尿石素C 對人急性髓系白血病HL-60 細胞增殖、凋亡和自噬的影響及其機制

［摘 要］ 目的：探討尿石素C（UC） 對急性髓系白血病 （AML） HL-60細胞增殖、凋亡和自噬的影響，闡明其相關作用機制。方法：HL-60細胞分為不同濃度 （0、20、40、60、80及100 μmol·L－1）尿石素A （UA）、尿石素B （UB） 和UC 組，采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性，光學顯微鏡觀察不同濃度UC 組細胞形態表現；HL-60 細胞分為不同濃度（0、20、40 及80 μmol·L－1） UC 組和3-甲基腺嘌呤（3-MA） 聯合不同濃度（0、20、40 及80 μmol·L－1） UC 組，采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性。HL-60 細胞分為對照組和不同濃度（20、40 及80 μmol·L－1） UC 組，采用活/死細胞染色法檢測各組死細胞率，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，細胞自噬染色檢測試劑盒［單丹磺酰戊二胺（MDC） 法］ 檢測各組細胞自噬情況，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細胞中芐氯素1（Beclin 1）、自噬相關蛋白9 （ATG9） 和自噬相關蛋白7 （ATG7） mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （Caspase-3）、活化的Caspase-3 （Cleaved Caspase-3）、微管相關蛋白1 輕鏈3 （LC-3）、細胞外信號調節激酶（ERK）、磷酸化ERK （p-ERK）、AMP 依賴的蛋白激酶（AMPK）和磷酸化AMPK（p-AMPK）蛋白表達水平。結果：CCK-8法，培養24、48和72 h，分別與0 μmol·L－1 UA、UB 和UC 組比較， 不同濃度UA、UB 和UC 組細胞增殖活性均降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），且呈濃度和時間依賴性；48 h 時，與UA 和UB 比較，UC 半數抑制濃度（IC50） 最低。細胞形態表現，與對照組比較，隨著UC 濃度升高，細胞間連接和細胞數量減少，細胞碎片增加。CCK-8 法，與40 和80 μmol·L－1 UC 組比較，3-MA 聯合40 和80 μmol·L－1 UC 組細胞增殖活性升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）?；? 死細胞染色， 與對照組比較， 40 和80 μmol·L－1 UC 組死細胞率升高（Plt;0. 01）。流式細胞術，與對照組比較，80 μmol·L－1 UC 組細胞凋亡率升高（Plt;0. 01）。MDC 法，與對照組比較， 隨著UC 濃度升高， 不同濃度UC 組細胞綠色熒光逐漸增強。RT-qPCR 法， 與對照組比較， 80 μmol·L－1 UC 組細胞中Beclin 1、ATG9 和ATG7 mRNA 表達水平升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法，與對照組比較，20、40 和80 μmol·L－1 UC 組細胞中Cleaved Caspase-3 蛋白表達水平升高（Plt;0. 01），80 μmol·L－1 UC 組細胞中膜型LC3/胞漿型LC3 （LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） 比值升高（Plt;0. 05）， 40 和80 μmol·L－1 UC 組細胞中p-AMPK/AMPK 及p-ERK/ERK 比值升高（Plt;0. 01）。結論：UC可抑制人AML HL-60細胞增殖，誘導其細胞凋亡和自噬，并可提高細胞中ERK和AMPK蛋白磷酸化水平。

［關鍵詞］ 尿石素C； 白血病細胞； 細胞增殖； 細胞凋亡； 細胞自噬

［中圖分類號］ R733. 71; R979. 19 ［文獻標志碼］ A

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML） 是一種造血系統異常引起的血液系統惡性腫瘤，具有發病率高、發展迅速、侵襲性強、異質性高、生存期短和預后差等特征。AML 是成人白血病最常見的形式，其發病率逐年上升，診斷的中位年齡為68 歲，5 年生存率僅為30. 5% ［1-2］。目前針對AML 的治療方式主要包括聯合化療、靶向治療、造血干細胞移植和免疫療法［3］，但針對耐藥患者、老年患者和具有不良風險疾病特征的患者，仍需要探索新的治療藥物和方法。尿石素是鞣花單寧食物產生的腸道微生物代謝產物， 包括尿石素A（urolithin A， UA）、尿石素B （urolithin B，UB）、尿石素C （urolithin C，UC） 和尿石素D （urolithin D，UD）， 具有多種生物活性， 包括抗炎、抗癌、降糖、抗衰老和心血管及神經保護作用［4］。細胞自噬和凋亡是程序性細胞死亡途徑，細胞自噬和凋亡信號通路通過各種串擾機制相互連接調控腫瘤細胞活性，是許多抗癌藥物作用的靶點［5］。在膽管癌中，UA 可靶向絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threoninekinase， AKT） /WNK 賴氨酸缺陷型蛋白激酶1（WNK lysine-deficient protein kinase 1，WNK1） 軸誘導細胞自噬， 發揮抗腫瘤作用［6］。UB 和UC 對細胞自噬的影響尚未見報道。UA 和UB 可通過改變白血病細胞代謝，誘導細胞凋亡，發揮抗白血病的作用［7］，但UC 對白血病的作用尚未見相關報道。本研究以人AML HL-60 細胞為研究對象，探討UC對白血病細胞的作用， 并初步闡明其相關作用機制。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器

人 AML HL-60 細胞保存于濱州醫學院附屬醫院醫學研究中心。UA、UB、UC、細胞自噬抑制劑3- 甲基腺嘌呤（3-methyladenine ， 3-MA） 、磷酸酶抑制劑Cocktail Ⅰ和Cocktail Ⅱ購于美國MCE 公司，凋亡檢測試劑盒、CCK-8 試劑盒和活/死細胞活性/毒性檢測試劑盒購于蘇州優逸蘭迪有限公司，抗α 微管蛋白（α-tubulin） 抗體和細胞自噬染色檢測試劑盒購于北京碧云天生物技術有限公司，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cysteinyl aspartatespecific proteinase-3， Caspase-3）、活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）、細胞外信號調節激酶（extracellular regulated proteinkinases， ERK）、磷酸化ERK （phosphorylated-ERK， p-ERK）、AMP 依賴的蛋白激酶（AMPactivatedprotein kinase， AMPK） 和磷酸化AMPK（phosphorylated-AMPK，p-AMPK） 抗體購于美國CST 公司， BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于上海博彩生物有限公司， RIPA 裂解液購于北京索萊寶生物技術有限公司， 特超敏ECL 化學發光即用型底物購于武漢博士德生物有限公司，實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒購于蘇州近岸蛋白有限公司，細胞總RNA 提取試劑盒購于美國Omega 公司，反轉錄試劑盒購于美國賽默飛公司， RPMI 1640培養基、胎牛血清和青-鏈霉素雙抗購于上海逍鵬生物有限公司。二氧化碳細胞培養箱和生物安全柜購于新加坡Esco 公司， 全自動細胞計數儀購于上海睿鈺生物科技有限公司， 倒置顯微鏡購于日本Olympus 公司， 多功能微孔板檢測儀購于美國安捷倫科技有限公司， 流式細胞儀購于美國BD 公司， 微量紫外分光光度儀和高速離心機購于德國Eppendorf 公司， 熒光定量PCR 儀和成像系統購于美國Bio-Rad 公司。

1. 2 細胞培養、分組和處理

HL-60細胞在含10%胎牛血清和1% 青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養基中，置于37 ℃和5% CO2的培養箱中培養。

1. 3 CCK-8 法 檢 測 不 同 濃 度 UA、UB 和 UC 組HL-60細胞增殖活性

取對數期HL-60細胞接種于96 孔細胞培養板，每孔接種5×103個細胞，分別用不同濃度（0、20、40、60、80 及100 μmol·L－1）UA、UB 和UC 分別處理24、48 及72 h；取對數生長期HL-60 細胞接種于96 孔細胞培養板， 每孔接種5×103 個細胞， 分為不同濃度（0、20、40 和80 μmol·L－1） UC 組和3-MA 聯合不同濃度（0 、20、40和80 μmo·l L－1） UC組，細胞經1 mmo·l L－1 3-MA預處理2 h 后分別加用不同濃度（ 0 、20 、40 和80 μmol·L－1） UC 處理48 h。離心去除培養基，每孔加入100 μL 培養基和10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測波長450 nm 處的吸光度（A） 值， 計算各組細胞增殖活性， 細胞增殖活性= （實驗組A 值－ 空白組A 值） / （對照組A 值－空白組A 值）；采用Graphad Prism 8. 0. 1 統計軟件計算UA、UB 和UC 的半數抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）。

1. 4 光學顯微鏡觀察各組細胞形態表現

取對數生長期HL-60 細胞接種于6 孔細胞培養板，每孔接種6×105 個細胞， 分為對照組和不同濃度（20、40 和80 μmol·L－1） UC 組， 處理24 h 后光學顯微鏡觀察各組細胞形態表現。

1. 5 活/死細胞染色法檢測各組細胞中死細胞率

取對數生長期HL-60 細胞接種于12 孔細胞培養板中，每孔接種4×105 個細胞。分別用0、20、40 和80 μmol·L－1 UC 處理18 h，0 μmol·L－1 UC 組為對照組， 300 g 離心5 min 收集各組細胞，加入2 μmol·L－1 Calcein AM 和 4. 5 μmol·L－1 碘化丙啶（propidium iodide， PI） 染色工作液， 混勻，室溫孵育15 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，熒光顯微鏡下觀察各組細胞，并計算死細胞率。死細胞率=死細胞數/ （活細胞數+死細胞數） ×100%。

1. 6 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

取對數生長期HL-60 細胞接種于6 孔細胞培養板中，每孔接種6×105個細胞，分別用0、20、40 和80 μmol·L－1UC 處理24 h， 0 μmol·L－1 UC 組為對照組， 300 g離心5 min 收集各組細胞， PBS 緩沖液洗滌3 次，加入200 μL PBS 緩沖液重懸細胞， 加入4 μLAnnexin Ⅴ-FITC 混勻，再加入5 μL PI 混勻，避光孵育15 min 后上機檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。

1. 7 細胞自噬染色檢測試劑盒［單丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）法］檢測各組細胞自噬情況

取對數生長期 HL-60細胞接種于 12孔細胞培養板中， 每孔接種4×105 個細胞， 分別用0、20、40 和80 μmol·L－1 UC 處理24 h， 0 μmol·L－1UC 組為對照組，300 g 離心5 min 收集細胞，加入Assay Buffer 稀釋后的1×MDC， 在細胞培養箱中37 ℃ 避光孵育30 min 。用Assay Buffer 洗滌細胞3 次。熒光顯微鏡下用紫外激發光激發，觀察綠色熒光強度，即細胞自噬的特征性變化。

1. 8 RT-qPCR法檢測各組細胞中 Beclin 1、ATG9和 ATG7 mRNA 表達水平

HL-60細胞經 0、20、40 和80 μmol·L－1 UC 處理24 h，0 μmol·L－1 UC 組為對照組，離心收集各組細胞，用總RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA 作為qPCR模板。根據SYBR Green 熒光定量試劑盒說明書進行熒光定量擴增，采用2－ΔΔCt 法計算各組細胞中目的基因mRNA 表達水平。引物序列：Beclin 1，上游引物5'-CCATGCAGGTGAGCTTCGT-3'， 下游引物5'-G-AATCTGCGAGAGACACCATC-3'；ATG9， 上游引物5'- CTGCCCTTCCGTATTGCAC-3'， 下游引物5'- CTCACGTTTGTGGATGCAGAT-3'； ATG7， 上游引物5'- CAGTTTGCCCCTTTTAGTAGTGC-3'， 下游引物5'-CCAGCCGATACTCGTTCAGC-3'； GAPDH， 上游引物5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'， 下游引物5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。

1. 9 Western blotting法檢測各組細胞中Caspase-3、Cleaved Caspase-3、膜 型 LC3（LC3-Ⅱ）、胞 漿 型LC3（LC3-Ⅰ）、AMPK、ERK、p-AMPK和p-ERK蛋白表達水平

HL-60細胞經0、20、40和80 μmol·L－1UC 處理24 h， 0 μmol·L－1 UC 組為對照組， 離心收集各組細胞，用含有蛋白酶抑制劑PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解細胞，提取總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度， 加入上樣緩沖液，100 ℃ 變性10 min。取20 μg 蛋白樣品進行SDSPAGE凝膠電泳， 濕轉法將蛋白轉至0. 22 μm 的PVDF 膜， 5% 脫脂奶粉封閉， 加入一抗4 ℃封閉過夜， 經TBST 洗滌后， 加入二抗室溫孵育1 h，經TBST 洗滌后， 加入ECL 顯影液進行顯影。Image J 軟件進行灰度識別，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值；計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK 和p-ERK/ERK 比值。

1. 10 統計學分析

采用GraphPad Prism 8. 0. 1統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖活性、死細胞率和細胞凋亡率， 各組細胞中Beclin 1、ATG9和ATG7 mRNA 表達水平，各組細胞中Caspase-3、Cleaved Caspase-3 蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK 和p-ERK/ERK 比值均符合正態分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 不同濃度 UA、UB 和 UC 組細胞增殖活性及UA 、UB 和UC 的IC50 值

培養24 h 時， 分別與0 μ mol·L － 1 UA 、UB 和UC 組比較， 不同濃度UA 組和UC 組及100 μmol·L－1 UB 組細胞活性降低（ Plt;0. 05 或Plt;0. 01）； 48 和72 h 時， 分別與0 μmol·L－1 UA、UB 和UC 組比較， 不同濃度UA、UB 和UC 組細胞增殖活性均降低（Plt;0. 01）， 且呈濃度和時間依賴性。UA、UB 和UC作用于HL-60 細胞48 h 的IC50 值分別為18. 25、28. 91 和16. 14 μmol·L－1。見圖1。

2. 2 各組細胞形態表現

光學顯微鏡觀察：與對照組比較， 隨著UC 濃度的增加， 不同濃度UC組細胞間連接和細胞數量減少， 細胞碎片增加。見圖2。

2. 3 抑制 自 噬 后 各 組 細 胞 增 殖 活 性

與 0和20 μmo·l L－1 UC 組比較，3-MA 聯合0 和20 μmol·L－1UC 組細胞增殖活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；與40 和80 μmol·L－1 UC 組比較，3-MA 聯合40 和80 μ mol·L － 1 UC 組細胞增殖活性升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖3。

2. 4 各組死細胞率

與對照組（1. 00%±0. 21%）比較， 20 μmol·L－1 UC 組細胞中死細胞率（5. 22%±0. 88%） 差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， 40 和80 μmol·L－1 UC 組細胞中死細胞率（11. 82% ± 1. 90% 和23. 65% ± 0. 26%） 升高（Plt;0. 01）。見圖4。

2. 5 各 組 細 胞 凋 亡 率

與 對 照 組 （3. 02%±0. 55%） 比較， 20 和40 μmol·L－1 UC 組細胞凋亡率（3. 74%±1. 06% 和4. 13%±0. 62%） 差異無統計學意義（Pgt;0. 05），80 μmol·L－1 UC 組細胞凋亡率（11. 09%±1. 98%） 升高（Plt;0. 01）。見圖5。

2. 6 各組細胞自噬情況

與對照組比較，隨著UC 濃度升高，不同濃度UC 組細胞綠色熒光逐漸增強，表明細胞中自噬體產生增多。見圖6。

2. 7 各組細胞中 Beclin 1、ATG9和 ATG7 mRNA表 達 水 平

與 對 照 組 （Beclin1： 1. 00±0. 04；ATG9：1. 00±0. 06；ATG7：1. 00±0. 05） 比較，20 和40 μmol·L－1 UC 組細胞中Beclin 1、ATG9 和ATG7 mRNA 表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05），80 μmol·L－1 UC 組細胞中Beclin 1、ATG9和ATG7 mRNA 表達水平（1. 68±0. 08、2. 49±0. 17 和1. 69±0. 05） 升高（Plt;0. 01）。

2. 8 各組細胞中 Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3蛋白表達水平

各組細胞中 Caspase-3蛋白表達水平基本一致， 組間比較差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。與對照組（1. 00±0. 01） 比較，20、40 和80 μmol·L－1 UC 組細胞中Cleaved Caspase-3 蛋白表達水平（4. 09±0. 19、6. 14±0. 22 和15. 22±0. 83） 升高（Plt;0. 01）。見圖7。

2. 9 各組細胞中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

與對照組（1. 00±0. 01） 比較，20 和40 μmol·L－1 UC 組細胞中LC3-Ⅱ/LC3- Ⅰ比值（0. 97±0. 03 和1. 50±0. 09）差異無統計學意義（Pgt;0. 05），80 μmol·L－1 UC 組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（2. 63±0. 53） 升高（Plt;0. 05）。見圖8。

2. 10 各 組 細 胞 中 p-AMPK/AMPK 和 p-ERK/ERK 比 值

與 對 照 組 （1. 00±0. 01） 比 較 ，40 和80 μmol·L－1 UC 組p-AMPK/AMPK 比值（4. 54±0. 36 和7. 99±0. 49） 升高（Plt;0. 01）；與對照組（1. 00±0. 01） 比較， 40 和80 μmol·L－1UC 組p-ERK/ERK 的比值（2. 01±0. 12 和2. 74±0. 17） 升高（Plt;0. 01）。見圖9。

3 討 論

AML 是一種異質性和侵襲性的造血系統惡性腫瘤， 盡管化療和造血干細胞移植有了很大的進步， 但仍有35%～45% 患者難以治愈或復發［8］。難治性/復發性AML 患者預后不佳，3 年生存率低于10% ［9］。對于難治性/復發性AML 患者尚無標準的挽救性治療措施，迫切需要新的治療方法。在AML 的治療中，中藥及中藥中的天然化合物作為一種輔助藥物已被應用于臨床［10-11］。尿石素是腸道微生物對鞣花單寧和富含鞣花酸食物（石榴、漿果和堅果） 的次生多酚代謝產物，是一類新的抗癌化合物，可通過細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡、促進細胞自噬及衰老和調節癌基因轉錄等機制發揮抗癌作用［12-13］。研究［7］ 表明：UA 和UB 可通過改變白血病細胞代謝、抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡發揮治療白血病的功能。在本研究中， 分別檢測了UA、UB 和UC 對白血病細胞增殖的抑制作用，結果顯示：三者均可抑制HL-60 細胞增殖，均具有抗白血病活性，48 h 時UC 的IC50值最低，表明UC 抗白血病細胞增殖的效果更好。

細胞自噬和凋亡是程序性細胞死亡途徑。Caspase-3 在細胞凋亡中起重要作用， 當細胞接受凋亡刺激時， Caspase-3 可被剪切成CleavedCaspase-3，進而誘導細胞發生凋亡。研究［6］ 表明：UA 主要通過靶向蛋白質的磷酸化過程和P53 蛋白發揮抗癌活性。在結腸癌中，UA 可通過P53 通路誘導細胞衰老， 抑制細胞增殖［14-16］。UA 可通過調控磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） /AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR） 通路的磷酸化水平， 誘導胰腺癌細胞凋亡發揮抗癌作用［17］。UB 也具有抗癌活性， 可通過誘導Wnt/β - 連環蛋白（β-catenin） 通路的失活抑制肝癌細胞增殖［18］， 通過抑制基質金屬蛋白酶2 （matrixmetalloproteinases-2，MMP-2） 和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9， MMP-9） 蛋白活性及P53 蛋白表達誘導膠質瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期［19-20］。本研究結果表明：UC 可誘導HL-60 細胞凋亡，增加死細胞率，促進Caspase-3 蛋白的剪切水平，表明UC 具有促細胞凋亡作用。細胞自噬也是細胞程序性死亡的形式之一，與腫瘤的發生發展有密切關聯。LC3 蛋白全程參與自噬形成，LC3-Ⅰ會被酶解成為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值常作為自噬的指標。UA 還可通過誘導細胞自噬發揮抗腫瘤作用［21-22］。UC 對細胞自噬的影響尚未見報道。本研究結果表明：不同濃度UC 組HL-60 細胞中MDC 綠色熒光增強，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和自噬相關基因Beclin 1、ATG9及ATG7 mRNA 表達水平升高，表明UC 可誘導細胞自噬；同時自噬抑制劑3-MA 處理可提高UC 誘導的細胞增殖活性降低，進一步說明UC 具有促進白血病細胞自噬的作用。

研究［23-24］ 表明： UC 可通過介導ERK 蛋白的磷酸化水平參與胰島素的信號轉導， 通過AMPK信號通路調節腸道微生物群對抗非酒精性脂肪肝。AMPK 參與調控腫瘤細胞的代謝途徑、線粒體動力學和線粒體功能及表觀遺傳調控的異常激活，調控腫瘤的各項特征， 可作為天然中草藥的作用靶點［25-26］。AMPK 可通過調控自噬相關蛋白直接或間接促進細胞自噬［27］。ERK 通路是癌癥治療的重要靶點，許多抗癌藥物可誘導ERK 活化，進而發揮抑制細胞增殖并促進細胞凋亡的抗癌作用［23］。本研究結果表明：UC 可明顯促進HL-60 細胞中ERK和AMPK 的磷酸化水平。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實UC 具有抑制白血病細胞HL-60 細胞增殖、誘導細胞凋亡和自噬的功能， 其機制可能是UC 通過提高ERK 和AMPK 蛋白的磷酸化水平，進一步促進AMPK 下游基因表達進而發揮抗癌作用。UC 治療白血病的作用還需通過動物體內實驗進一步驗證， 以期為UC 作為治療白血病的潛在藥物提供實驗依據。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

于國興參與實驗設計、數據分析和論文撰寫，張鑫參與數據采集，杜恒偉參與論文撰寫和修改，崔冰潔參與數據收集和實驗指導，高娜參與研究設計，劉翠蘭參與指導實驗過程和論文撰寫及修改，杜靜參與整體研究過程指導。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（82373097）；國家自然科學基金青年基金項目（31900441）；山東省泰山學者青年專家和齊魯衛生與健康杰出青年人才項目（tsqn202103191）；山東省衛健委中醫藥科技基金項目（Q-2022121）