， Arcobacter， Rhodobacteraceae-unclassified were the dominant genera， Pelagibacter of Alphaproteobacteria was the common dominant group in the late stage of breeding （95 and 110 d）， and its relative abundance reached 41.02% at 110 d. There was no obvious dominant genus at 80 d. Shannon-Wiener diversity index showed a trend of first increase and then decrease， it reached the highest level at 80 d （7.24）. Principal component analysis and cluster analysis showed that the bacterial diversity of the samples collected at these two points had the highest similarity， and the bacterial diversity of the samples collected at other time points had no obvious difference. ［Conclusion］The research results showed that the circular water aquaculture system could optimize the microbial community environment in the aquaculture water of L. vannamei， improve the structure and diversity of the water microbial flora， which had an important guiding role for the actual aquaculture production of L. vannamei.

Key words Litopenaeus vannamei；Circular water aquaculture；Diversity;Microbial flora structure

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），俗稱南美白對蝦，具有廣溫性、廣鹽性、生長速度快等優點，可以進行高密度集約化養殖生產，養殖經濟效益顯著，是目前對蝦養殖品種中產量最高的三大優良品種之一。凡納濱對蝦經歷3～4個月的生長周期后可以上市。隨著對蝦產業的高速發展，產業現代化、工廠化和集約化程度大幅度提高，各種對蝦疾病頻繁暴發，病害已成為對蝦養殖業持續健康發展的主要瓶頸。凡納濱對蝦大棚循環水養殖模式是解決當前對蝦養殖產業現有一系列問題的有效途徑之一，也是對蝦養殖模式發展的新方向。對蝦養殖中后期，重在改良底質［1］，而底泥是水層營養物質的重要來源［2］。底泥微生物對于促進底泥有機質分解、減少有機物的堆積以及保持良好的水質等方面發揮著重要作用［3］，在刺參［4］、克氏原螯蝦［5］、中華絨螯蟹［6］等品種養殖中已有學者進行了相關研究報道。了解養殖塘底泥細菌群落結構，掌握菌群多樣性變化規律，可為改善養殖水體、對蝦病害防治及規模化養殖中微生物資源的開發等提供基礎數據。已有學者對凡納濱對蝦養殖水體菌群等開展了相關研究［7-10］，但關于大棚循環水養殖模式下蝦塘底質微生物菌群相關研究尚未見報道。筆者采用16S rRNA高通量測序方法對大棚內循環凡納濱對蝦養殖塘底質菌群情況進行分析，以期為更高效的養殖水環境調控和健康養殖模式提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預處理

凡納濱對蝦養殖塘位于舟山市朱家尖科研基地，在原對蝦高位池大棚養殖塘的基礎上進行改造，在面積1 000 m2大棚池塘內新建流水水槽2個，長20 m、寬5 m、高2 m，建設面積200 m2，水槽采用鋼筋混凝土結構，采用長方形傾斜底，于大棚外排水口處加裝蛋白分離器（加臭氧）進行塘內循環水質的消毒處理，水處理主要流程為養殖區→凈化區→清水區→蛋白分離器（加臭氧）→養殖區，如圖1所示。

投放凡納濱對蝦苗種后50 d開始采樣。于養殖塘對蝦主養殖區中間位置，用采泥器采集蝦塘約5 cm厚度底泥置于無菌采樣袋中，立即置于4 ℃條件下帶至實驗室進行菌群DNA抽提。試驗共設置50、65、80、95、110 d 5個采樣時間點，分別記作A1～A5。

1.2 總基因組DNA提取

按照Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit DNA分離試劑盒說明書，提取蝦塘底泥細菌群落總基因組DNA，測定DNA濃度和純度，最后利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗核酸抽提質量。

1.3 PCR擴增及高通量測序

以提取的總DNA為模板，用引物343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）和798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′）擴增微生物16S rRNA V3～V4區片段。擴增體系包括10×PCR Buffer（Mg2+ Free）5.00 μL，MgCl2+（25 mmol/L）4.00 μL，dNTP（10 mmol/L）4.00 μL，F/R primer（10 mmol/L）各2.00 μL，DNA（50 ng/μL）2.00 μL，Ex Taq 0.25 μL，用ddH2O補足50.00 μL。擴增程序如下：95 ℃變性5 min；然后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；最后，72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，進行PCR產物的純化及回收。將純化后的PCR產物送交測序公司進行Illumina Miseq高通量測序。

1.4 數據統計與分析

對測序數據進行OTU聚類分析，OTU（可操作分類單元，operational taxonomic unit）是人為給某一分類單元設置的同一標志。根據OTU聚類分析結果，評估底泥微生物菌落α多樣性；基于分類學信息，在門、綱、屬分類水平上對底泥群落結構進行分析。試驗數據均以平均值±標準差表示，使用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌群多樣性分析

從5組底泥樣品中獲得的有效序列數分別為25 505、30 986、33 813、27 497、30 888條，去除嵌合體后得到的有效序列堿基長度為251～450 bp；OTU聚類分析發現，5組樣品獲得的總OTUs數目為988個，各樣品Tags和OTUs數目統計見表1。從不同養殖階段樣品的共有和獨有OTU數目（圖2）可以看出，大棚循環水系統能更好地優化環境中的菌群結構。

在該試驗測序深度下，樣品的稀釋曲線趨于平緩，即隨著測序條數的增加，獲得的OTU數量變化不大（圖3），說明該試驗測序深度夠大，足以覆蓋樣品的大多數微生物，測序數據量合理。通過香農-威納多樣性指數（Shannon-Wiener diversity index）對養殖塘底泥微生物群落多樣性進行評估，發現養殖80 d時（A3）微生物Shannon-Wiener多樣性指數最高（7.24），110 d時（A5）底泥中微生物Shannon-Wiener多樣性指數降至4.87，接近50 d時（A1）的Shannon-Wiener多樣性指數（4.75）（圖4）。

2.2 菌群結構特征分析

該研究采集的5個底泥樣品檢測到的細菌群落隸屬于26門59綱119目235科391屬。通過對細菌群落門水平上相對豐度的分析可知，養殖中后期養殖底泥中細菌群落以變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢類群，且這2個門在采樣期間一直是

主要類群，其中變形菌門在各采樣時間點（A1、A2、A3、A4、A5）相對豐度分別為84.96%（最高）、49.17%、57.43%、58.93%、66.94%，擬桿菌門相對豐度在65 d時達到最高（38.08%），厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度隨采樣時間呈下降趨勢，110 d時相對豐度降至0.05%；放線菌門（Actinobacteria）、纖細菌門（Gracilibacteria）、螺旋體門（Spirochaetae）、酸桿菌門（Acidobacteria）在養殖中后期也占有一定比例，除了放線菌門相對豐度在80 d時達到12.29%外，其他養殖階段相對豐度均處于較低水平（圖5）。

主成分分析（Pcoa）（圖6ａ）顯示，80、95 d時采集的樣品可以很好地聚類在一起，菌群多樣性相似性較高，科水平的細菌群落heatmap（圖6b）和基于Unifrac的聚類分析（圖6c）結果也類似。80 d前和95 d后采集的樣品菌群多樣性差異較大。

整個采樣期間，屬水平上95、110 d時的優勢類群均以α-變形菌綱的遠洋桿菌屬（Pelagibacter）為共同的優勢類群，且110 d時其相對豐度高達41.02%。弓形桿菌屬（Arcobacter，37.31%）和遠洋桿菌屬（Pelagibacter，31.09%）為50 d時的優勢屬，65 d時底泥中以紅桿菌科未分類屬（10.52%）為主；80 d時無明顯優勢菌群（表2）。

3 討論

該文利用16S rRNA高通量測序方法對大棚循環水養殖模式的凡納濱對蝦養殖中后期底泥微生物多樣性和菌群結構進行了研究。5個采樣點得到的有效序列分析結果表明，采集的5組樣品共獲得有效序列數25 505～33 813條，操作分類單位380～636個，總OTUs數高達988個；檢測到的細菌群落屬于26門391屬，表明該大棚循環水系統養殖后期蝦塘底泥中菌群多樣性較高；各樣品OTU稀釋曲線均趨于平緩，表明樣品測序深度足夠大，該測序結果可客觀反映養殖中后期底泥細菌群落結構。測序分析結果顯示，有效序列數占總序列數目的比例介于65.88%～84.07%，表明凡納濱對蝦大棚循環水養殖環境中存在大量的未知菌群。胡東等［9］利用高通量測序對福建漳浦縣海水養殖場高位池養殖凡納濱對蝦中后期水體菌群結構的研究發現，未鑒定序列數占總序列數的比例為0.86%。

該研究養殖中后期底泥樣品中的優勢類群為變形菌門和擬桿菌門，這與金若晨［3］研究報道的水樣、 底泥和蝦腸道中主要的門類相一致。變形菌門相對豐度在50 d時最高（84.96%），在65 d時相對豐度最低（49.17%）；擬桿菌門在50 d時還未形成優勢菌，相對豐度僅5.42%，但在65 d時達到最高（38.08%），此后養殖階段相對豐度維持在21.80%以上；除了放線菌門相對豐度在80 d時達12.29%外，其余養殖階段其他類群相對豐度均較低。一些學者對凡納濱對蝦養殖的研究發現，變形菌門是海水養殖或高鹽湖泊環境中主要的細菌群落之一［11-12］。Zhang等［13］通過對凡納濱對蝦淡水養殖池微生物的研究發現，擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和藍細菌門是養殖水體中的主要微生物類群。胡曉娟等［14］通過對高位池養殖凡納濱對蝦優勢菌群的研究發現，高位池與海水池塘的養殖環境條件近似，變形菌和擬桿菌是凡納濱對蝦高位池養殖水體中的主要優勢菌。該研究蝦塘底泥分析結果也反映了這一規律。

該研究Pcoa主成分分析和聚類分析結果均表明，養殖中后期（80和95 d）細菌群落多樣性相似度最高，而其他時間點相似度差異較大。在屬水平上，養殖中后期各階段細菌類群構成變化較大。在養殖50 d時檢測到水生動物潛在的條件性致病菌弓形桿菌屬的存在，且相對豐度為37.31%，稍高于α-變形菌綱的遠洋桿菌屬（31.09%）；65 d后，養殖底泥中以遠洋桿菌屬、黃桿菌屬、紅桿菌科未分類屬等為優勢類群；95、110 d時優勢菌群均以遠洋桿菌屬為唯一優勢菌群，且110 d時相對豐度高達41.02%，這對于改善底質環境狀況、維持菌落穩定等起著重要作用［15］，表明該循環水養殖系統養殖中后期凡納濱對蝦養殖池處于健康的養殖狀態。在凡納濱對蝦養殖過程中，尤其養殖中后期，隨著養殖時間的延長，水體營養化程度不斷增高，潛在條件性致病菌引發病害的概率增加，循環水系統可以有效改善優勢菌群的豐度，抑制有害菌的定殖，從而為凡納濱對蝦的健康生長創造良好的水體環境。

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