改良QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定水果蔬菜中36種農藥殘留

摘要 ［目的］建立QuEChERS凈化-超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法同時測定水果及蔬菜中36種農藥殘留量的方法。［方法］樣品前處理采用改良的QuEChERS方法，采用乙腈作為提取溶劑，經鹽析分層后，取2.0 mL上清液，加入400 mg無水硫酸鎂（MgSO4）、50 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、50 mg十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）和100 mg石墨化碳黑（GCB）凈化后，在多反應監測模式（MRM）下分析檢測，采用Waters Atlantis T3 C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）作為分析柱，梯度洗脫，外標法定量。［結果］36種農藥在質量濃度為5.00～200.38 ng/mL線性關系良好（r≥0.991 0），方法檢出限為0.002～0.003 mg/kg，定量限為0.005～0.010 mg/kg；分別向復合果蔬汁樣品中添加濃度為2倍、5倍、10倍定量限濃度的36種農藥標準品，其平均加標回收率為81.70%～117.38%，儀器精密度RSD為1.10%～4.19%。［結論］建立的方法具有前處理簡便、靈敏度高、準確性好、重復性強等優勢，能廣泛應用于不同的水果及蔬菜中農藥殘留的分析檢測。

關鍵詞 QuEChERS凈化；農藥殘留；水果蔬菜；超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法

中圖分類號 TS207.5+3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0197-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.042

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of 36 Pesticide Residues in Fruits and Vegetables by QuEChERS-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Chao-qun， JIN Shao-qiang， YUE Chao et al

（Zhejiang Institute for Food and Drug Control/Key Laboratory of Quality and Safety of Functional Food for State Market Regulation/Key Laboratory of Zhejiang Marketing Bureau （Key Laboratory of Health Food Quality and Safety）， Hangzhou，Zhejiang 310052）

Abstract ［Objective］To establish a method for simultaneous determination of 36 pesticide residues in fruits and vegetables by QuEChERS purification-ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry.［Method］The sample preparation was treated using the modified QuEChERS method with acetonitrile as the extraction solvent， and after salting out stratification， take 2.0 mL supernatant， purified with 400 mg anhydrous magnesium sulfate （MgSO4）， 50 mg ethylenediamine-N-propylsilane （PSA）， 50 mg octadecylsilane bonded silica gel （C18） and 100 mg of graphitized carbon black （GCB），analyze and detect under multiple reaction monitoring mode （MRM） using Waters Atlantis T3 C18 column （2.1 mm × 150 mm， 5 μm） as an analytical column， gradient elution and quantification using external standard method.［Result］ 36 pesticides had a good linear relationship （r≥0.991 0） at a mass concentration of 5.00-200.38 ng/mL， with the detection limit of 0.002-0.003 mg/kg and the quantification limit of 0.005-0.010 mg/kg.36 pesticide standards with concentrations of 2 times， 5 times and 10 times the quantification limit were added to the composite fruit and vegetable juice samples，the average recovery rate was 81.70%-117.38%， and the instrument precision RSD was 1.10%-4.19%.［Conclusion］The established method has the advantages of simple pretreatment， high sensitivity， good accuracy and strong repeatability， and can be widely used in the analysis and detection of a variety of pesticide residues in fruits and vegetables.

Key words QuEChERS purification;Pesticide residues;Fruits and vegetables;Ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry

水果和蔬菜在我國是僅次于糧食的第二大農作物，其種植過程中病菌蟲害較多，需使用農藥進行病蟲害防治。但不規范不正確使用農藥可能會造成農藥殘留量超標，嚴重的甚至會危害到人體健康［1］，因此，農藥殘留的安全問題存在較高風險，對蔬菜水果中的農藥殘留進行檢測顯得尤為重要。

農藥殘留的前處理技術是農藥殘留檢測的關鍵，影響檢測結果。目前農藥殘留的前處理方法包括固相萃取法［2-3］、加速溶劑萃取［4］、超臨界流體萃取技術［5］、QuEChERS方法［1，6-9］、凝膠滲透色譜技術［10］等。其中QuEChERS方法是近年來農藥殘留檢測最常用的前處理方法之一，該方法雖然具有快速高效的優點，但是也存在去除雜質效果弱的缺點。目前水果蔬菜中農藥殘留的檢測方法主要有快速檢測法和儀器檢測法。快速檢測法不依賴于儀器，能在短時間內出結果，但其準確度相較于大型儀器較低［11］。大型儀器具有分離度好、靈敏度高、重復性好、準確度高等優點，包括高效液相色譜法［12］、液相色譜-質譜聯用法［6-7，13-14］、氣相色譜法［15］、氣相色譜-質譜聯用法［1-2，9，16-17］。近年來，液相色譜-質譜聯用儀因儀器穩定性好、靈敏度高逐漸代替氣相色譜儀和氣相色譜-質譜聯用儀成為農藥殘留的主流檢測儀器。該試驗以36種常用的農藥為研究對象，采用優化的QuEChERS方法進行前處理，結合超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，建立同時適用于多種基質且能快速測定農藥殘留的通用分析方法，并利用該方法分析市場上流通的水果蔬菜樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器

Triple Quad 5500三重四級桿/線性離子阱串聯質譜儀（美國，AB Sciex公司）；LC-30AD超高效液相色譜儀（日本，Shimadiu公司）；Milli-Q超純水儀（美國，Millipore公司）；XPE-205電子天平（瑞士，Mettler toledo公司）；QT-1渦旋混合器（上海，琪特公司）；恒溫水浴鍋（德國，Julabo公司）；Multifuge XIR高速離心機（美國，Thermo公司）；C-MAG HP10型電熱板（德國，IKA集團）。

1.2 試劑

乙腈、甲醇，色譜純，德國默克公司；甲酸、乙酸銨，質譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；氨水，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；聚酰胺粉，100～200目，國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸鎂（MgSO4，含量≥98%），上海安譜實驗科技股份有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，40～80 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，50 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司；石墨化碳黑（GCB，120～400目），上海安譜實驗科技股份有限公司。肟菌酯、噁唑菌酮、氯唑磷、多菌靈、氰戊菊酯、氟硅唑、溴氰菊酯、甲胺磷、丙溴磷、滅線磷、乙螨唑、殺撲磷、嘧霉胺、霜霉威、辛硫磷、烯酰嗎啉、氯吡脲、腈苯唑、噻蟲胺、噻蟲嗪、嘧菌酯、戊唑醇、甲霜靈、甲基異柳磷、樂果、異菌脲、苯醚甲環唑、甲氰菊酯、三唑磷、阿維菌素、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜標準溶液均購自Bepure，濃度均為1 000 μg/L；二甲戊靈、敵敵畏標準溶液購自ANPEL，濃度均為1 000 μg/L。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制。

1.3.1.1

混標工作溶液。精密移取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜4種標準溶液0.05 mL于同一10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，得混標溶液A。精密移取其余32種標準溶液0.1 mL于同一10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，得混標溶液B。精密移取混標溶液A和混標溶液B各2.5 mL于同一25 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，得混標工作溶液。

1.3.1.2

混合標準曲線溶液。分別精密移取混標工作溶液20、40、100、200、400 μL于2 mL容量瓶中，用混合果蔬汁空白基質液定容至刻度，得混合標準曲線溶液。

1.3.2

樣品處理。稱取約10 g試樣于50 mL離心管中，先加入1顆陶瓷均質子，然后加入10.0 mL乙腈后蓋上蓋子劇烈振蕩1 min后，加入4.0 g無水MgSO4、1.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉二水合物、0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，蓋上蓋子立即劇烈振蕩1 min，4 200 r/min離心5 min。塑料離心管中裝入400 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18和100 mg GCB，準確吸取2.0 mL上清液于上述裝有試劑的塑料離心管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機濾膜，待進樣分析。

1.3.3

色譜條件。色譜柱為Waters Atlantis T3 C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相A為0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0.01～1.00 min，5% B；1.00～1.50 min，5%～15% B；1.50～2.50 min，15%～50% B；2.50～18.00 min，50%～70% B；18.00～23.00 min，70%～98% B，23.00～27.00 min，98% B；27.00～27.50 min，98%～5% B。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

1.3.4

質譜條件。監測方式為MRM；電離方式為ESI；正、負離子同時掃描；離子源參數參考條件：噴霧電壓4 500 V；離子源溫度350 ℃；氣簾氣流速20 L/min；霧化氣流速35 L/min。優化后的母離子、子離子和碰撞能、去簇電壓、射入電壓等質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜及液相條件優化

2.1.1 質譜條件的優化。目標化合物較多的情況下，質譜條件的優化尤為重要，直接影響到各目標物的檢測靈敏度。使用針泵進樣，分別在正負離子模式下進行母離子掃描，除氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜在負離子模式下響應較好外，其余化合物均在正離子模式下響應較好，確定準分子離子峰后，優化碰撞能和去簇電壓，選擇響應最強的2個子離子分別作為定量離子和定性離子，并在MRM模式下優化碰撞能、去簇電壓、射入電壓。

離子源溫度指的是霧化氣氮氣溫度，如果離子源的溫度太低，會導致樣品分子溫度較低使電離效率降低，同時還會造成離子源的污染，因此理論上溫度越高離子化效率越好。但是試驗過程中發現，隨著離子源溫度增高到一定程度后，繼續升溫會導致部分目標化合物響應降低，有機磷類目標化合物尤其明顯。究其原因是過高的離子源溫度導致目標化合物發生了源內裂解，通過三重四級桿碎裂的定量離子和定性離子減少，導致響應變低。甲基異柳磷為硫代磷酰胺殺蟲劑，樂果為二硫代磷酸酯殺蟲劑，離子源溫度升高源內裂解明顯，裂解過程見圖1。試驗中分別考察了離子源溫度為200、300、350、400、450、500、600 ℃情況下各目標化合物的響應程度，溫度為350 ℃時各物質的總體響應最好，同時溫度的穩定性也比較好，因此離子源溫度設置為350 ℃。

2.1.2

流動相的優化。分別以甲醇和乙腈作為流動相進行試驗，發現乙腈的洗脫能力雖然比甲醇強，但是進入質譜后其離子化效率不如甲醇，菊酯類殺蟲劑離子化效率降低明顯，導致色譜峰響應非常低。采用甲醇作為流動相時，色譜峰形良好，同時各化合物的響應良好，因此采用甲醇作為有機相。考察了流動相中不同濃度甲酸溶液對目標峰的影響，試驗發現，加入低濃度甲酸能一定程度提高各目標峰的響應，但是隨著甲酸濃度的逐漸增大，大部分目標峰的響應隨之不同程度逐漸降低，因此最終流動相中加入0.01%的甲酸。同時考察了0.01%甲酸溶液、2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸溶液和2 mmol/L乙酸銨-0.01%甲酸溶液對目標峰的影響，流動相中加入銨鹽后目標峰的響應有所增強，同時2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸溶液作為流動相時比2 mmol/L乙酸銨-0.01%甲酸溶液作為流動相時大部分目標峰的響應增強，使用2種不同流動相時保留時間也有所變化。因此最終選擇2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸溶液和甲醇作為流動相。

2.1.3

色譜柱的選擇。該試驗中目標物在C18色譜柱上均有良好保留，且Waters Atlantis T3 C18柱保留效果優于其他色譜柱，選用Waters Atlantis T3 C18柱作為分析柱，36種農藥能基本分離。烯酰嗎啉和苯醚甲環唑分別有2個明顯的同分異構體峰，烯酰嗎啉同分異構體峰保留時間分別為10.01和10.96 min，苯醚甲環唑同分異構體峰保留時間分別為17.73和18.12 min，定量分析計算時均需以同分異構體峰面積加和計算。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1

提取溶劑的選擇。由于樣品基質的復雜性，提取溶劑應滿足既能很好地提取溶解目標化合物，又能減少對雜質的萃取。乙腈和丙酮是 QuEChERS 法常用的提取劑，此外酸化乙腈對許多分析物具有良好的萃取效率［14］，因此，該試驗比較了乙腈、1%乙酸乙腈和丙酮作為提取溶劑時對36種農藥的提取效率，結果顯示，以丙酮作為提取溶劑時，提取溶液的顏色相較于其他2種更深，原因在于丙酮不僅對于目標化合物有較好的溶解性，同時對多種雜質的溶解性也較好，導致較多雜質一并被提取，后續對凈化步驟要求較高。再經QuEChERS 法凈化后，上機分析，乙腈和1%乙酸乙腈提取的樣品方法回收率高于丙酮，同時，試驗中發現酸化后的乙腈對大部分目標化合物的回收率不如乙腈，最終選擇乙腈作為樣品提取劑。

2.2.2

凈化條件的優化。植物源性樣品中除糖類、蛋白質、氨基酸等，還存在色素等雜質，采用乙腈作為提取溶劑可以沉淀蛋白質等部分雜質，但也會將樣品中部分極性及非極性化合物等雜質提取出來，導致提取液中依然存在較多雜質。C18屬于非極性吸附劑，可以從樣品中吸附一些非極性干擾物質；PSA表面鍵合的氨基對于一些強極性雜質和金屬離子等具有良好的吸附效果；GCB可以去除具有平面結構的色素、多酚類等雜質［14］。結合這幾種吸附劑的作用機理，聯合使用。

按“1.3.2”樣品處理方法對各目標化合物加標濃度為0.05 mg/kg的復合果蔬汁樣品進行處理，取2.0 mL上清液，加入50 mg C18和50 mg PSA時，凈化效果已達到最佳，再單獨增加C18的含量，凈化效果沒有改變，單獨增加PSA的含量，會導致部分目標物回收率略微下降，因為PSA中的氨基會吸附部分酸性農藥，如甲胺磷、樂果。值得注意的是，凈化過程中水分的存在會影響凈化效率，其原因在于水會覆蓋PSA上氨的位點，導致PSA無吸附效果，因此需加入無水MgSO4進行除水，考慮到本份樣品水分含量較高，上清液中加入400 mg無水MgSO4，可到達除水效果。當樣品基質顏色較深時，可加入GCB進行除色。復合果蔬汁加標基質液為較深的橙黃色溶液，考察發現上清液中分別加入40、100、200、300、400 mg的GCB，大部分目標化合物加入40 mg GCB時的回收率較其他劑量的低，但100～400 mg GCB的加入量實際對試驗結果影響并無明顯差別，考慮經濟效率，實際試驗中GCB的加入量為100 mg。因此，最終確定凈化過程中各凈化劑的使用量為400 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18和100 mg GCB。

2.3 基質效應的考察

不同的農藥在不同樣品中基質效應區別較大，該研究采用相對響應值法［15］對基質效應進行評價：基質效應在60%以下視為強基質效應，60%～80%視為中基質效應，80%～120%視為弱基質效應。利用10種不同果蔬（番茄、芹菜、茄子、韭菜、姜、蘿卜、黃瓜、蔥、西葫蘆、白菜）基質的空白基質液配制50 ng/mL的基質標準溶液，與用乙腈配制的相同濃度的標準溶液進行比較。從圖2可以看出，芹菜、姜、蔥、韭菜的基質效應比較強，特別是姜的基質效應最強，有強、中基質效應的農藥殘留目標化合物占80%以上。黃瓜和番茄的基質效應最弱，沒有強基質效應的目標化合物。因此，該試驗中采用空白樣品基質液配制標準曲線溶液，以消除基質效應。

2.4 線性關系和方法檢出限

以復合果蔬汁作為基質樣品，按“1.3.2”處理得到空白樣品基質液，用空白樣品基質液配制標準曲線溶液，以峰面積為縱坐標（y）、濃度為橫坐標（x）繪制各目標物的標準曲線。峰保留時間、線性范圍、線性方程、相關系數（r）詳見表2。從表2可以看出，36種農藥在質量濃度為5.00～200.56 ng/mL線性關系良好（r≥0.991 0），方法檢出限為0.002～0.003 mg/kg，定量限為0.005～0.010 mg/kg。

2.5 精密度和回收試驗

選擇復合果蔬汁樣品作為加標樣品，進行加標試驗，加標濃度為2倍、5倍、10倍方法定量限濃度，每個濃度設定6份平行樣，分別考察低、中、高3個濃度水平的回收率和相對標準偏差（RSD），結果表明（表3），36種農藥的平均回收率為81.70%～117.38%，RSD為0.12%～11.41%。混標工作液重復進樣6次，考察儀器精密度，RSD為1.10%～4.19%。這表明該方法具有良好的準確性和精密度。

2.6 實際樣品測定

采用該試驗建立的方法隨機對30批次水果蔬菜進行檢測分析，每個樣品重復分析2次，結果顯示，8份樣品中共檢出5種農藥殘留，具體含量詳見表4。

3 結論

該試驗利用QuEChERS前處理方法，結合超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法建立了同時測定水果蔬菜中36種農藥殘留量的方法，改良了前處理方法，對儀器條件進行了優化，有效降低了基質效應，并進行了方法學試驗。建立的方法具有良好的線性關系、回收率及方法重復性，定量限和檢出限能滿足多種農藥殘留檢測。該方法對樣品中目標物的提取效率高、凈化過程簡單便捷，可高通量同時檢測36種農藥殘留，適用于大批量農產品的快速篩查檢測；檢測成本低，試劑耗材的用量小，試驗過程對環境的污染也較小。該方法的建立可為水果蔬菜中農藥殘留提供高效、快速、靈敏的監測手段，能廣泛應用于水果蔬菜中多種農藥殘留的分析檢測，為安全監管部門提供技術支持。

參考文獻

［1］ 馮東儀，陳楠，馬世柱，等.QuEChERS-氣質聯用儀測定蔬菜中58種農藥殘留的研究［J］.廣東化工，2022，49（17）：205-207，176.

［2］ 張瑤，馬桂娟，王紫昕，等.氣相色譜-質譜法結合固相萃取技術同時測定番茄中53種農藥殘留［J］.食品科技，2021，46（1）：292-297.

［3］ MOHAMMADI V，SARAJI M，JAFARI M T.Direct molecular imprinting technique to synthesize coated electrospun nanofibers for selective solid-phase microextraction of chlorpyrifos［J］.Microchimica acta，2019，186（8）：524.

［4］ 黃微，李娜，徐瑞晗，等.加速溶劑萃取-固相萃取凈化-氣相色譜-串聯質譜法檢測茶葉中9種擬除蟲菊酯類農藥殘留［J］.色譜，2018，36（12）：1303-1310.

［5］ 陸高峰.超臨界CO2萃取-氣相色譜法檢測生菜中有機氯農殘［J］.食品工業科技，2016，37（17）：288-291，296.

［6］ 李巧蓮，羅景陽，張宏宏，等.多壁碳納米管改進QuEChEＲS-液相色譜-串聯質譜法測定豆類中12 種酰胺類殺菌劑殘留量［J］.糧食與油脂，2023，36（1）：157-162.

［7］ 田金鳳.QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS法測定番茄中19種農藥殘留［J］.中國釀造，2022，41（12）：235-239.

［8］ 楊志敏，朱仁愿，薛華麗，等.改良QuEChERS-氣相色譜質譜聯用法測定金銀花中農藥殘留［J］.分析試驗室，2023，42（1）：49-56.

［9］ 黃微，馬玉鳳，孟怡璠，等.QuEChERS/氣相色譜－串聯質譜－內標前置法測定茶葉中37 種農藥殘留［J］.中國釀造，2022，41（8）：1221-1228.

［10］ 楊曉鳳，洪雪華，陳敏，等.凝膠滲透色譜凈化/氣相色譜-串聯質譜法同時測定大豆中23種酰胺類除草劑殘留量［J］.農藥，2021，60（3）：207-210.

［11］ 吳長青，王海璐，李潔君.蔬菜中農藥殘留檢測技術研究進展［J］.食品工業，2022，43（9）：200-205.

［12］ TOPUZ S，ZHAN G，ALPERTUNGA B.Simultaneous determination of various pesticides in fruit juices by HPLC-DAD［J］.Food control，2005，16（1）：87-92.

［13］ 肖泳，鄧航，潘照，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定動物源性食品中矮壯素殘留［J］.食品與發酵工業，2022，48（10）：272-277.

［14］ WANG K，ZHAO L Z，ZHANG C，et al.Determination of 12 insect growth regulator residues in foods of different matrixes by modified QuEChERS and UPLC-MS/MS［J］.RSC advances，2021，11（20）：12162-12171.

［15］ 宋瑩瑩，郭暢冰，王國明，等.氣相色譜測定人參和紅參中16種有機氯農藥殘留量的方法研究［J］.糧食與油脂，2022，35（11）：152-157，162.

［16］ 曹新悅，龐國芳，金鈴和，等.氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜和氣相色譜-串聯質譜對水果、蔬菜中208種農藥殘留篩查確證能力的對比［J］.色譜，2015，33（4）：389-396.

［17］ 邵麗，王曉，徐淑飛，等.氣相色譜-質譜聯用法快速篩查花生中44種農藥殘留［J］.安徽農業科學，2021，49（9）：182-184.