短期血清饑餓脅迫對豬骨骼肌衛星細胞代謝及自噬發生的影響

摘 要： 旨在研究短期饑餓脅迫對豬骨骼肌衛星細胞（skeletal muscle satellite cells，SMSCs）代謝及自噬發生的影響，解析自噬機制在骨骼肌發育調控網絡中的地位和作用，為改良家豬產肉性狀提供理論依據。將本實驗室分離并保存的SMSCs細胞系復蘇，按培養體系中血清濃度將細胞分為20%血清組（對照組）、15%血清組、10%血清組、5%血清組和0%血清組，以形成不同程度的饑餓脅迫。當細胞融合度達到70%～80%后再培養24 h進行檢測，每組4個重復。流式細胞術檢測各組細胞凋亡率、膜電位和活性氧水平；試劑盒測定ATP水平；WB檢測自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ、p62和通路相關蛋白AMPK、mTOR的表達；透射電鏡檢測細胞線粒體形態和細胞器的變化。結果顯示，隨著細胞中血清濃度降低，細胞活力、p62蛋白量、p-mTOR/mTOR比值逐漸降低；細胞凋亡率、ROS水平、ATP水平、LC3B-Ⅱ蛋白水平、p-AMPK/AMPK比值、細胞內自噬溶酶體數量、細胞核及線粒體異常率則逐漸升高；與對照組相比，15%組膜電位顯著升高，5%和0%組極顯著降低。這表明，短期血清饑餓脅迫能誘導基于AMPK/mTOR 信號通路的自噬發生，加快細胞代謝，但同時存在加快細胞凋亡、抑制細胞增殖等毒副作用。

關鍵詞： 豬；自噬；SMSCs；血清饑餓脅迫；AMPK/mTOR通路

中圖分類號：S828.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3408-10

收稿日期：2024-01-16

基金項目：江蘇省自然科學基金項目（BK20201224）；國家自然科學基金（31872323）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（PAPD2018）

作者簡介：王 怡（1979-），女，江蘇揚州人，博士，講師，主要從事動物模型與疾病研究，E-mail： 307014000@qq.com

通信作者：鞠輝明，近年來主要從事豬肌肉生長發育機制研究， E-mail： hmju@yzu.edu.cn

Effect of Transient Serum Starvation on Metabolism and Autophagy of Porcine Skeletal

Muscle Satellite Cells

WANG Yi1，2， GAO Juan2， HU" Yuemin2， YANG Yuefei2， FAN Bojun2， JU Huiming1，2*

（1.College of GuangLing， Yangzhou University， Yangzhou 225000，" China;

2.Jiangsu Co-innovation

Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonosis， College of

Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" This study aimed to investigate the effects and mechanisms of transient starvation on the metabolism and autophagy of porcine skeletal muscle satellite cells （SMSCs）， to analyze the role of autophagy in skeletal muscle development， and to help design strategies for improving meat production traits in domestic pigs. Resuscitate the SMSCs cell lines isolated and preserved in the laboratory， and divide the cells into 5 groups based on the serum concentration： 20% serum group （control group）， 15% serum group， 10% serum group， 5% serum group， and 0% serum group， to form varying degrees of hunger stress. When the cells fuse to 70%-80%， culture for more 24 hours for detection， with 4 replicates in each group. Cell apoptosis， membrane potential， reactive oxygen species（ROS） levels were detected by flow cytometry; ATP levels were measured using a reagent kit， and the expression of autophagy marker proteins（LC3B-Ⅱ， p62） and pathway-related proteins（AMPK， mTOR） was detected by WB; transmission electron microscopy was used to detect changes in mitochondrial morphology and organelles in cells. The cell viability， level of p62 protein， and the p-mTOR/mTOR ratio decreased with the decrease of serum concentration; apoptosis rate， level of ROS， level of ATP， the level of LC3B-Ⅱ protein， the p-AMPK/AMPK ratio， the number of autophagy lysosomes and the abnormal rate of nucleus and mitochondria increased; Compared with the 20% serum concentration group， the 15% group showed a significant increase in membrane potential， while the 5% and 0% groups showed a highly significant decrease. This indicates that short-term serum starvation can induce autophagy induced by the AMPK/mTOR signaling pathway and accelerate cell metabolism， but at the cost of some toxic effects such as accelerating cell apoptosis and inhibiting cell proliferation.

Key words： porcine; autophagy; SMSCs; serum starvation; AMPK/mTOR pathway

*Corresponding author：JU Huiming，" E-mail： hmju@yzu.edu.cn

骨骼肌生長發育和產肉性狀形成的分子機制一直是動物豬遺傳育種領域關注的重點，雖然近年來取得了一些重要進展和突破，但尚有許多未知的調控因子和調控機制待闡明［1-2］。SMSCs分布于肌細胞基底膜與肌膜之間，最早由Mauro［3］于1961年發現，是成年個體肌肉組織內留存的未分化的、處于靜止狀態的肌前體細胞。當肌肉生長受到損傷或發生肌肉退化疾病引起的應激時，SMSCs可以通過肌源性分化形成肌纖維從而對肌肉發育、維持和再生產生重要作用，甚至可直接決定豬骨骼肌的生長發育和產肉性狀［4-6］。

細胞自噬是高度保守的過程，通過形成自噬體，將蛋白質等生物大分子或線粒體等細胞器回收至溶酶體，最終將其降解為氨基酸、單糖等小分子，從而實現能量物質的循環再利用［7］。細胞在體外生長代謝所需能量支撐、生長因子、維生素等多種營養物質可通過一定濃度血清滿足［8-9］。已有研究表明，饑餓或內外部應激條件可誘導SMSCs發生非選擇性自噬［10］，嚴重血清饑餓誘發的自噬能導致人和小鼠肌纖維空泡化、肝臟損傷等嚴重癥狀［11-12］。近年來，因自噬在骨骼肌代謝穩態和疾病進展中的作用而引起極大關注［13］。目前雖有證據表明骨骼肌在饑餓等狀態下自噬通量會增加［13-15］，而肌肉恢復過程亦與SMSCs自噬密切相關［13-14］，但自噬影響肌肉再生和修復的具體途徑和精確機制仍有待系統研究。

近年來，隨著組學技術的發展，通過對SMSCs進行多組學分析，篩選出很多影響豬骨骼肌發育的microRNA［16-18］、microarray［19］、SAGE數據庫［20］、甲基化數據庫［21］以及lncRNA分析數據［22-23］等。本研究小組前期分離并建立了多個品種豬SMSCs細胞系［24］，通過全轉錄組測序發現多個細胞代謝及自噬信號通路相關基因的表達在不同品種豬間存在顯著差異，因此我們推測豬SMSCs可能通過自噬途徑影響出生后豬肌肉的生成和修復，這也可能是導致不同品種豬肌肉發育差異的因素之一。本研究擬以直接影響骨骼肌發育的SMSCs為研究對象，通過調整體外培養體系中的血清濃度，制備不同程度的饑餓脅迫，誘發不同程度自噬，研究細胞代謝、凋亡以及自噬標志蛋白和通路相關蛋白的表達情況，以探究影響豬骨骼肌發育的因素，為全面解讀豬骨骼肌發育的影響機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

巴馬豬骨骼肌衛星細胞系（SMSCs）由本實驗室分離并保存。DMEM高糖培養基、Trypsin-EDTA（0.25%）、FBS及其他細胞培養試劑購自Gibco公司；細胞凋亡檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自Beyotime公司；電子天平購自Germany公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與培養

按SMSCs培養體系中血清濃度將細胞分為5組：20%血清組（20% S）、15%血清組（15%S）、10%血清組（10% S）、5%血清組（5% S）和0%血清組（0% S），以20% S組為對照組。各組細胞于37℃，5% CO2環境中培養。當細胞融合度達到70%～80%時，于相應濃度血清再培養24h后進行檢測，每組4個重復。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞活力

SMSCs按每孔 2×104個接種于96孔板，換入無血清培養基100 μL與CCK-8檢測試劑10 μL，37 ℃避光孵育2 h，用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值 （A值），計算細胞增殖情況。細胞相對活力（%）=（A試驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況、線粒體膜電位和ROS水平

加入含EDTA的胰蛋白酶消化各組細胞，制備細胞懸液，部分細胞依次加入混合195 μL Annexin V-FITC、5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶的染色溶液，用細胞凋亡試劑盒借助流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率；部分細胞用線粒體膜電位試劑盒檢測各組細胞膜電位；部分細胞根據試劑盒操作說明檢測各組細胞中的線粒體ROS水平。

1.2.4 檢測細胞內ATP水平

加入含EDTA的胰蛋白酶消化各組細胞，制備細胞懸液，根據ATP檢測試劑盒（S0026，Beyotime，中國）的說明，每孔添加200 μL裂解液，4℃下以12 000 g離心5 min后棄上清，加入100 μL ATP檢測工作液3～5 min，利用化學發光儀器測定光單位（RLU）值，根據制備的標準曲線計算樣品中的ATP濃度。

1.2.5 WB檢測自噬相關蛋白的表達

提取各組細胞總蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜后，以Tublin（11224-1-AP，Proteintech，USA）為內參蛋白，測定自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ（ab229327，Abcam，USA）、p62（ab233207，Abcam，USA）和通路相關蛋白AMPK（66536-1-lg，Proteintech，USA）、Phospho-AMPK（p-AMPK，GTX03702，GeneTex）、mTOR（66888-1-lg，Proteintech，USA）及Phospho-mTOR（p-mTOR，67778-1-lg，Proteintech，USA）表達量。用Image J與Analysis軟件測定WB雜交條帶的灰度值。目標蛋白灰度值和相應內參條帶灰度值的比值為各目的條帶的相對表達量， 具體試驗方法同參考文獻［25］。

1.2.6 透射電鏡觀察細胞和細胞器的形態變化

收集各組細胞，換入電鏡固定液室溫固定2 h，低速離心、梯度脫水、包埋、切片、染色制片后，用透射電子顯微鏡觀察細胞形態結構、線粒體結構數量以及自噬小體，采集圖像分析。

1.3 數據分析

以SPSS 17.0統計軟件對試驗數據進行分析，數據均用“x-±SD”表示，應用GraphPadPrism7軟件對數據進行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 CCK-8法檢測細胞活力

結果如圖1所示，20%S、15%S、10%S、5%S、0%S組細胞活力分別為（100±3.9）%、（88.1±2.0）%、（72.1±4.5）%、（60.78±5.6）%和（24.95±4.7）%。以20%S組為對照組，其余4組細胞活力逐漸降低，其中10%S、5%S、0%S組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。結果表明，短期血清饑餓脅迫導致SMSCs培養體系中營養及能量供應不足，對SMSCs產生一定損害作用，且損害程度隨饑餓程度增加而增加，各組細胞生長增殖活力逐漸降低。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

結果如圖2所示，20%S、15%S、10%S、5%S、0%S組細胞凋亡率分別為（4.55±0.08）%、（4.71±0.10）%、（5.42±0.20）%、（5.73±0.20）%、（6.84±0.42）%，隨血清濃度降低逐漸升高。輕度血清饑餓組（15%S組）凋亡率和對照組差異不顯著，10%S 、5%S、0%S組均顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果表明，血清饑餓脅迫導致細胞凋亡率上升，上升程度與血清饑餓脅迫程度成正相關。低于對照組的血清濃度都會對細胞代謝產生不利影響。

2.3 流式細胞術檢測線粒體ROS水平

結果如圖3所示，20%S、15%S、10%S、5%S、0%S組ROS水平分別為（43.81±0.63）%、（54.20±0.56）%、（60.83±0.59）%、（77.91±0.05）%、（88.37±0.48）%。以20%S組為對照組，其余4組ROS水平均極顯著升高（P＜0.01），且呈現隨血清濃度降低而逐漸升高的趨勢。結果表明，隨著血清饑餓脅迫程度加重，細胞氧化應激逐漸增加，ROS水平顯著升高，對細胞產生損害，觸發細胞凋亡。

2.4 流式細胞術檢測線粒體膜電位水平

結果如圖4所示，20%S、15%S、10%S、5%S、0%S組線粒體膜電位分別為3.39±0.18、3.93±0.20、2.91±0.31、2.64±0.17、1.80±0.15。以20%S組為對照組，除15%S組膜電位出現顯著升高外（P＜0.05），其余各組均低于對照組且呈逐漸降低的趨勢，5%S、0%S組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。結果表明，輕度血清饑餓組（15%S）線粒體膜電位水平升高，提示細胞內代謝節律增加、能量產生增加；其他試驗組膜電位水平降低，可能與ROS大量產生有關，也是細胞凋亡的早期特征，說明線粒體功能被抑制，細胞代謝受到影響。

2.5 細胞內ATP水平

結果如圖5所示，20% S、15% S、10% S、5%S、0%S組細胞內ATP水平分別為（18.11±0.07）、（20.79±0.99）、（21.36±0.18）、（23.50±0.45）、（27.09±0.72） nmol·L-1。以20%S組為對照組，其余4組ROS水平均顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈隨血清濃度降低而逐漸升高的趨勢。結果表明，隨著饑餓脅迫程度的增加，細胞內營養和能量缺乏加重，線粒體中脂肪酸氧化產生的ATP代償性增加。

2.6 WB檢測自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、p62的表達

結果如圖6所示，20% S、15% S、10% S、5%S、0%S組細胞內LC3B-Ⅱ蛋白的相對表達量分別為0.05±0.01、0.13±0.02、0.23±0.01、0.32±0.02和1.52±0.02，隨血清濃度降低而逐漸升高；p62蛋白的相對表達量則呈相反趨勢，分別為1.27±0.03、1.00±0.01、0.44±0.02、0.42±0.02、0.39±0.01，隨血清濃度降低而逐漸降低。以20%S組為對照，其余4組LC3B-Ⅱ的相對表達量均極顯著升高，p62蛋白相對表達量均極顯著降低（P＜0.01）。結果表明，隨著饑餓脅迫程度增加，細胞自噬程度逐漸加強。

2.7 WB檢測AMPK/mTOR 信號通路相關蛋白的表達

結果如圖7所示，20% S、15% S、10% S、5%S、0%S組p-mTOR與mTOR的蛋白灰度值比值分別為1.61±0.04、1.42±0.07、1.37±0.02、1.05±0.06、0.93±0.05；p-AMPK與AMPK的蛋白灰度值比值分別為0.52±0.03、0.93±0.08、1.25±0.05、1.77±0.07、2.64±0.05。與20%S組相比，AMPK-mTOR信號通路的關鍵信號分子p-mTOR/mTOR比值隨血清濃度的降低而降低（P＜0.05或P＜0.01），而p-AMPK/AMPK比值隨血清濃度的降低而極顯著升高（P＜0.01）。結果提示血清饑餓脅迫可能通過AMPK/mTOR 信號通路調控細胞產生自噬。

2.8 透射電鏡觀察細胞和細胞器的形態變化

結果如圖8所示，與20%S組相比，15%S組細胞內自噬小體（紅色箭頭所示）數量顯著增加，但線粒體形狀及結構差異不明顯；10%S組細胞中多個線粒體腫脹（黑色三角標示正常線粒體，白色三角標示異常線粒體）、嵴模糊，自噬小體數量進一步增多，細胞核呈異型；5%S組大部分線粒體腫脹、嵴模糊消失，粗面內質網中度擴張，核糖體脫顆粒，自噬小體進一步增加，細胞核異型；0%S組細胞質內有大量自噬小體，細胞核膜異型、部分核膜溶解。結果表明，血清饑餓脅迫可誘導SMSCs內線粒體異常、自噬小體形成，且線粒體異常程度和自噬小體數量隨著血清濃度的降低而增加。

3 討 論

正常情況下，骨骼肌自噬水平較低，但某些外部因素刺激，如藥物、饑餓、能量剝奪、缺氧等能誘導其發生［13-15］。本試驗以直接影響豬骨骼肌發育的SMSCs為研究對象，控制培養體系中的血清濃度形成不同程度的饑餓脅迫，繼而誘發不同程度自噬，通過其對SMSCs的影響初步評估饑餓脅迫如何作用于肌肉發育。細胞代謝是細胞生長、繁殖、保持結構而對外界環境做出的反應，通過測定細胞凋亡率、膜電位、活性氧及ATP水平可較好的評估外部因素對細胞代謝的影響［26-28］。本研究發現，隨培養體系中血清濃度的降低，細胞活力和膜電位降低、細胞凋亡率、ROS和ATP水平逐漸升高。ROS水平升高、線粒體膜電位降低為線粒體功能障礙的表現，說明短期血清饑餓脅迫促使細胞加速代謝和凋亡，損害細胞，尤其在血清饑餓脅迫程度較重時（10%S、5%S、0%S）損傷更大。透射電鏡檢測結果和上述一致，血清饑餓脅迫程度較重組的線粒體出現形變、線粒體脊消失更明顯。一般情況下，ATP水平升高是有益的，代表細胞代謝旺盛，能更快的提供能量和營養物質［28］。而本研究結果提示，當能量和營養物質極度缺乏時（如0%S組），ATP水平的升高可理解為一種警示信號，提示細胞生存環境的嚴峻，與之相對應的是高凋亡率、高ROS水平和低膜電位水平等。和對照組相比，饑餓脅迫程度較輕組（15%S）膜電位升高，細胞凋亡率變化不顯著，ATP水平升高，線粒體形態和內部結構基本正常，說明輕度血清饑餓脅迫促進細胞能量轉換，提升線粒體功能，該結果和我們本研究發現的輕度自噬能提高SMSCs分化能力的結果基本一致［29］。

自噬是具有細胞保護作用的胞內降解機制，參與生物體發育、代謝、凋亡等多個過程，自噬標志蛋白LC3B與p62間的相互作用通常被用來鑒定細胞內的自噬水平［30-32］。LC3B是一種膜相關蛋白，包括兩種可相互轉化的形式——LC3B-I和LC3B-II，自噬越強則LC3B-Ⅱ含量越高［33-34］。p62通常存在于蛋白質聚集體中，p62水平升高常標志著自噬活性受到抑制［33，35］。本研究發現，隨SMSCs培養體系中血清濃度降低，p62蛋白表達降低，同時LC3B-Ⅱ含量逐漸升高；透射電鏡檢測結果也顯示隨饑餓脅迫程度增加，細胞中自噬溶酶體數量逐步增加，進一步表明了SMSCs培養體系中血清饑餓脅迫可以誘導細胞自噬的發生。AMPK與mTOR是細胞感知營養物質狀態最重要的兩大蛋白，作為自噬過程中的重要調控途徑，由饑餓引起的營養物質缺乏會導致AMPK磷酸化，進而激活自噬級聯反應［36-37］；而豐富的生長因子、葡萄糖和氨基酸等營養物質會激活mTOR通過磷酸化抑制自噬［37-38］，研究中常用p-mTOR/mTOR值和p-AMPK/AMPK值反映自噬水平［39-40］。本研究發現，血清饑餓明顯上調 AMPK 的磷酸化水平，同時抑制 mTOR 的磷酸化水平，說明血清饑餓可能通過調控AMPK/mTOR信號通路激活自噬發生，調控SMSCs自噬水平。

4 結 論

目前雖有證據表明骨骼肌在饑餓等狀態下自噬通量會增加，而肌肉恢復過程亦與SMSCs自噬密切相關［13-15］，但自噬影響肌肉再生和修復的具體途徑和精確機制仍待系統研究。本研究發現，SMSCs體外培養過程中，短期血清饑餓脅迫能加快細胞代謝，但同時存在加快細胞凋亡、抑制細胞增殖等毒副作用；血清饑餓脅迫通過AMPK/mTOR 信號通路誘導細胞自噬發生，進而可影響豬骨胳肌發育調控。同時我們本課題組也在研究長期血清饑餓脅迫對SMSCs代謝及自噬發生的影響。本研究的開展有助于探究不同營養狀態下影響豬骨骼肌發育的因素，解讀豬骨骼肌發育的機制。

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（編輯 郭云雁）