牛膝-續斷藥對抗骨質疏松作用及活性成分初探

【摘要】

目的：通過維甲酸建立骨質疏松小鼠模型，評價牛膝-續斷藥對的抗骨質疏松作用，探索其抗骨質疏松活性成分。方法：采用 HPLC法建立牛膝-續斷藥對提取物的指紋圖譜；使用“中藥色譜指紋圖譜相似度指紋評價系統（2004 A版）”對不同組別進行相似度評價。維甲酸誘導小鼠骨質疏松模型，計算肝腎指數與股骨干濕比，應用酶標法檢測不同提取物對維甲酸誘導骨質疏松模型小鼠血清ALP、ACP水平；應用Spss軟件進行牛膝-續斷提取物中各成分與模型小鼠股骨干濕比和血清中ALP和ACP酶含量的pearson相關性分析。結果：成功建立牛膝-續斷藥對提取物的HPLC指紋圖譜，標定9個共有峰。肝腎指數結果顯示模型組與給藥組無顯著差異，股骨干濕比結果顯示大部分治療組與模型組相比有顯著性差異。ELISA結果顯示，牛膝續斷藥對主要影響ACP水平。指紋峰與干濕比分析結果顯示，峰1可能為活性成分；與ACP相關性分析結果表明峰1、2、3、7可能為活性成分。結論：牛膝-續斷藥對提取物對骨質疏松有治療作用，其抗骨質疏松作用主要通過降低ACP水平實現，峰1可能為牛膝-續斷抗骨質疏松活性成分。

【關鍵詞】

骨質疏松；牛膝；續斷

【中圖分類號】R285.6

【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）16-0042-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.16.zgmzmjyyzz202416010

Preliminary Study on the Antiosteoporosis Effect and Active Ingredients of Achyranthes Bidentata-Dipsacus

GUAN DongxueNING ZhonghaiYUAN KaizhiLI XinyueSUN Yantao*

College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China

Abstract：

Objective To establish an osteoporosis mouse model with retinoic acid， evaluate the anti-osteoporosis effect of Achyranthes bidentata and dipsacus， and explore its anti-osteoporosis active components. Method HPLC was used to establish the fingerprint of the extract of Achyranthes bidentata and dipsacus. The similarity of different groups was evaluated using the “TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A）”. The serum ALP and ACP levels of different extracts of retinoic acid-induced osteoporosis mice were measured by enzyme-label method. The liver and kidney index and the dry-wet ratio of femur were calculated. spss software was used to analyze the pearson correlation between components of the extract and the dry-wet ratio of femur and the content of ALP and ACP enzymes in serum of model mice. Results HPLC fingerprint of the extract of Achyranthes bidentata and dipsacus was established successfully， and 9 common peaks were identified. The results of liver and kidney index showed no significant difference between the model group and the administration group， and the results of dry and wet ratio of femur showed that most of the treatment groups had significant differences compared with the model group. ELISA results showed that achyranthes had a major effect on ACP levels. Fingerprint peak and dry-wet ratio analysis showed that peak 1 May be the active ingredient. The correlation analysis with ACP indicated that peak 1，2，3，7 might be the active components. Conclusion The extract of Achyranthes bidentata and dipsacus has therapeutic effect on osteoporosis， and its anti-osteoporosis effect is mainly achieved by reducing the level of ACP. Peak 1 may be the active ingredient of Achyranthes bidentata and dipsacus.

Keywords：

Osteoporosis; Achyranthes Bidentata; Dipsacus

中醫理論認為“腎為先天之本”“腎生骨髓”“其充在骨”。骨的生長發育、強勁、衰弱與腎精盛衰關系密切，腎精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養而強健有力；腎精虧虛則骨髓生化無源，骨骼失養而萎弱無力。續斷與牛膝兩藥均入肝腎兩經，有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經之效。牛膝主降，引續斷與牛膝藥氣下行；續斷主升，與牛膝互補，調和藥性。牛膝藥性苦，具有堅陰作用，根據陰陽互根互用原則，對于腎陽的補充大有裨益；牛膝性苦，續斷性辛，陰陽調和。兩者在歷來典籍中的結合頗多，效果上佳，是治療骨質疏松的兩樣良藥［1］。《魏氏家藏方》中使用牛膝、續斷制成續斷散，治療老人風冷、轉筋骨痛；堅骨方中取用牛膝10 g，川續斷15 g，輔以熟地、當歸等藥材治療老年骨質疏松，補腎益精，堅骨壯精；《證治準繩》中的續斷丹，牛膝、續斷與萆薢、杜仲同用，用于治療肝腎不足、腰膝酸痛。二者功效相輔相成，彼此增益，在骨質疏松的治療上具有良效。

目前關于續斷-牛膝藥對的研究多為脊柱炎、關節炎等方面，鮮少有骨質疏松方面的報道［2］。李園園［3］通過數據挖掘得出胡蔭奇教授對強直性脊柱炎常用用藥組合含有續斷、牛膝，為其處方核心組成成分。馮興華治療強直性脊柱炎的前5位藥物為丹參、牛膝、赤芍、續斷以及當歸。趙寶寶等［4］發現單味中藥及提取物與中藥復方可以通過調控SCFAs 影響骨代謝，從而起到防治骨質疏松癥的作用。馬偉鳳等［5］在實驗中發現人參皂苷Rg3能夠提高骨質疏松老年大鼠骨密度，改善骨微結構，作用機制可能是通過調節AMPK/mTOR信號通路促進自噬發揮骨保護作用。可見牛膝-續斷具有良好的抗骨質疏松作用。為確定牛膝-續斷抗骨質疏松作用，并篩選其中活性成分，本研究采用HPLC確定10批不同來源牛膝-續斷藥對的指紋共有峰，采用維甲酸誘導骨質疏松模型，分析給藥組的股骨干濕比，肝、腎指數，ALP（小鼠堿性磷酸酶）和ACP（小鼠酸性磷酸酶）等免疫指標，通過色譜峰面積與藥效指標相關性分析，探討藥對的抗骨質疏松活性成分。

1儀器與材料

1.1儀器島津高效液相色譜儀（配置二元梯度泵，在線脫氣機，SPD-10AVP紫外檢測器）；Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；25 μL微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）；循環水式抽濾機（配有抽濾瓶，布氏漏斗，鄭州長城科工貿有限公司）；萬分之一天平（瑞士METTLER）；微量移液器（上海榮泰生化工程電熱恒溫有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試藥甲醇、乙腈（天津市凱信化學工業有限公司，天津市，色譜純）；維甲酸（北京貝麗萊斯生物化學有限公司，純度>96%）ALP，ACP（上海酶聯生物科技有限公司，批號：m1002235）。阿侖膦酸鈉（云南萬裕藥業有限公司，批號：1704004）

牛膝、續斷經藥學院鑒定教研室鑒定分別為莧科植物牛膝Achyranthes bidentateB1的干燥根和川續斷科植物川續斷Dipsacus asper Wall.exHenry的干燥根，隨機分為10組。具體來源見表1。

1.3實驗動物SPF級KM小鼠，體重（20±5） g，試驗單位使用許可證編號：SYXK（遼）2013-0009， 實驗動物倫理許可證號：SCXK（遼）2015-0001，均為雄鼠。

2方法與結果

2.1牛膝續斷提取物指紋圖譜測定

2.1.1供試品溶液制備取牛膝，續斷粉末各11 g，精密稱定，回流6 h，過濾后將提取液濃縮至35 mL，精密吸取5 mL，揮干溶劑，加甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，收集續濾液，備用。剩余30 mL溶液作為給藥組溶液，備用。取阿侖膦酸鈉腸溶片，精密稱定，加蒸餾水，配置為0.3 g/mL的溶液。取維甲酸，精密G7KGwmSOCJdXehfb83Tw4Q==稱定，加蒸餾水，配置為0.02 g/mL的溶液。

2.1.2色譜條件及系統適應性條件Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動相：乙腈為A相，水為B相，總流速1.0 mL·min-1；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL，梯度洗脫時間程序見表2。

2.1.3方法學考察分別安排精密度、重復性、穩定性實驗，其結果均符合指紋圖譜測定要求。

2.1.4樣品測定按照“2.1.2”項下的色譜條件進樣測定，并記錄各批次樣品色譜數據。將10批牛膝-續斷藥對提物HPLC圖譜數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系（2004A版）”，設定參照圖譜，將譜峰自動匹配，生成疊加圖譜如圖1，見表3。

2.2牛膝續斷藥對抗骨質疏松作用研究

2.2.1小鼠骨質疏松模型復制及分組給藥KM小鼠，隨機分為13組，每組10只。分別為空白對照組、模型組、陽性藥（阿侖膦酸鈉腸溶片）組和實驗組。使用維甲酸構建骨質疏松模型，灌胃量0.2 mL/只，空白對照組灌等量安慰劑（生理鹽水），為期14 d。造模同時，對實驗組小鼠灌入牛膝續斷提取物，灌胃量0.2 mL/只；陽性藥組灌入等量阿侖膦酸鈉腸溶片溶液；對照空白組灌等量安慰劑（生理鹽水）。為期14 d。

2.2.2實驗結果末次給藥12 h后，對本實驗13組小鼠稱量體重后采血，稱取肝，腎及右后股骨濕重。將股骨烘干后稱取干重，進行計算得肝、腎指數（肝、腎指數即為肝、腎重量與小鼠體重之比）和骨干濕比（股骨干濕比即為股骨干重與濕重之比），按ELISA試劑盒操作流程測定小鼠血清樣本中ALP及ACP的含量，結果見表4。結果表明，肝、腎指數無顯著差異。與空白組相比，模型組股骨干濕比明顯降低。與模型組相比，陽性組及大部分治療組股骨干濕比明顯升高。小鼠血清樣本中ALP的含量無顯著變化。與空白組相比，模型組ACP含量顯著升高，與模型組相比，陽性組及各治療組ACP含量顯著下降。

2.3牛膝續斷藥對各成分與藥效關系雙變量相關分析可以描述兩變量間線性關系的密切程度、相關性大小及方向。相關系數的大小反映兩變量相關性的大小，正負表明方向。采用SPSS 19.0中雙變量相關分析方法， 計算各樣品共有峰的相對峰面積與ACP，ALP及骨干濕比的相關系數，詳情見表5。結果表明，組分給藥后體內色譜峰與藥效相關性較大。

3討論

骨質疏松是老年患者常見的疾病，隨著我國老齡化趨勢的不斷上漲，骨質疏松的發病率也逐年增加［6-7］。因此，如何預防以及治療此類疾病成為現代研究的首要問題。有文獻報道牛膝［8］和續斷［9］具有治療骨質疏松的功效，本研究基于維甲酸建立骨質疏松小鼠模型，探究了牛膝-續斷配伍藥對的抗骨質疏松作用。

堿性磷酸酶（ALP）作為骨代謝和骨形成的標志物，其指標可評價骨轉換與成骨細胞QuTtvUNsbJpS+vOwXidNig==分化程度，主要存在于成骨細胞胞漿中，與成骨細胞的成熟及分化呈正相關，是調節骨形成的重要物質。酸性磷酸酶（ACP）由破骨細胞分泌，存在于重吸收小囊泡中。ACP作為反映骨吸收的指標，對骨吸收有促進作用，具有潛在調節破骨細胞與骨結合的功能。可見ALP值愈高，ACP值愈小，越能體現出對骨質疏松的治療效果。牛膝-續斷藥對治療骨質疏松模型小鼠股骨干濕比結果顯示，模型組與空白組有顯著性差異，說明本實驗模型建立成功。結果表明，各組提取物對股骨干濕比和ACP均具有顯著的影響。由此得出，牛膝-續斷藥對具有良好抗骨質疏松作用，可能通過降低破骨作用來治療骨質疏松。

通過建立指紋圖譜，體現了牛膝續斷藥對的成分，提高了活性成分篩選的準確性。通過分析藥對中相關化學成分與股骨干濕比，ACP相關性的結果可知，藥對提取物中相關化學成分與股骨干濕比和ACP呈現良好相關性。特別是峰1與股骨干濕比呈良好相關性，且其與ACP呈明顯負相關，說明其含量越高，ACP結果越小，抗骨質疏松作用越好，值得對其進行進一步深入研究。藥對提取物對骨質疏松有治療作用，對肝腎影響較小，其直接作用于骨，對骨吸收影響較大，可明顯降低ACP水平，從而達到治療小鼠骨質疏松的作用。

參考文獻

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（收稿日期：2024-11-20編輯：陶希睿）