人骨髓間充質干細胞通過YAP 影響人脂肪肉瘤SW872 細胞的生物學行為

［摘 要］ 目的：觀察人骨髓間充質干細胞 （hMSCs） 條件培養基 （CM） 與人脂肪肉瘤SW872細胞共培養后對腫瘤細胞增殖和遷移能力的影響，探討hMSCs CM 對脂肪肉瘤細胞的作用及可能的作用機制。方法：體外培養 hMSCs，采用慢病毒方法分別轉染慢病毒空載體 shNS （對照組） 和慢病毒shRNA Yes 相關蛋白（YAP）（shYAP-hMSCs 組）， 采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法檢測各組hMSCs 中YAP mRNA 和蛋白表達水平，提取CM。體外培養SW872 細胞，分為對照組（正常培養）、hMSCs CM 組和shYAP-hMSCs CM 組。采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性， 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率， 細胞劃痕實驗檢測各組細胞劃痕愈合率， Westernblotting 法檢測各組細胞中YAP、基質金屬蛋白酶9 （MMP-9） 和細胞周期蛋白D1 （cyclin D1） 蛋白表達水平。結果：與對照組比較，shYAP-hMSCs組hMSCs中YAP mRNA和蛋白表達水平降低（Plt;0. 01），表明成功構建了shYAP-hMSCs 穩定轉染細胞株。CCK-8 法，與對照組比較，hMSCs CM 組SW872 細胞增殖活性升高（Plt;0. 05），shYAP- hMSCs CM 組SW872 細胞增殖活性降低（Plt;0. 01）；流式細胞術，與對照組比較，hMSCs CM 組SW872 細胞凋亡率無明顯變化（Pgt;0. 05），shYAP-hMSCsCM 組SW872 細胞凋亡率升高（Plt;0. 01）；細胞劃痕實驗，與對照組比較，hMSCs CM 組SW872 細胞劃痕愈合率升高（Plt;0. 05）， shYAP-hMSCs CM 組SW872 細胞劃痕愈合率降低（Plt;0. 01）；Western blotting 法，與對照組比較，hMSCs CM 組SW872 細胞中YAP、MMP-9 和cyclin D1 蛋白表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05），shYAP-hMSCs 組SW872 細胞中YAP、MMP-9 和cyclin D1 蛋白表達水平降低 （Plt;0. 05或 Plt;0. 01）。結論：hMSCs參與調控人脂肪肉瘤 SW872細胞增殖和遷移，其機制可能與YAP 表達有關。

［關鍵詞］ 骨髓間充質干細胞； 條件培養基； 脂肪肉瘤； 細胞增殖； 細胞遷移； Yes 相關蛋白

［中圖分類號］ R73-3 ［文獻標志碼］ A

脂肪肉瘤是一種起源于原始間葉細胞的惡性腫瘤，是成年人中最常見的軟組織肉瘤之一，約占所有肉瘤發病率的20%。脂肪肉瘤手術難以完整切除且復發率較高，放療易導致周圍臟器損傷，化療藥物可用于腫瘤轉移或晚期患者，但其生存率無明顯改善，5 年生存率為12%～70% ［1］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs） 在各種生長因子和細胞因子等的誘導刺激下，募集到腫瘤發生部位，能夠促進或抑制腫瘤細胞的增殖、轉移、上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 和耐藥等［2］。研究［3-4］ 顯示：包括脂肪肉瘤在內的部分腫瘤組織中轉錄共激活因子Yes 相關蛋白（Yes-associated protein， YAP） 異常表達和激活， YAP 是腫瘤發生的重要調控因子， 也是促癌基因。盡管MSCs 與腫瘤細胞的增殖和遷移有著密切關聯，但其在脂肪肉瘤中的作用和機制尚未見報道。研究［5］ 顯示： 腫瘤微環境主要構成細胞類型之一的MSCs 和作為細胞傳導生物化學、力學信號的關鍵分子之一的YAP 基因在脂肪肉瘤生長和遷移中可能發揮相應作用。本研究通過人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stemcells， hMSCs） 條件培養基（conditioned medium，CM） 與脂肪肉瘤SW872 細胞共培養， 在敲低hMSCs 的YAP 表達后，觀察其對腫瘤細胞增殖和遷移的作用，探討其可能的分子機制，為研究hMSCs在脂肪肉瘤發生發展過程中的作用提供新的理論依據。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器

hMSCs （HUXMA-01001） 和OriCell? 細胞基礎培養基（BLDM-03011）（廣州賽業生物科技有限公司），人脂肪肉瘤SW872 細胞和專用細胞培養基DMEM （武漢普諾賽生命科技有限公司）。胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）（美國Gibco 公司），pLVX-shRNA2-Puro 質粒（武漢維諾賽生物技術有限公司），RNAsimple 總RNA 提取試劑盒（DP419） 和SuperRealPreMix Plus （SYBR Green） FP205-02 （北京天根生化科技有限公司）， Revert Aid First StrandcDNA Synthesis Kit （K1622） （ 美國ThermoFisher Scientific 公 司）， YAP 抗 體 （武 漢Proteintech 生物技術有限公司），基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9， MMP-9）、 細胞周期蛋白D1 （cyclin D1） 和GAPDH 抗體（美國SantaCruz Biotechnology 公司），細胞裂解液、蛋白酶抑制劑和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA） 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）。H1850R臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），ABI 實時熒光定量PCR 儀（H） 7500 型（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）， BeckmanCoulter CytoFLEX 流式細胞分析儀（ 美國Beckman Coulter 公司）， CKX53 倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）， Nikon Eclipse 80i 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），CelMate? CLM-170B-8-NF 二氧化碳培養箱（新加坡Esco Lifesciences 公司）， MR-96A 酶標儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份公司），VE 586 轉移電泳槽（廣州譽維生物科技儀器有限公司），Tanon 5200 化學發光儀、EPS-200 電泳儀和VE180C 電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1. 2 細胞培養、分組和轉染

hMSCs和 SW872細胞分別用含10%FBS、1% 青霉素- 鏈霉素的OriCell? 細胞基礎培養基和DMEM 培養基， 置于37 ℃ 、5% CO2 細胞培養箱中常規培養和傳代，hMSCs 傳代至第3 代用于實驗。hMSCs 分為對照組（轉染慢病毒空載體shNS） 和shYAP-hMSCs組（轉染慢病毒shRNA YAP）。取對數生長期的hMSCs 以每孔5×104 個細胞的密度接種于24 孔細胞培養板中， 待細胞生長至 70%～80% 融合時，加入慢病毒質粒pLVX-shRNA2-Puro-hYAP，按說明書進行轉染。培養24 h 后，收集上清液，0. 22 μm過濾后作為CM 保存于-80℃冰箱凍存備用。SW872細胞分為對照組（正常培養）、 hMSCs CM 組（SW872 與hMSCs CM 共培養） 和shYAP-hMSCsCM 組（SW872 與shYAP-hMSCs CM 共培養）。

1. 3 實 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組 hMSCs中 YAP mRNA 表 達 水 平

收 集 各 組 hMSCs，TRIzol 法提取各組細胞總RNA，根據逆轉錄試劑盒和RT-qPCR 試劑盒說明書進行mRNA 定量分析。引物序列：YAP，上游引物5'- TGACCCTCGTTTTGCCATGA-3'， 下游引物5'-GCCTCTCCTTCTCCATCTGC-3'； GAPDH， 上 游 引 物5'-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTC-3'， 下游引物5'-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3'。采用TRIzol 法提取細胞RNA，制備反轉錄反應混合液，進行反轉錄反應，生成cDNA 模板，準備RT-qPCR反應混合液，進行RT-qPCR 檢測，在PCR 儀中設置以下反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃ 退火20 s， 72 ℃ 延伸30 s， 循環40 次。完成PCR 循環后， 進行終止反應： 95℃終末延伸10 s，4 ℃ 保持。采用2? ΔΔCt 法計算各組hMSCs 中YAP mRNA 表達水平。

1. 4 CCK-8法檢測各組SW872細胞增殖活性

細胞分組和處理方法見“1. 2”。將SW872 細胞懸液100 μL 以每孔約5×103 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，置于37 ℃、5% CO2 培養箱中，分別培養24、48 和72 h 后取出培養板， 向培養孔分別加入10 μL CCK-8 溶液，置于細胞培養箱中繼續孵育2 h，孵育結束后采用酶標儀測定450 nm 波長處各孔吸光度（A） 值，以A 值表示各組細胞增殖活性。每組5 個復孔，每組實驗重復3 次。

1. 5 流式細胞術檢測各組SW872細胞凋亡率

細胞分組和處理方法見“1. 2”。SW872 細胞培養處理后取出培養板，收集上清及各組細胞，使用冷的PBS 緩沖液洗細胞2 次，再用1×Binding Buffer 緩沖液制成密度為1×106 mL?1 的細胞懸液。在5 mL培養管中加入100 μL 細胞懸液， 加入純化的Annexin Ⅴ輕輕混勻，室溫反應15 min。加入5 μL 的Annexin Ⅴ-FITC 或（和） PI， 輕輕混勻， 室溫避光處孵育15 min。各試驗管中分別加入400 μL 1×Binding Buffer 緩沖液， 24 和48 h 時采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。每組實驗重復3 次。細胞凋亡率＝早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。

1. 6 細胞劃痕實驗檢測各組SW872細胞劃痕愈合率

細胞分組和處理方法見“1. 2”。將4×105個細胞接種于6 孔細胞培養板中，分別進行相應處理。當細胞生長達到100% 融合時，使用200 μL 移液器尖端在細胞上刮3 條平行線，然后用無血清培養基洗滌細胞3 次，并繼續孵育在常規培養基中。在0、24 和48 h 分別觀察傷口愈合情況。每個時間點每孔隨機拍攝3 張圖像，顯微鏡拍照監測細胞遷移修復過程，并測量每張圖像中3 個隨機位置劃痕（傷口寬度） 兩側的距離，計算劃痕愈合率，代表細胞遷移能力。每組實驗重復3 次。細胞劃痕愈合率=（0 h 劃痕面積－24 或48 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1. 7 Western blotting法檢測各組 hMSCs中 YAP蛋白表達水平及 SW872 細胞中 YAP、MMP-9 和cyclin D1蛋白表達水平

各組細胞經過相應處理培養48 h 后， 使用1×RIPA 裂解緩沖液加入完整的蛋白酶抑制劑混合片提取細胞的蛋白質裂解液。采用BCA 蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。變性的蛋白質經過凝膠電泳分離后，轉移至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶中封閉1 h，4 ℃條件下與相應的一抗YAP （1∶1 000）、MMP-9 （1∶1 000）、cyclin D （1∶ 1 000） 和GAPDH 抗體（1∶ 2 000）孵育過夜。 在一抗孵育后， 用 PBST （×1） 洗滌膜， 并加入二抗。 滴加新鮮配制的 ECL 混合溶液（A∶B=1∶1），暗室中曝光。根據不同的光強度調整曝光條件，顯影定影。將膠片進行掃描存檔，采用AlphaEaseFC 軟件處理系統分析目的蛋白條帶的灰度值，以GAPDH 為內參計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。每組實驗重復2 次。

1. 8 統計學分析

采用 GraphPad Prism 8. 0統計軟件進行統計學分析。 各 組 hMSCs 中 YAPmRNA 和蛋白表達水平，各組SW872 細胞增殖活性、凋亡率和劃痕愈合率， 各組SW872 細胞中YAP、MMP-9 和cyclin D1 蛋白表達水平均符合正態分布，以-x±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組 hMSCs中 YAP mRNA和蛋白表達水平

與對照組比較， shYAP-hMSCs 組hMSCs 中YAP mRNA 和蛋白表達水平均降低（Plt;0. 01）。見圖1。

2. 2 各組SW872細胞增殖活性

與對照組比較，24、48 和72 h 時hMSCs CM 組SW872 細胞增殖活性升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， 48 和72 h 時shYAP-hMSCs CM 組SW872 細胞增殖活性降低（Plt;0. 01）。見圖2。

2. 3 各組SW872細胞凋亡率

24 h時，與對照組（3. 32%±0. 37%） 比較，hMSCs CM 組SW872 細胞凋亡率（3. 42%±0. 52%） 差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， shYAP-hMSCs CM 組SW872 細胞凋亡率（5. 74%±0. 45%） 升高（Plt;0. 01）；48 h 時，與對照組（4. 38%±0. 22%） 比較， hMSCs CM組SW872 細胞凋亡率（4. 62%±0. 60%） 差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， shYAP-hMSCs CM 組SW872 細胞凋亡率（7. 87%±0. 65%） 升高（Plt;0. 01）。見圖3。

2. 4 各組 SW872細胞劃痕愈合率

4和 48 h時，與對照組比較， hMSCs CM 組SW872 細胞劃痕愈合率升高 （Plt;0. 05）， shYAP-hMSCs CM 組SW872 細胞劃痕愈合率降低（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）。見圖4 和5。

2. 5 各組SW872細胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表達水平

與對照組比較， hMSCs CM 組SW872 細胞中YAP、MMP-9 和cyclin D1 蛋白表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， shYAPhMSCsCM 組SW872 細胞中YAP、MMP-9 和cyclin D1 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖6。

3 討 論

本研究培養hMSCs，并建立敲低YAP 基因的hMSCs 穩定轉染細胞株，收集上清液作為CM，與脂肪肉瘤SW872 細胞共培養，結果顯示：hMSCsCM 能夠促進腫瘤細胞增殖和遷移， 敲低hMSCs中YAP 表達可明顯抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，并且升高腫瘤細胞凋亡率， 同時降低MMP-9 和cyclin D1 蛋白表達水平。

hMSCs 存在于多種組織中， 是腫瘤微環境中重要組成部分，在腫瘤細胞分泌各種生長因子和細胞因子等作用下，能夠轉換為腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs），進而促進腫瘤的發生發展，在癌癥研究中得到廣泛關注［6］。研究［7］ 顯示： hMSCs CM 與骨肉瘤細胞共培養，通過hMSCs 分泌的細胞因子白細胞介素6（interleukin-6， IL-6） 激活腫瘤細胞中信號轉導和轉錄激活因子3 （signal transducer and activator oftranscription 3， STAT3） 信號通路， 促進腫瘤細胞增殖和化療耐藥性。研究［8］ 顯示：hMSCs 可通過分泌IL-6 促進鼻咽癌細胞增殖和耐藥。hMSCs通過分泌血小板活化因子（platelet activatingfactor， PAF） 促進卵巢癌細胞增殖和遷移［9］。研究［10］ 顯示：在結直腸癌中，hMSCs CM 通過產生大量CC 趨化因子受體5 （C-C chemokine receptor 5，CCR5） 配體，促進腫瘤生長。另有研究［11］ 顯示：hMSCs CM 通過CXC 趨化因子受體7 （C-X-Cchemokine receptor 7，CXCR7） 信號通路促進乳腺癌細胞增殖。hMSCs CM 能夠通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路、EMT 和整合素（integrin） α5 的作用，促進肝細胞癌腫瘤細胞增殖和遷移［12］。除了細胞因子，hMSCs 分泌的細胞外囊泡， 包括外泌體也是影響腫瘤發生的重要因素［13-14］。hMSCs 可通過外泌體中的miR-193a-3p、miR-210-3p 和 miR-5100 激活STAT3 信號通路促進肺癌腫瘤細胞侵襲和遷移［15］。hMSCs 可通過外泌體中的miR-142-3p 促進結腸癌腫瘤干細胞增殖［16］。與以上研究報道一致，本研究結果顯示： hMSCs CM 能夠促進脂肪肉瘤SW872 細胞增殖和遷移， 其作用機制可能是hMSCs 分泌的各種細胞因子、生長因子以及囊泡和外泌體等通過YAP 信號通路發揮作用，其具體機制有待進一步研究。

cyclin D1 屬于高度保守的周期蛋白家族，受視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein， Rb）正向調控，與周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase， CDK） 4 或CDK6 形成復合物， 調節細胞G1/S 期轉換。cyclin D1 的突變、擴增和過表達，改變了細胞周期的進程， 進而可能導致腫瘤的發生［17］。作為下游的靶向基因， cyclin D1 的表達受到YAP 的正向調控［18］。已有研究［19-20］ 表明：cyclin D1 在脂肪肉瘤組織中異常表達， 而下調cyclin D1 能夠抑制腫瘤細胞生長。在乳腺癌、肺癌和胃癌等相關研究［21-23］ 中， 下調cyclin D1 表達能夠抑制腫瘤細胞。MMP-9 屬于金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs） 家族的一員，通過降解細胞外基質和血管新生在癌癥侵襲和轉移中發揮重要作用［24］。下調MMP-9 能夠減少結直腸癌、前列腺癌和肝癌等腫瘤細胞的轉移。本研究結果顯示： shYAP-hMSCs CM 能夠抑制脂肪肉瘤細胞的遷移能力，降低MMP-9 蛋白表達水平，與相關研究［25-27］ 報道結果相一致。

迄今為止，hMSCs 在脂肪肉瘤中作用的相關報道較少。 研究［28］顯示：在有致癌基因突變的hMSCs中， 表達融合肉瘤-C/EBP 同源蛋白（fused insarcoma-C/EBP homologous protein， FUSCHOP），促使hMSCs 轉化為脂肪肉瘤。在預先誘導有致癌基因突變的hMSCs 中，過表達鼠雙微體2癌基因（mouse double minute 2， MDM2） 和CDK4，hMSCs 能夠形成脂肪肉瘤樣改變，并且促進細胞增殖和遷移［29］。利用hMSCs 固有的向腫瘤發生部位遷移的特點，可作為載體攜帶單純皰疹病毒胸苷激酶治療脂肪肉瘤，抑制腫瘤細胞生長并減少復發和轉移［30］，表明hMSCs 和脂肪肉瘤之間存在著密切的聯系。本研究結果顯示： 與shYAPhMSCsCM 共培養，SW872 細胞中YAP 蛋白表達水平降低， 與hMSCs CM 共培養SW872 細胞中YAP 蛋白表達無明顯變化，并且與hMSCs CM 共培養SW872 細胞中cyclin D1 和MMP-9 蛋白表達水平及細胞凋亡率均無明顯變化，提示可能與腫瘤細胞的YAP 基因表達水平變化有關，其具體機制還有待進一步研究。

綜上所述， hMSCs CM 能夠促進脂肪肉瘤SW872 細胞的增殖和遷移，敲低hMSCs 中的YAP表達可抑制腫瘤細胞的生長和遷移。hMSCs 來源廣泛易于分離，在包括脂肪肉瘤在內的癌癥及其他疾病研究中值得進一步深入探索其作用機制和治療前景。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

陳華和胡海軍參與論文選題、研究設計、論文撰寫和論文審校，沙娜和劉寧參與實驗操作和論文審校，李陽參與數據收集和整理及統計學分析。

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[基金項目] 廣東省科技廳區域聯合基金重點項目（2020B1515120043）； 廣東省深圳市科技創新委員會科技計劃項目（JCYJ20190806152812751）