基于消斑通脈方抗動脈粥樣硬化作用機制的網(wǎng)絡藥理學分析和體外實驗驗證

［摘 要］ 目的：利用網(wǎng)絡藥理學分析方法初步預測消斑通脈方抗動脈粥樣硬化 （AS） 的潛在作用通路和靶點，聯(lián)合體外細胞實驗對其可能機制進行驗證。方法：采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、GeneCards、Swiss Target Prediction 和Uniprot 等數(shù)據(jù)庫，收集消斑通脈方中活性化合物及對應靶點信息，構(gòu)建“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，通過蛋白-蛋白互作（PPI） 網(wǎng)絡預測可能的作用靶點和通路， 對交集靶點進行基因本體論（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 信號通路富集分析。體外培養(yǎng)人主動脈血管平滑肌細胞（HA-VSMCs） 并鑒定，采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL） 誘導HA-VSMCs 異常增殖并進行鑒定。MTT 法檢測不同濃度消斑通脈方作用后各組 HA-VSMCs 增殖活性，確定消斑通脈方安全性。HA-VSMCs 分為空白組、模型組（誘導HA-VSMCs 異常增殖）、瑞舒伐他汀組（誘導HA-VSMCs 異常增殖后采用4 μmol·L?1 瑞舒伐他汀干預） 及低、中和高劑量消斑通脈方組（誘導HA-VSMCs 異常增殖后分別采用0. 025、0. 050 和0. 100 mg·L?1消斑通脈方干預）。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 法檢測各組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中人單核細胞趨化蛋白1 （MCP-1）、白細胞介素6 （IL-6） 和白細胞介素8 （IL-8） 水平，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組HA-VSMCs 中核因子κB （NF- κB） p65 mRNA 和成纖維細胞生長因子2（FGF2） mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組HA-VSMCs 中 NF- κB p65 和 FGF2 蛋白表達水平。結(jié)果：消斑通脈方中含有103種活性成分，可通過作用于189個靶基因發(fā)揮抗AS作用，潛在作用靶點包括IL-6、IL-8、血管內(nèi)皮生長因子A （VEGFA）、核因子κB1 （NF-κB1） 和RELA （NF-κBp65） 等。GO 功能分析和KEGG 信號通路富集分析， 消斑通脈方通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)、缺氧誘導因子1（HIF-1）、表皮生長因子（EGF）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B （PI3K/Akt） 和NF-κB 等信號通路發(fā)揮抗AS 作用。細胞形態(tài)表現(xiàn)和免疫熒光染色結(jié)果證明細胞為HA-VSMCs。油紅O 染色，可觀察到大量紅色脂滴，表明造模成功。MTT 法檢測，在一定劑量范圍內(nèi)消斑通脈方對HA-VSMCs 增殖率無明顯影響， 安全性良好。ELISA 法檢測， 與模型組比較， 瑞舒伐他汀組和不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中MCP-1 和IL-6 水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），0. 050 和0. 100 mg·L?1 消斑通脈方組HA-VSMC 培養(yǎng)上清中IL-8 降低（Plt;0. 01）；與瑞舒伐他汀組比較，不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中MCP-1 降低（Plt;0. 01），0. 050 和0. 100 mg·L?1消斑通脈方組HA-VSMCs培養(yǎng)上清中IL-8 降低（Plt;0. 01）。與模型組比較，瑞舒伐他汀組和不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs中NF-κB p65 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 01），瑞舒伐他汀組及0. 050 和0. 100 mg·L?1消斑通脈方組HA-VSMCs 中FGF2 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 01）；與瑞舒伐他汀組比較，0. 050 和0. 100 mg·L?1消斑通脈方組HA-VSMCs 中NF-κB p65 和FGF2 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。與模型組比較，瑞舒伐他汀組和不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs 中NF-κB p65 和FGF2 蛋白表達水平降低（Plt;0. 01）； 與瑞舒伐他汀組比較， 0. 050 和0. 100 mg·L?1 消斑通脈方組HA-VSMCs 中NF- κBp65 蛋白表達水平降低（Plt;0. 01），0. 100 mg·L?1消斑通脈方組HA-VSMCs 中FGF2 蛋白表達水平降低 （Plt;0. 01）。結(jié)論：消斑通脈方具有抗炎、抑制HA-VSMCs增殖和抗AS作用，其作用機制可能與NF-κB/FGF2 通路失活有關。

［關鍵詞］ 消斑通脈方； 動脈粥樣硬化； 血管平滑肌細胞； 網(wǎng)絡藥理學； 細胞增殖

［中圖分類號］ R285. 5；R541. 4 ［文獻標志碼］ A

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS） 是多數(shù)心腦血管疾病的基礎病變，主要病理過程是血管內(nèi)皮慢性損傷和脂質(zhì)浸潤等使內(nèi)皮下泡沫細胞積累，進而平滑肌細胞泡沫化，逐漸形成斑塊，最終參與血管鈣化的形成［1］，其發(fā)生發(fā)展與血管內(nèi)皮細胞功能障礙、氧化應激、脂質(zhì)代謝異常、糖尿病、管壁壓力增高和異常剪切力等因素有密切關聯(lián)［2］。AS緩慢發(fā)展，可導致頸動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病） 和心肌纖維化等，甚至斑塊繼發(fā)不穩(wěn)定性出血，甚至斑塊破裂，導致動脈血栓，患者可出現(xiàn)眩暈和心絞痛甚至心臟驟停等臨床表現(xiàn)［3］。現(xiàn)代醫(yī)學對于AS 的治療以抗凝血、調(diào)血脂、抗炎和預防血栓為主，常靶向預防斑塊破裂，采用抗氧化劑、降脂藥和鈣通道阻滯劑等治療［4］，但臨床效果欠佳，雖能減緩疾病的進程，但不良反應較多。中醫(yī)藥防治AS 在控制癥狀、降低病死率和再住院率方面有明顯優(yōu)勢［5］，近年來中醫(yī)藥療法輔助治療AS 等心腦血管類疾病臨床效果較好，中藥復方湯劑、中成藥、中藥注射液和針灸等均有臨床應用價值［6］。中醫(yī)治療多從活血化瘀、化痰降濁、扶助正氣和痰瘀共治等方面入手［7］， 立足整體，全面調(diào)節(jié)機能，強調(diào)辨證論治，且中藥具有多途徑和多環(huán)節(jié)干預的綜合優(yōu)勢，可更好地防治AS。

消斑通脈方是第六批全國老中醫(yī)專家學術經(jīng)驗繼承工作指導老師崔應民教授團隊的自擬方，由西洋參、蒸首烏、生水蛭、丹參、三七、瓜蔞皮和天麻組成，有化痰祛瘀通絡和益氣補虛扶正的功效，對于AS 導致的斑塊形成和冠心病等心腦血管疾病臨床療效確切。實驗研究［8-16］ 已證明：消斑通脈方中的中藥及其中所含成分具有降脂、抗炎、抗氧化和抑制血小板聚集等作用。闡明復方消斑通脈方作用機制，對于防治AS 相關心腦血管疾病具有重要意義。消斑通脈方已在臨床上應用數(shù)十年，療效確切，但其作用機制尚未明確。本文作者采用網(wǎng)絡藥理學方法和體外實驗分析消斑通脈方對于 AS 的潛在作用機制， 主要從核因子 κB （nuclear factorkappa B， NF-κB） 信號通路相關因子和成纖維細胞生長因子2 （fibroblast growth factor 2， FGF2）表達情況探討AS 炎癥病理過程，初步闡明消斑通脈方抗AS 的機制，為其防治AS 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 消斑通脈方活性成分和相應靶點篩選

本研究應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine SystemsPharmacology Database and Analysis Platform ，TCMSP）（https ： //tcmsp-e. com/） 搜索消斑通脈方組成中藥西洋參、何首烏、水蛭、丹參、三七、瓜蔞皮和天麻，根據(jù)藥代學調(diào)整標準，滿足中藥口服生物利用度（oral bioavailability， OB） ≥30% 且類藥性（drug-likeliss， DL） ≥0. 18 篩選出有效化學成分和對應的靶點基因信息；TCMSP 中無法搜索到的中藥以評分（Score） ≥30 且P≥0. 05 為條件，于基于網(wǎng)絡藥理學信息分析工具的中藥分子作用機制分析系統(tǒng)（BioinformaticsAnalysis Tool for Molecular Chemnaism ofTraditional Chinese Medicine， BATMAN-TCM）（http：//bionet. ncpsb. org. cn/batman-tcm/） 再次進行搜索。各數(shù)據(jù)庫中未收錄的中藥或成分，首先查閱文獻獲取有效成分結(jié)構(gòu)［14］， 再 應 用 SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//old.swisstargetprediction. ch/） 進行靶點預測。

1. 2 疾病靶點收集

以“atherosclerosis”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www. genecards.org/） 中收集Score≥1 的AS 相關靶點和在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM） 數(shù)據(jù)庫（https：//omim. org/） 中推薦的AS相關靶點，進行匯總?cè)コ貜托畔ⅰ?/p>

1. 3 中 藥 -活 性 化 合 物 -靶 點 網(wǎng) 絡 構(gòu) 建

通 過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org/） 中“Retrieve/ID mapping” 將蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因名稱，利用該數(shù)據(jù)庫再次篩選和規(guī)范名稱，去掉無法查詢到及未經(jīng)驗證人類（Human） 靶點信息。將藥物與疾病的交集靶點及藥物活性化合物制作成Network 和Type 表格文件，導入Cytoscape 3. 8. 2 中繪制網(wǎng)絡關系圖。

1. 4 構(gòu) 建 蛋 白 - 蛋 白 互 作（protein-proteininteraction， PPI）網(wǎng)絡和 Hub基因網(wǎng)絡

將交集靶點上傳至STRING 11. 5 數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db. org/） 中， 選擇物種為人源（ Homo Sapiens），最低相互作用閾值設定為高置信度0. 7，證據(jù)類型設置為來源于實驗、數(shù)據(jù)庫和共表達等，建立PPI網(wǎng)絡。將PPI 網(wǎng)絡tsv 文件導入Cytoscape 3. 8. 2 軟件，應用 CytoHuuba 插件繪制 Hub 基因網(wǎng)絡圖。

1. 5 消斑通脈方對 AS作用靶點的富集分析

將交集靶點上傳至DAVID Bioinformatics Resources數(shù)據(jù)庫， 進行基因本體論（Gene Ontology， GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 信號通路富集分析，將結(jié)果保存至Excel 表格中進行處理，于微生信在線網(wǎng)站（http：//www. bioinformatics.com. cn/） 進行可視化分析。

1. 6 實驗細胞、主要材料和儀器

人主動脈血管平滑肌細胞（human aortic vascular smooth musclecells ，HA-VSMCs） 購于上海一研科技有限公司，細胞復蘇后傳代至3～5 代備用。消斑通脈方購于張仲景大藥房鄭州市學理路店， 其組成成分為西洋參15 g、生水蛭10 g、蒸首烏12 g、丹參15 g、三七8 g、瓜蔞皮15 g 和天麻10 g。按上述組成稱取消斑通脈方2 付（約為172. 8 g），將其中6 味藥西洋參、丹參、蒸首烏、三七、瓜蔞皮和天麻用70% 乙醇回流提取2 次，每次1. 5 h；同時將生水蛭用純水回流提取2 次，每次1. 5 h。提取結(jié)束后將上述各溶液混勻， 真空抽濾濾去殘渣， 置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45 ℃減壓回收，待液體出現(xiàn)黏稠和掛壁且濃縮液體積剩余1/5 時停止?jié)饪s，將其置于蒸發(fā)皿內(nèi)于真空烘箱中恒溫干燥成稠膏狀，在真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥，將凍干后的消斑通脈方刮藥，粉碎細化制備成凍干粉，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩＞芊Q取100 mg 凍干粉于10 mL 離心管內(nèi)，加入5 mL DMEM 培養(yǎng)基充分溶解，應用0. 22 μm濾膜除菌后得到濃度為20 g·L?1藥液， 后續(xù)進行稀釋即可。單核細胞趨化因子1（monocyte chemotactic protein-1， MCP-1） 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒、白細胞介素6 （interleukin-6，IL-6） ELISA 試劑盒和白細胞介素8 （interleukin-8，IL-8） ELISA 試劑盒均購自武漢云克隆科技股份有限公司， 氧化低密度脂蛋白（oxidized low-densitylipoprotein，ox-LDL） 購于廣州奕源生物科技有限公司，瑞舒伐他汀粉購自上海源葉生物科技有限公司， 4% 多聚甲醛組織固定液、Triton X-100、5%BSA 封閉液、4' ， 6- 二脒基-2- 苯基吲哚（4'， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 溶液和抗熒光衰減封片劑購于北京索萊寶科技有限公司，油紅O 染液購于美國Sigma 公司，蘇木素染液購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，NF-κB p65 一抗（貨號： 3033S） 購于美國CST 公司， FGF2 一抗（貨號： ab208687） 購于英國Abcam 公司， 內(nèi)參Lamin B 抗體（貨號：bs-23709R） 和β -actin 抗體（貨號：bsm-33034M） 購于北京博奧森生物技術有限公司，二抗山羊抗小鼠IgG （貨號：LF101） 購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，二抗山羊抗兔IgG （貨號：STAR208P） 購于北京安諾倫生物科技有限公司，核蛋白提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號：EYEL4N-1100）購于上海愛朗儀器有限公司，循環(huán)水式多用真空泵（型號：SHZ-D） 購于鄭州科豐儀器設備有限公司，真空冷凍干燥機購于南京載智自動化設備有限公司， 細胞微孔成像檢測儀（型號： C5） 購于美國BioTeK 公司，低溫離心機（型號：Sorvall ST 16R）購于美國Thermo公司，激光共聚焦（型號：FV1200）購于日本Olmpus 公司， 凝膠成像系統(tǒng)（型號：ChemiDoc MP） 購于美國Bio-Rad 公司， 7500fastPCR 儀（型號：9700） 購于美國ABI 公司。

1. 7 HA-VSMCs 鑒 定

取 生 長 狀 態(tài) 良 好 的HA-VSMCs， 以每孔2×104 個細胞的密度接種于12 孔細胞培養(yǎng)板中， 次日細胞生長狀態(tài)良好即可用于實驗。從細胞培養(yǎng)板中取出蓋玻片， 用PBS緩沖液漂洗3 次，每次 2 min，用4% 多聚甲醛組織固定液固定 30 min， PBS 緩沖液清洗 3 次， 每次5 min。以含5%BSA 和PBST 的封閉液封閉，室溫封閉 1 h。一抗孵育： 吸棄封閉液，加入一抗200 μL，4 ℃反應過夜。二抗孵育：取出反應后的12 孔細胞培養(yǎng)板， 用 PBS 緩沖液漂洗3 次， 避光條件下加入熒光標記的二抗稀釋液每孔200 μL，37 ℃避光反應 1 h。PBS 漂洗3 次，終止反應，每孔加入DAPI 200 μL， 室溫避光孵育5 min。PBS 緩沖液漂洗3 次，以抗熒光猝滅封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察HA-VSMCs 形態(tài)表現(xiàn)。

1. 8 ox-LDL 濃度篩選

取對數(shù)期 HA-VSMCs，96 孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μL 細胞懸液（5 000 個細胞），置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)，分為空白組和不同濃度（0. 012 5、0. 025 0、0. 050 0、0. 100 0 和0. 200 0 mg·L?1） ox-LDL 組。24 h 后每孔加入含不同濃度ox-LDL 的完全培養(yǎng)基100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，24 h 后取出細胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8 溶液并混勻， 培養(yǎng)箱孵育4 h。采用酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞增殖活性。

1. 9 油紅O染色法鑒定HA-VSMCs表型轉(zhuǎn)換

取適量第4～10 代處于對數(shù)生長期的HA-VSMCs，以每孔2×104 個細胞的密度接種至12 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，分別在空白組和模型組孔中加入1 mL完全培養(yǎng)基和含0. 10 mg·L?1 ox-LDL 的1 mL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，PBS 緩沖液清洗2 次，每孔加入 4% 多聚甲醛組織細胞固定液 1 mL 固定 20～30 min，再用PBS 緩沖液清洗3 次，加入60% 異丙醇分化5 s， 迅速用PBS 緩沖液清洗2 次， 加入新配制的油紅 O 染色工作液， 20～30 min 后移去染色液，加入蘇木素染液，2 min 后用PBS 緩沖液清洗，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1. 10 MTT 法 檢 測 各 組 HA-VSMCs 增 殖 活 性

①取對數(shù)生長期HA-VSMCs，以每孔5 000 個細胞的密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后，按以下分組方法進行處理： 空白組， 加含10% 血清的完全培養(yǎng)基；不同劑量消斑通脈方組，分別加入含0. 025、0. 050、0. 100、0. 200、0. 400、0. 800 和1. 600 mg·L-1 消斑通脈方的完全培養(yǎng)基200 μL。② 取對數(shù)生長期 HA-VSMCs， 以每孔5 000 個細胞的密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至融合度70%～80%，按以下分組方法進行處理：空白組，加入含10% 血清的完全培養(yǎng)基；模型組， 加入含 100 mg·L?1 ox-LDL 的完全培養(yǎng)基；瑞舒伐他汀組，加入含100 mg·L?1 ox-LDL 和4 μmol·L?1瑞舒伐他汀的完全培養(yǎng)基； 消斑通脈方組，加入含 100 mg·L?1 ox-LDL 和不同劑量（0. 025、0. 050、0. 100、0. 200、0. 400 和0. 800 mg·L?1）消斑通脈方的完全培養(yǎng)基。③37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)24 h 后取出細胞培養(yǎng)板，棄上清，每孔加入新鮮配制的0. 005 g·L?1 MTT 100 μL， 孵育4 h。每孔中加入150 μL 二甲基亞砜， 孵育20 min，采用酶標儀檢測490 nm 波長處吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞增殖活性。

1. 11 ELISA法檢測各組HA-VSMCs培養(yǎng)上清中MCP-1、IL-6和 IL-8水平

將 HA-VSMCs 以每孔5 000 個細胞的密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長至密度70%～80% 時， 按以下分組方法進行處理： 空白組， 加入含10% 血清的完全培養(yǎng)基；模型組，加入含0. 1 mg·L?1ox-LDL 的完全培養(yǎng)基；瑞舒伐他汀組，加入0. 1 mg·L?1ox-LDL和4 μmol·L?1瑞舒伐他汀的完全培養(yǎng)基；消斑通脈方組，加入含0. 1 mg·L?1 ox-LDL 和不同劑量消斑通脈方（0. 025、0. 050 和0. 100 mg·L?1） 的完全培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)24 h 后取出細胞培養(yǎng)板，取各組細胞培養(yǎng)上清，離心20 min，留取上清，采用ELISA 法檢測各組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中MCP-1、IL-6 和IL-8 水平。

1. 12 RT-qPCR 法 檢 測 各 組 HA-VSMCs 中NF-κB p65 和 FGF2 mRNA 表達水平

細胞分組見“1. 11”。收集空白組、模型組、瑞舒伐他汀組和不同劑量消斑通脈方組 HA-VSMCs，棄上清，加入TRIzol 提取細胞RNA，檢測提取的RNA 樣本濃度和純度。RNA 樣本65 ℃變性5 min，結(jié)束后立即放于冰上冷卻。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑ReverTra AceqPCR RT Kit （FSQ-101） 說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作。試劑取出冰上融化，反應體系：在PCR 管中加入2×ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix 10 μL、Primer 1/2 各0. 4 μL 和模板cDNA 50 ng， 無菌無酶水補至20 μL （需在冰上操作）。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。NF- κB p65 引物序列： 上游5'-ATGTGGAGATCATTGAGCAG-3'， 下游5'-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3'； FGF2 引物序列： 上游5'-TCCACCTATAATTGGTCAAAGTGGT-3'， 下游5'-CATCAGTTACCAGCTCCCCC-3'； GAPDH引物序列： 上游5'-TCAAGATCATCAGCAATGCC-3'， 下游5'-CGATACCAAAGTTGTCATGGA-3'。使用PCR 儀默認溶解曲線采集程序。反應結(jié)束后，導出所有數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達水平。

1. 13 Western blotting法檢測各組HA-VSMCs中NF-κB p65和FGF2蛋白表達水平

將HA-VSMCs以每孔3×104 個細胞的密度接種到6 孔細胞培養(yǎng)板， 細胞生長至融合度80% 后進行分組， 分組方法見“1. 11”。加藥培養(yǎng)24 h 后，采用蛋白裂解液裂解細胞并提取細胞核蛋白， BCA 法測定蛋白濃度，計算樣品蛋白濃度，上樣后電泳提前準備合適大小的PVDF 膜，浸于甲醇中，電泳結(jié)束后，小心撬開玻璃板，根據(jù)需要切除周圍膠，將分離膠放置于經(jīng)電轉(zhuǎn)液浸泡后的濾紙上， 覆蓋之前剪好的PVDF 膜。連接正負極，打開電源，轉(zhuǎn)膜，用1×TBST 緩沖液將PVDF 膜清洗1 遍， 置于1× 麗春紅染液中染色 3～5 min。1×TBST 緩沖液中清洗3 次，加入一抗（稀釋比例均為1∶1 000）。4 ℃孵育過夜，PVDF 膜轉(zhuǎn)移至相應的二抗（稀釋比例均為1∶2 000） 抗體孵育盒中，室溫孵育2 h。洗膜，ECL 顯色， 使用凝膠成像系統(tǒng)設置， 拍照并分析結(jié)果， 計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 14 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞增殖活性及細胞培養(yǎng)上清液中 MCP-1、IL-6 和 IL-8 水平， 各組細胞中NF-κB p65 和FGF2 mRNA 及蛋白表達水平，進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，均符合正態(tài)分布，以-x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 消斑通脈方活性成分和靶基因

經(jīng)查閱文獻，聯(lián)合TCMSP、BATMAN-TAM 和Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫共篩選出丹參有效成分59 種，對應靶點基因927 個；三七有效成分7 個，對應靶點基因237 個；西洋參有效成分9 個，對應靶點基因76 個；瓜蔞皮有效成分6 個，對應靶點基因50 個；水蛭有效成分22 個，對應靶點基因282 個；何首烏有效成分3 個，對應靶點基因30 個；天麻有效成分5 個，對應靶點基因36 個。將成分分別命名，如某種有效成分來源于丹參， 命為“DS1”“DS2”“DS3” 等以此類推， 某些有效成分屬于西洋參，則命名為“XYS1”“XYS2”“XYS3”等；若某種成分在2 種以上中藥里均被發(fā)現(xiàn)，即為藥物的共有成分，分別命名為A、B、C 和D。本研究中部分重要成分和對應靶點信息見表1。

2. 2 消斑通脈方抗AS的靶點基因

通過GeneCards和OMIM 數(shù)據(jù)庫收集“atherosclerosis”和“cerebralatherosclerosis”相關基因分別為1 318 個和215 個，去除重復值后得到AS 相關基因，將各中藥靶點信息與其取交集，獲得消斑通脈方抗AS 的靶點基因共有189 個。見圖1 和表2。

2. 3 中藥-有效成分-作用靶點網(wǎng)絡圖

將Network和Type 數(shù)據(jù)文件導入Cytoscape 3. 8. 2 軟件，制作網(wǎng)絡圖（圖2），右下方水綠色四邊形方陣為交叉靶點，正方形上標注的是中藥名，其他彩色圓形圖標代表各中藥所含的有效成分，其中黃色圓形圖標A、B、C 和D 為中藥間共有成分，圖標越大代表Degree 值越高，成為重要作用成分和靶點的可能性也越大。

2. 4 Hub基因網(wǎng)絡圖

將交集基因?qū)?STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡圖（圖3），將相互作用證據(jù)可信度設置為“中可信度?0. 400”，下載tsv 文件導入Cytoscape 軟件進一步分析。Hub 基因是由插件CytoHubba 計算出來的核心網(wǎng)絡圖，其中顏色越深成為關鍵基因的可能性越大。見圖4。

2. 5 GO 功能富集分析和 KEGG 信號通路富集分析

應用 DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫對 189個重要作用靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析。

GO 功能富集分析：靶點基因參與的生物過程（biological process， BP） 前10 位包括調(diào)節(jié)炎癥反應、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細胞對脂多糖老化的反應、血液循環(huán)、對缺氧的反應、細胞增殖負調(diào)控和正向調(diào)節(jié)細胞遷移等； 細胞成分（cellular component， CC）前10 位涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)質(zhì)膜蛋白復合物、胞質(zhì)核周區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細胞外基質(zhì)、線粒體組成部分和肌纖維膜等； 分子功能（molecular function， MF）前10 位包括信號受體結(jié)合活性、蛋白激酶激活、氧化還原酶的活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、核受體活性、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白綁定和泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。見圖5。

KEGG 信號通路富集分析結(jié)果：作用靶點參與的較為重要的30 條信號通路包括晚期糖基化終產(chǎn)物- 晚期糖基化終產(chǎn)物受體（advanced glycationendproducts-receptor of advanced glycationendproducts，AGE-RAGE） 信號通路、脂質(zhì)與AS、流體剪切應力與AS、癌癥中的通路、白細胞介素17（interleukin-17， IL-17） 信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號通路、 輔助性 T 淋巴細胞 17（T helper cell 17，Th17） 分化、丙型肝炎、C 型凝集素受體信號通路、化學致癌作用-活性氧、胰島素抵抗、缺氧誘導因子1 （hypoxia-inducible factor-1，HIF-1） 信號通路、松弛素信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路、Toll 樣受體信號通路、T 淋巴細胞受體信號通路、表皮生長因子受體（epidermal growthfactor receptor，EGFR） 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growthfactor， VEGF） 信號通路、趨化因子信號通路、細胞凋亡、輔助性T 淋巴細胞1 （T helper cell 1，Th1） 和輔助性T 淋巴細胞2 （T helper cell 2，Th2） 分化、叉頭框蛋白 O （fork-head box O，F(xiàn)OXO） 信號通路、NOD 樣受體信號通路、NF-κB信號通路、血小板激活、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR） 信號通路、Janus激酶（Janus kinase，JAK） /信號傳導和激活轉(zhuǎn)錄因子（signal transducer andactivator of transcription，STAT） 信號通路、血管平滑肌細胞收縮、鈣信號通路和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號通路等。見圖6。

2. 6 HA-VSMCs 的鑒定結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察：細胞狀態(tài)良好，呈貼壁生長，多數(shù)細胞呈長梭形， 個別呈多角形、扇形或不規(guī)則三角形， 核居中，胞漿豐富，細胞密度高時可見其平行排列成束狀， 偶有部分細胞重疊， 與血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs） 的形態(tài)特征相吻合（圖7）。激光共聚焦顯微鏡下觀察： 細胞核呈藍色熒光，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)大量綠色熒光，為細胞質(zhì)內(nèi)的纖維細絲即平滑肌肌動蛋白絲（α-smoothmuscle actin， α -SMA）。采用免疫熒光技術檢測HA-VSMCs 特異性標志蛋白α-SMA 的表達，進一步驗證實驗細胞為HA-VSMCs （圖8）。

2. 7 不同濃度 ox-LDL誘導后各組 HA-VSMCs增殖活性

與 空 白 組 比 較 ， 不 同 濃 度 ox-LDL 組HA-VSMCs 活性均升高（Plt;0. 01）。0. 012 5、0. 025 0、0. 050 0 和0. 100 0 mg·L-1 ox-LDL 組HA-VSMCs 活性隨濃度增加呈上升趨勢， 但0. 200 0 mg·L-1 ox-LDL 組較0. 100 0 mg·L-1組細胞活性有所降低， 故采用0. 100 0 mg·L-1 ox-LDL 進行后續(xù)實驗。見表3。

2. 8 油紅 O 染色法檢測結(jié)果

油紅 O 染色可見：0. 100 mg·L-1 ox-LDL 處理HA-VSMCs 24 h 后，細胞形態(tài)增大， 胞質(zhì)內(nèi)可見大量紅色脂滴，細胞核增大， 細胞呈泡沫樣改變， 表明ox-LDL 作用于HA-VSMCs 細胞可促進平滑肌源性泡沫細胞形成，模型建立成功。見圖9。

2. 9 各組 HA-VSMCs增殖活性

與空白組比較，0. 050、0. 100、0. 200 和0. 400 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 增殖活性降低（Plt;0. 05）， 而0. 025 和0. 800 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs增殖活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。見表4。

2. 10 不同劑量消斑通脈方作用后各組ox-LDL誘導的HA-VSMCs增殖活性

與空白組比較，模型組HA-VSMCs 增殖活性升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，瑞舒伐他汀組及0. 025、0. 050 和0. 100 mg·L-1消斑通脈方組 HA-VSMCs 增殖活性降低（Plt;0. 01）， 0. 200、0. 400 和0. 800 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 增殖活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）； 與瑞舒伐他汀組比較， 0. 100 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 增殖活性降低（Plt;0. 01），0. 200 、 0. 400 和 0. 800 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 增殖活性升高（Plt;0. 01）。見表5。因此選用0. 025、0. 050 和0. 100 mg·L-1 消斑通脈方進行后續(xù)實驗。

2. 11 各組HA-VSMCs培養(yǎng)上清中MCP-1、IL-6和IL-8水平

與空白組比較，模型組 HA-VSMCs培養(yǎng)上清中MCP-1、IL-6和IL-8水平均升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01）； 與模型組比較， 瑞舒伐他汀組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中MCP-1 和IL-6 水平降低（Plt;0. 01或Plt;0. 05），0. 025、0. 050和0. 100 mg·L-1消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中MCP-1 和IL-6 水平明顯降低（Plt;0. 01），0. 025 mg·L-1消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中IL-8 水平無明顯變化（Pgt;0. 05），0. 050 和0. 100 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中IL-8 水平明顯降低（Plt;0. 01）；與瑞舒伐他汀組比較，不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中MCP-1 水平均明顯降低（Plt;0. 01），0. 050 和0. 100 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 培養(yǎng)上清中IL-8 水平明顯降低（Plt;0. 01）。見表6。

2. 12 各 組 HA-VSMCs 中 NF- κB p65 和 FGF2mRNA 表 達 水 平

與 空 白 組 比 較 ， 模 型 組HA-VSMCs 中NF-κB p65 和FGF2 mRNA 表達水平升高（Plt;0. 01）； 與模型組比較， 瑞舒伐他汀組和不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs 中NF- κBp65 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 01），瑞舒伐他汀組及0. 050 和0. 100 mg·L-1消斑通脈方組HA-VSMCs中FGF2 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 01）； 與瑞舒伐他汀組比較， 0. 050 和0. 100 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs 中NF-κB p65 和FGF2 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 01）。見表7。

2. 13 各組 HA-VSMCs 中 NF- κB p65 和 FGF2 蛋白表達水平

與空白組比較，模型組 HA-VSMCs中NF-κB p65 和FGF2 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，瑞舒伐他汀組和不同劑量消斑通脈方組HA-VSMCs 中NF-κB p65 和FGF2 蛋白表達水平均降低（Plt;0. 01）；與瑞舒伐他汀組比較，0. 050 和0. 100 mg·L-1 消斑通脈方組HA-VSMCs中NF- κB p65 表達水平明顯降低（Plt;0. 01），0. 100 mg·L-1消斑通脈方組HA-VSMCs中FGF2 蛋白表達水平降低（Plt;0. 01）。見圖10 和表8。

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學［17］ 認為：AS 的發(fā)病原因多與炎癥反應、免疫應答、脂質(zhì)代謝異常和氧化應激反應等有關，其中炎癥機制是AS 發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。單核細胞分化為巨噬細胞，吞噬大量ox-LDL 后形成泡沫細胞參與早期斑塊生成， 造成AS 發(fā)生風險增加，同時引起免疫反應調(diào)控Toll 樣受體和JAK/STAT信號通路相關因子表達，促進Th 細胞分化，參與AS 進程［18-19］。抗AS 重要的機制包括調(diào)節(jié)炎癥相關因子分泌、膽固醇的代謝、VSMCs 增殖和遷移及穩(wěn)定斑塊等。研究［20］ 表明：M1 型巨噬細胞可進一步激活NF-κB 和TNF-α 促炎信號，導致脂質(zhì)進一步堆積，增加已有斑塊的不穩(wěn)定性。細胞自噬功能障礙可促進細胞衰老和斑塊生成，進而影響內(nèi)皮VSMCs，造成血管鈣化， 使冠狀動脈疾病（coronary arterydisease， CAD） 發(fā)病率升高［21］。研究［22-23］ 顯示：VSMCs 的異常增殖在AS 早期會促進斑塊形成，而在AS 晚期， 斑塊中的VSMCs 可防止纖維帽破裂，穩(wěn)定斑塊。在AS 中，ox-LDL 在誘導VSMCs的增殖中起著至關重要的作用，泡沫細胞促進多種細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，引起慢性炎癥反應，使VSMCs 從靜止的收縮型轉(zhuǎn)化為合成型。合成型VSMCs 下調(diào)收縮蛋白的表達， 并促進生長因子、受體和細胞外基質(zhì)蛋白酶形成。血小板源性生長因子與其受體結(jié)合后， 影響下游多條信號通路， 在VSMCs 增殖中發(fā)揮核心作用［24］。此外，成纖維細胞生長因子（fibrolast growth factors，F(xiàn)GFs）、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF） 和胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）-1可促進VSMCs 的增殖。研究［25］ 顯示：與較FGF1比較，F(xiàn)GF2 在血管發(fā)育和病理變化中發(fā)揮更重要的作用， 抑制VSMCs 增殖是預防和治療AS 的重要策略。

消斑通脈方所含的隱丹參酮、毛地黃黃酮、人參皂苷、槲皮素、白藜蘆醇、谷甾醇和丹參酮ⅡA等成分可能是抗AS 的有效活性成分，具有較強的研究價值。本研究結(jié)果顯示：消斑通脈方作用于華AS 的關鍵靶點包括IL-6、IL-8、IL-1β、VEGFA、NFKB1、RELA、MAPK1、AKT1、TNF 和環(huán)氧合酶2 （prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2） 等；GO 功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析顯示：消斑通脈方抗AS 主要涉及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和流體剪切力、HIF-1 途徑參與心臟代謝和血管生成，可有效改善心肌細胞的缺氧狀態(tài)，細胞外脂質(zhì)堆積和VSMCs 增殖遷移區(qū)域多存在HIF-1α高表達，其上下游調(diào)節(jié)因子IL-6、VEGF 和一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase， NOS） 等激活進而加重AS。本方也可作用于內(nèi)皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會消耗Ca2+，參與AS 的形成。抗炎作用是治療 AS 的關鍵， 潛在作用靶點 MAPK1、IL-1β、TNF、SRC 和NFKB1 等在MAPK 信號通路、炎癥介質(zhì)對瞬時感受器離子通道蛋白（transient receptor potential， TRP） 通道的調(diào)節(jié)和NF-κB 信號通路中發(fā)揮作用，緩解炎癥反應，同時激發(fā)免疫應答， 促進Th2 細胞分化［26］； EGFR 表達降低可使IL-1 和TNF-α 分泌減少，對AS 發(fā)展有抑制作用［27］；NOD 樣受體信號通路也是本方較為重要的一條作用途徑，與細胞自噬有密切關聯(lián)，選擇性自噬可調(diào)控HA-VSMCs 的增殖和鈣化，負向調(diào)節(jié)NOD1/2 有對抗AS 的作用， 并可聯(lián)合Th17細胞和JAK/STAT 信號通路中相關因子以減輕炎癥， 該通路中靶基因NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3 （NOD-like receptor pyrin domaincontaining 3， NLRP3） 也是有待驗證的潛在靶點［28］。研究［29］ 表明：阻斷PI3K/Akt/mTOR 通路可抑制VSMCs 的增殖，mTOR 參與調(diào)節(jié)膽固醇的外排和脂質(zhì)沉積。消斑通脈方可調(diào)控mTOR 信號通路相關因子或可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥和激活自噬等進而發(fā)揮抗AS 作用。

FGF2 是一種具有廣泛生物學作用的多效生長因子，能調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、分裂和分化過程。在AS 中， FGF2 由平滑肌細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞分泌，可促進平滑肌細胞的增殖和內(nèi)皮細胞的游走。李文倩等［30］ 研究表明：FGF2 與ox-LDL 誘導VSMCs 的增殖呈正相關關系，應用FGF2 抑制劑或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將FGF2 抑制或沉默后， VSMCs增殖率降低，JNK 磷酸化水平明顯降低，表明抑制FGF2/JNK 信號通路能抑制ox-LDL 誘導的VSMCs 異常增殖。梁文靜等［31］ 研究表明： 敲除FGF2 在AS 疾病進展的各個時期均可明顯抑制氧化應激反應、巨噬細胞浸潤和促炎因子分泌，進而促進AS 斑塊穩(wěn)定和減輕斑塊損傷面積。LEE 等［32］研究發(fā)現(xiàn)：在角膜內(nèi)皮細胞中，NF-κB 能與FGF2基因的啟動區(qū)域結(jié)合， 表明NF-κB 是FGF-2 基因的轉(zhuǎn)錄因子。朱瑩［33］ 在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)：FGF 通路與非經(jīng)典NF-κB 信號通路具有交互作用。本研究結(jié)果顯示： ox-LDL 能上調(diào)HA-VSMCs 中FGF2 mRNA 和蛋白表達水平，而消斑通脈方以劑量依賴性方式抑制ox-LDL 誘導HA-VSMCs 細胞中FGF2 mRNA 和蛋白表達進而發(fā)揮抗AS 作用。在AS 中，NF-κB 和FGF2 是否為信號傳導通路的上下游因子目前尚未見報道，有待進一步研究。

綜上所述，本文作者應用網(wǎng)絡藥理學研究方法將臨床驗方消斑通脈方中所含的活性成分、抗AS的靶點信息和作用通路進行了系統(tǒng)分析，且通過體外實驗驗證消斑通脈方可能通過抑制NF-κB/FGF2通路發(fā)揮抗炎作用，抑制HA-VSMCs 過度增殖以發(fā)揮抗AS 作用，為消斑通脈方的進一步研究提供了理論依據(jù)，也為傳承名老中醫(yī)藥專家學術思想和在臨床推廣經(jīng)驗方起到積極作用。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

曹珊參與實驗設計、統(tǒng)計學分析和論文審校，張藝嘉和白楊參與實驗研究、數(shù)據(jù)采集和論文撰寫，陳芳、謝莎和韓倩倩參與實驗研究和論文修改。

[參考文獻]

［1］ GROOTAERT M O J， BENNETT M R. Vascularsmooth muscle cells in atherosclerosis： time for areassessment［J］. Cardiovasc Res， 2021， 117（11）：2326-2339.

［2］ GUIJARRO C， COSíN-SALES J. LDL cholesterol andatherosclerosis： the evidence ［J］. Clin InvestigArterioscler， 2021， 33（Suppl 1）： 25-32.

［3］ KATTOOR A J， POTHINENI N V K， PALAGIRI D，et al. Oxidative stress in atherosclerosis ［J］. CurrAtheroscler Rep， 2017， 19（11）： 42.

［4］ DEROISSART J， PORSCH F， KOLLER T， et al.Anti-inflammatory and immunomodulatory therapies inatherosclerosis［J］. Handb Exp Pharmacol， 2022， 270：359-404.

［5］ 龐樹朝， 張軍平， 陳美玲， 等. 中醫(yī)藥治療動脈粥樣硬化新進展［J］. 中華中醫(yī)藥雜志， 2017， 32（1）： 214-217.

［6］ 中國醫(yī)師協(xié)會中西醫(yī)結(jié)合分會心血管專業(yè)委員會， 中中醫(yī)藥學會心血管病分會. 動脈粥樣硬化中西醫(yī)防治專家共識（2021年）［J］. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2022，42（3）： 287-293.

［7］ 張藝嘉， 樊 珂， 崔小數(shù)， 等. 中醫(yī)藥治療動脈粥樣硬化臨床研究進展［J］. 中醫(yī)學報， 2020， 35（9）： 1908-1912.

［8］ 吳晶魁， 楊 喬， 李洋洋， 等. 水蛭通過p38MAPK信號通路對早期動脈粥樣硬化大鼠VSMCs的影響［J］. 中國中藥雜志， 2017， 42（16）： 3191-3197.

［9］ 王 群， 楊關林， 賈連群， 等. 基于網(wǎng)絡藥理學探討何首烏治療動脈粥樣硬化作用機制［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學學報， 2019， 21（9）： 136-139.

［10］鄭云霞， 孟 萌. 中藥丹參治療冠心病的藥理成分及作用分析［J］. 雙足與保健， 2018， 27（17）： 190-191.

［11］任超，王萍，閆東明，等.三七總皂苷對AS小鼠的治療作用［J］.中國藥理學通報，2018，34（9）：1289-1295.

［12］甄慶強， 張 潔， 雷 震， 等. 瓜蔞皮提取物對同型半胱氨酸誘導動脈粥樣硬化的保護作用［J］. 東南大學學報（醫(yī)學版）， 2018， 37（2）： 239-243.

［13］于進.天麻酚性成分抗AS的實驗研究［D］.昆明：云南中醫(yī)藥大學，2019.

［14］荊文光， 符 江， 劉玉梅， 等. 水蛭的化學成分［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2014， 20（19）： 120-123.

［15］李國強， 李韻儀， 李 桃， 等. 水蛭的化學成分研究［J］.天津中醫(yī)藥， 2018， 35（9）： 703-705.

［16］許石鐘. 水蛭經(jīng)炮制后的化學成分變化研究［J］. 陜西中醫(yī)， 2018， 39（7）： 980-982.

［17］朱 迪， 曹燁民. 動脈粥樣硬化抗炎治療的研究進展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志， 2023， 33（5）： 50-55.

［18］WOLF D， LEY K. Immunity and inflammation inatherosclerosis［J］. Circ Res， 2019， 124（2）： 315-327.

［19］B?CK M， YURDAGUL A Jr， TABAS I， et al.Inflammation and its resolution in atherosclerosis：mediators and therapeutic opportunities［J］. Nat RevCardiol， 2019， 16（7）： 389-406.

［20］李思瑞， 馮澤清， 吳玉章. C1632通過MAPK 和NF- κB抑制巨噬細胞M1型極化［J］. 免疫學雜志， 2022， 38（3）：185-192.

［21］ZHOU X， XU S N， YUAN S T， et al. Multiplefunctions of autophagy in vascular calcification［J］. CellBiosci， 2021， 11（1）： 159.

［22］BENNETT M R， SINHA S， OWENS G K. Vascularsmooth muscle cells in atherosclerosis［J］. Circ Res，2016， 118（4）： 692-702.

［23］MARCOVECCHIO P M， THOMAS G D，MIKULSKI Z， et al. Scavenger receptor CD36 directsnonclassical monocyte patrolling along the endotheliumduring early atherogenesis［J］. Arterioscler Thromb VascBiol， 2017， 37（11）： 2043-2052.

［24］DONG X Z， HU H J， FANG Z D， et al. CTRP6inhibits PDGF-BB-induced vascular smooth muscle cellproliferation and migration ［J］. BiomedecinePharmacother， 2018， 103： 844-850.

［25］NEWBY A C， GEORGE S J. Proposed roles forgrowth factors in mediating smooth muscle proliferationin vascular pathologies［J］. Cardiovasc Res， 1993， 27（7）：1173-1183.

［26］ZHANG S G， ZHANG S H， LIANG X， et al.Guanxinping ameliorates atherosclerosis via MAPK/NF-κB signaling pathway in ApoE-/- mice［J］. Perfusion，2023， 38（3）： 557-566.

［27］ZEBOUDJ L， GIRAUD A， GUYONNET L， et al.Selective EGFR （epidermal growth factor receptor）deletion in myeloid cells limits atherosclerosis-briefreport［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2018， 38（1）：114-119.

［28］VLACIL A K， SCHUETT J， RUPPERT V， et al.Deficiency of Nucleotide-binding oligomerization domaincontainingproteins （NOD） 1 and 2 reducesatherosclerosis［J］. Basic Res Cardiol， 2020， 115（4）： 47.

［29］HANG M， LI F， WANG X， et al. MiR-145 alleviatesHcy-induced VSMCs proliferation， migration， andphenotypic switch through repression of the PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Histochem Cell Biol ，2020，153：357-366.

［30］李文倩. 齊墩果酸經(jīng)FGF2/JNK/PON2通路抑制ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖［D］. 青島： 青島大學，2018.

［31］梁文靜. 糖尿病及血管新生因子對動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的影響及作用機制［D］. 濟南： 山東大學， 2018.

［32］LEE J G， KAY E P. NF- κB is the transcription factorfor FGF-2 that causes endothelial mesenchymaltransformation in cornea［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，2012， 53（3）： 1530-1538.

［33］朱 瑩. FGF/FGFR3與非經(jīng)典NF-κB信號通路的交互作用及其在多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖中的意義［D］.重慶： 第三軍醫(yī)大學， 2013.

[基金項目] 河南省科技廳科技攻關項目（232102310434）；河南省科技廳面上科學基金項目（242300421295）；河南省衛(wèi)健委中醫(yī)藥科學研究重大專項項目（2022ZYZD20）；河南省衛(wèi)健委中醫(yī)藥科學研究重點項目（2023ZY1031）；崔應民全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設項目（國中醫(yī)藥人教函［2022］ 75 號）