蝦類十足目虹彩病毒1（DIV1）LAMP-HNB快檢方法的建立

摘要 ［目的］建立一種操作簡便、快速、可視化的蝦類病原檢測方法，實現基層養殖戶自檢。［方法］針對十足目虹彩病毒1（DIV1），設計環介導等溫擴增（LAMP）特異性引物，對反應試劑用量、溫度、反應時間等條件進行優化，建立LAMP與羥基萘酚藍（HNB）結合的LAMP-HNB可視化快速檢測方法。［結果］在LAMP反應體系中添加12 mmol/L Mg2+和250 μmol/L HNB，65 ℃恒溫條件下反應60 min最佳；DIV1病原質粒最低檢出限為102 copies/μL，穩定性和特異性較好，通過帶有靶標基因的陽性質粒進行16次重復性試驗結果均較為穩定，多種模板擴增試驗均未發生假陽性情況，符合試驗要求。［結論］該研究建立的LAMP-HNB可視化快速檢測方法，適用于上述對蝦DIV1的現場快速檢測。

關鍵詞 南美白對蝦；LAMP；HNB；十足目虹彩病毒1；快速檢測

中圖分類號 S945.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0192-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.041

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of LAMP-HNB Rapid Detection Method for Decapod Iridescent Virus 1 （DIV1） of Shrimp

WANG Wen-qiong1，GE Ming-feng1，LU Xian-dong2 et al

（1.Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute，Ningbo，Zhejiang 315012;2.Ningbo AiGene Technology Co.，Ltd.，Ningbo，Zhejiang 315105）

Abstract ［Objective］To establish a simple，rapid and visual pathogen detection method for shrimp，and to achieve self detection by fishermen.［Method］The specific primers of LAMP （loop-mediated isothermal amplification technique） were designed for decapod iridescent virus 1 （DIV1）.After optimizing the conditions of reagent dosage，temperature and reaction time，a visual and rapid detection method of LAMP combined with hydroxynaphthol blue （HNB） was established.［Result］12 mmol/L Mg2+ and 250 μmol/L HNB solution in the LAMP reaction system was the most suitable condition at 65 ℃ for 60 min.The minimum detection limits of LAMP-HNB of DIV1 was 102 copies/μL plasmid.The stability and specificity of the detection of DIV1 had also been verified using positive plasmids with target genes，and the results of 16 repeated experiments were relatively stable，multiple template amplification experiments did not show false positives，which meets the experimental requirements.［Conclusion］The LAMP-HNB visualization rapid detection method established in this study is suitable for the on-site rapid detection of shrimp DIV1 mentioned above.

Key words Litopenaeus vannamei;LAMP;HNB;Decapod iridescent virus 1（DIV1）;Rapid detection

我國是蝦類養殖大國，特別是南美白對蝦（Litopenaeus vannamei），為我國主導養殖蝦類品種。隨著高密度、集約化水產養殖模式的普及，各類疾病頻發。據《2022中國水生動物衛生狀況報告》，2021年養殖蝦類因疾病造成的經濟損失高達90億元，而十足目虹彩病毒1（DIV1）為感染養殖蝦類的主要病原［1］。因此，急需建立一種針對蝦類疾病的快速診斷技術，以便基層養殖企業第一時間發現病原，從而采取防控措施及時止損。目前國內外已有多種方法用于對蝦病原檢測，如聚合酶鏈式反應（PCR）、微陣列檢測、核酸分子雜交等［2］，但這些方法存在操作步驟煩瑣、操作時間長、對儀器和操作要求較高、易導致氣溶膠污染等不足，不適合基層快速檢測。

環介導等溫擴增（LAMP）技術是一項新型核酸擴增技術，具有特異性強、靈敏度和重復性良好、結果判讀簡易、不需要特殊設備、操作簡單等優點［3］。羥基萘酚藍（HNB）在LAMP反應體系中作為產物指示劑，既能滿足肉眼判讀結果的需求，又能避免反應后開蓋引起的氣溶膠污染，更適合在實際檢測中應用［4］。LAMP-HNB是基于LAMP技術形成的一種可視化的快速檢測方法，可通過反應前后染料的顏色變化來判斷檢測結果。此方法無需昂貴的熱循環設備，具有成本低、特異性強、操作簡單、高效快捷、結果易觀察、滿足基層現場操作等優點。該研究基于LAMP-HNB建立針對蝦類十足目虹彩病毒1的快速檢測方法，可使蝦類養殖企業在養殖現場進行快速檢測，該方法為及時排除對蝦養殖期的病原感染風險、規避主要流行性病害暴發風險、提前做好預警和防治工作提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10×反應緩沖液和Bst DNA聚合酶，購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；SYBR Green熒光染料，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質粒，購自上海百力格生物技術有限公司。南美白對蝦樣品于2022年4—6月采集自浙江省寧波市各對蝦養殖場，體長3～10 cm，現場取肝胰腺、鰓、腸、肌肉等組織經95%乙醇固定后帶回實驗室備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 LAMP引物設計。利用Primer Explorer V5軟件，依據GenBank報道的病原特異性序列（GenBank序列號KY681040.1），分別設計兩對LAMP引物，包括2條內引物（FIP：5′-ACGAATCGTTTCCCGTGAGA-CAAATGCTGACGA-AATCATCA-3′；BIP：5′-TGGGCTCGAGATTTGTTCCAAC-GCTTGTTGCAAATCATGTGTA-3′）和2條外引物（F3：5′-TGTTAGATGGGCAGTCATG-3′；B3：5′-GCATCCTTGATTGCTGGA-3′）。

1.2.2 最適反應溫度優化。根據Bst DNA聚合酶特性，分別在63、65、67 ℃ 3個溫度梯度下進行試驗，通過比較熒光起峰時間確認最適反應溫度。反應時間設定為60 min，模板為含DIV1靶基因序列的質粒（模板濃度為104 copies/μL），反應體系如下：含80 mmol/L MgSO4的10×反應緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 4.0 μL，100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL，Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL，SYBR Green 熒光染料0.5 μL，ddH2O 14.0 μL，模板1.0 μL，總體積25.0 μL。

1.2.3 最適反應時間優化。以DIV1靶基因質粒（濃度100～106 copies/μL）為模板，分別反應30、45、60 min后，觀察熒光起峰時間，確認最適反應時間，反應體系同“1.2.2”。

1.2.4 Mg2+濃度優化。以DIV1靶基因質粒（濃度104 copies/μL）為模板，分別設置MgSO4終濃度為8、12、16 mmol/L，在3組試驗中分別加入100 mmol/L MgSO4 0、1.0和2.0 μL，每組反應體系中再加含80 mmol/L MgSO4的10×反應緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTP 4.0 μL、100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL、Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL、SYBR Green熒光染料0.5 μL、HNB 1.0 μL，最終加ddH2O至25.0 μL，在65 ℃下反應60 min，確認最佳顯色的同時，觀察熒光起峰時間，確認最佳Mg2+濃度。

1.2.5 HNB濃度優化。對HNB濃度進行優化，以求獲得最好的顯色效果。以DIV1靶基因質粒（濃度104 copies/μL）為模板，設置HNB終濃度為150～500 μmol/L，在65 ℃下反應60 min，確認最佳顯色濃度。反應體系如下：含80 mmol/L MgSO4的10×反應緩沖液2.5 μL，100 mmol/L MgSO4 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 4.0 μL，100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL，Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL，150～500 μmol/L HNB 1.0 μL，ddH2O 12.5 μL，模板1.0 μL，總體積25.0 μL。

1.2.6 特異性試驗。以蝦類常見的8種病原［白斑綜合征病毒（WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、桃拉病毒（TSV）、傳染性肌壞死病毒（IMNV）、對蝦偷死野田村病毒（CMNV）、蝦肝腸胞蟲（EHP）、致急性肝胰腺壞死病弧菌（Vp

AHPND）、DIV1］以及ddH2O為模板進行特異性試驗，觀察DIV1檢測體系是否產生非特異性擴增。反應條件（65 ℃下反應60 min）和反應體系見“1.2.5”，其中HNB終濃度為250 μmol/L。

1.2.7 靈敏度試驗。通過調節DIV1的初始濃度，經10倍梯度稀釋，制備質粒濃度為100～106 copies/μL，評估反應體系的靈敏度。通過觀察HNB顯色效果，探究檢測體系的最低檢測限，反應條件（65 ℃下反應60 min）和反應體系見“1.2.5”。

1.2.8 穩定性試驗。為確保LAMP-HNB反應體系的穩定性，通過帶有靶標基因的陽性質粒，進行16次重復試驗，確認其穩定性。質粒濃度為DIV1檢測限濃度，反應條件（65 ℃下反應60 min）和反應體系見“1.2.5”。

2 結果與分析

2.1 最適反應溫度 從表1和圖1可以看出，隨溫度上升，擴增效率隨之提高，當溫度升至67 ℃時擴增效率有所下降，故選擇65 ℃作為最適反應溫度。

2.2 最適反應時間

不同濃度的DIV1靶基因質粒模板對比試驗（表2）發現，擴增曲線的起峰時間均在60 min內。從擴增曲線（圖2）來看，起峰時間晚（模板濃度低）的擴增曲線在60 min以后才開始進入平臺期（但這時已能確保結果的判定）。考慮到檢測的快捷性和準確性要求，選擇60 min較為合理。

2.3 最適Mg2+濃度篩選

不同Mg2+終濃度（8、12、16 mmol/L）對比試驗（表3、圖3）發現，12 mmol/L Mg2+組擴增效率最高，其次是16 mmol/L Mg2+組，而8 mmol/L Mg2+組的擴增效率最低。通過觀察反應前后的顏色變化，其中8 mmol/L Mg2+組的顏色變化差距較小，不易觀察，而16 mmol/L Mg2+組是從紫色變為紫羅蘭色，只有12 mmol/L Mg2+組為紫羅蘭色變為天藍色，變化較為明顯。因此在該試驗中，12 mmol/L為反應體系最適Mg2+終濃度。

2.4 最適HNB濃度篩選

從圖4可以看出，隨HNB濃度升高，體系顏色逐步加深。500 μmol/L濃度時，反應前后體系顏色均為紫色，400 μmol/L濃度時需要有較好的視線才能分辨陰性、陽性，200 μmol/L濃度時兩者顏色對比相對較淺。經多次比較選擇，發現250 μmol/L組反應前后色差最明顯，

辨識度較強。陽性反應呈藍天色，陰性呈紫羅蘭色，故選擇250 μmol/L為體系中HNB的最佳終濃度。

2.5 特異性測試

為測試DIV1引物是否會產生非特異擴增，以8種常見對蝦病原為模板進行擴增試驗。結果表明（圖5），DIV1檢測體系經過多種模板擴增試驗均未發生假陽性情況，僅在DIV1模板下產生顏色反應，符合試驗要求。

2.6 靈敏度試驗 試驗結果表明（圖6），100和101 copies/μL的模板濃度反應后的顏色與陰性對照差異不明顯，102 copies/μL以上的模板濃度在反應后與陰性對照具有較明顯的色差，因此DIV1病原質粒LAMP-HNB最低檢測限為102 copies/μL，達到預期要求。

2.7 穩定性試驗

將帶有DIV1靶標基因的陽性質粒進行16次重復性試驗確認其穩定性，結果表明（圖7），DIV1反應體系在檢測限濃度的16次重復試驗中均很好地發生了擴增，反應產物均呈現天藍色（陽性），符合要求。

3 討論

Bst DNA聚合酶大片段作為一種常用的DNA聚合酶，具有引發鏈置換反應、高保真、耐高溫等特點，是一種重要的DNA多重置換擴增酶［5］。DNA聚合酶都有一個最佳反應溫度，該研究中的Bst DNA聚合酶在65 ℃左右呈現出最佳反應溫度，這與該試劑提供商［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］描述是一致的。通過不同濃度的質粒模板（100～106 copies/μL）對比試驗發現，擴增曲線的起峰時間均在40 min內，且隨模板濃度的增加，起峰時間呈現下降趨勢。從該試驗結果看，當反應50 min后擴增曲線基本達到平臺期，一些強陽性的樣品在40 min內可進入反應曲線平臺期，但是低濃度拷貝模板（101 copies/μL）在近60 min后才進入平臺期。因此，在不影響結果判定的基礎上選擇反應時間60 min較為合理，這個結果與徐匆等［4］、姜朕元等［6］所使用的方法一致。

體系成分濃度直接影響到反應前后顏色變化，其中影響較大的是HNB和Mg2+濃度。該試驗通過反應前后顏色變化來判定結果，反應前體系溶液呈紫羅蘭色，反應后陽性樣品變為天藍色，陰性樣品則顏色不變。反應體系中HNB濃度起到了關鍵作用，如果HNB濃度過高，反應前顏色呈現紫色（300 μmol/L以上），反應前后辨識度不強；HNB濃度過低（150 μmol/L以下），反應前后顏色均較淡，影響結果判定，該試驗經過反復優化確定250 μmol/L為HNB最佳終濃度。由于Mg2+在反應中形成dNTP-Mg 絡合物與核酸骨架相互作用，穩定堿基形成中的中間體影響Bst 聚合體，所以體系中Mg2+濃度小于一定值時，靶基因無法擴增［7］。在該試驗中，8 mmol/L Mg2+組的顏色變化差距較小，肉眼不易觀察，而高濃度Mg2+組（16 mmol/L）起始時顏色為紫色，反應后呈現變紫羅蘭色，與預期不符。可見，Mg2+不僅能影響靶基因的擴增，還會對指示劑的顯色造成影響。該試驗中，12 mmol/L Mg2+組中反應前體系為紫羅蘭色，靶基因擴增后體系變為天藍色，變化較為明顯。此外，該試驗對DIV1檢測體系進行了16次擴增試驗來驗證引物的可靠性和體系的穩定性，很好地證實了檢測引物的可靠性和穩定性。另外，靈敏度測試結果為102 copies/μL，符合現場快速檢測需求。

目前暫無有效治療對蝦疾病的手段，對蝦病害的防控是一個復雜且系統性的工程，涉及蝦池的消毒殺菌、投飼、增強蝦體抗病能力、藥物治療等方面［8-10］。近幾年來，隨著對蝦檢測技術的發展以及對病原的研究，各種檢測手段也越來越成熟且多樣化，但大部分只能面向專業的實驗室和技術人員，大多基層養殖戶沒有專業檢測手段，且專業接受性較弱，無法落到實處。該試驗建立的蝦類DIV1 LAMP-HNB技術具備操作簡便、易學、耗時短、無需特殊設備等優點，為實現養殖一線病原常態化自檢提供了新的解決方案。

4 結論

通過對體系反應溫度、反應時間、Mg2+濃度、HNB濃度、靈敏度、穩定性等系列試驗，確認該研究中所列引物檢測效果良好，最終確認反應體系為含80 mmol/L MgSO4的10×反應緩沖液2.5 μL、100 mmol/L MgSO4 1.0 μL、10 mmol/L dNTP 4.0 μL、100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL、Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL、250 μmol/L HNB 1.0 μL、ddH2O 12.5 μL、模板1.0 μL，總體積25.0 μL，在反應溫度65 ℃、反應時間60 min條件下具有較好的靈敏度和特異性。

參考文獻

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